Name: single cell durotaxis assay for assessing mechanical control of cellular movement and related signaling events
Uploaded: 2019-08-27T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events at JoVE.com

1. تصنيع هيدروجيلات بولياكريلاميد مشوهة مع ميكروسفيرس الفلورسنت جزءا لا يتجزأ
ملاحظة: تصف الاتجاهات البلمرة من هيدروجيل 25 كيلوباسكال الذي هو 22 ميكرومتر في القطر وحوالي 66 ميكرومتر سميكة. ويمكن تعديل كل من هذه المعلمات أو كلها ويمكن العثور على الاتجاهات للقيام بذلك ف...

<ol>
	<li>Acerbi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+breast+cancer+invasion+and+aggression+correlates+with+ECM+stiffening+and+immune+cell+infiltration.">Human breast cancer invasion and aggression correlates with ECM stiffening and immune cell infiltration.</a> Integrative Biology (Camb. 7 (10), 1120-1134 (2015).</li><li>Mekhdjian, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-mediated+traction+force+enhances+paxillin+molecular+associations+and+adhesion+dynamics+that+increase+the+invasiveness+of+tumor+cells+into+a+three-dimensional+extracellular+matrix.">Integrin-mediated traction force enhances paxillin molecular associations and adhesion dynamics that increase the invasiveness of tumor cells into a three-dimensional extracellular matrix.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (11), 1467-1488 (2017).</li><li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype.">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li><li>Lange, J. R., Fabry, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+tissue+mechanics+in+cell+migration.">Cell and tissue mechanics in cell migration.</a> Experimental Cell Research. 319 (16), 2418-2423 (2013).</li><li>Davidson, L. A., Oster, G. F., Keller, R. E., Koehl, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+mechanical+properties+of+the+blastula+wall+reveal+which+hypothesized+mechanisms+of+primary+invagination+are+physically+plausible+in+the+sea+urchin+Strongylocentrotus+purpuratus.">Measurements of mechanical properties of the blastula wall reveal which hypothesized mechanisms of primary invagination are physically plausible in the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus.</a> Developmental Biology. 209 (2), 221-238 (1999).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mechanical+factors+in+fate+decisions+of+stem+cells.">Role of mechanical factors in fate decisions of stem cells.</a> Regenerative Medicine. 6 (2), 229-240 (2011).</li><li>Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+stiffness+dictates+development,+homeostasis,+and+disease+progression.">Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression.</a> Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).</li><li>Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+movement+is+guided+by+the+rigidity+of+the+substrate.">Cell movement is guided by the rigidity of the substrate.</a> Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).</li><li>Kuo, C. H., Xian, J., Brenton, J. D., Franze, K., Sivaniah, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+stiffness+gradient+substrates+for+studying+mechanotactic+cell+migration.">Complex stiffness gradient substrates for studying mechanotactic cell migration.</a> Advanced Materials. 24 (45), 6059-6064 (2012).</li><li>Breckenridge, M. T., Desai, R. A., Yang, M. T., Fu, J., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrates+with+engineered+step+changes+in+rigidity+induce+traction+force+polarity+and+durotaxis.">Substrates with engineered step changes in rigidity induce traction force polarity and durotaxis.</a> Cell and Molecular Bioengineering. 7 (1), 26-34 (2014).</li><li>Goreczny, G. J., Wormer, D. B., Turner, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+System+for+Evaluating+Cell+Mechanosensing+and+Durotaxis+In+Vitro.">A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e52949 (2015).</li><li>Hartman, C. D., Isenberg, B. C., Chua, S. G., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+cell+durotaxis+depends+on+extracellular+matrix+composition.">Vascular smooth muscle cell durotaxis depends on extracellular matrix composition.</a> Proceedings of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 113 (40), 11190-11195 (2016).</li><li>Vincent, L. G., Choi, Y. S., Alonso-Latorre, B., del Alamo, J. C., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+durotaxis+depends+on+substrate+stiffness+gradient+strength.">Mesenchymal stem cell durotaxis depends on substrate stiffness gradient strength.</a> Biotechnology Journal. 8 (4), 472-484 (2013).</li><li>Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+hydrogels+with+steep+stiffness+gradients+for+studying+cell+mechanical+response.">Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response.</a> PLoS One. 7 (10), e46107 (2012).</li><li>Martinez, J. S., Lehaf, A. M., Schlenoff, J. B., Keller, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+durotaxis+on+polyelectrolyte+multilayers+with+photogenerated+gradients+of+modulus.">Cell durotaxis on polyelectrolyte multilayers with photogenerated gradients of modulus.</a> Biomacromolecules. 14 (5), 1311-1320 (2013).</li><li>Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+fluctuations+within+focal+adhesions+mediate+ECM-rigidity+sensing+to+guide+directed+cell+migration.">Force fluctuations within focal adhesions mediate ECM-rigidity sensing to guide directed cell migration.</a> Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).</li><li>McKenzie, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+microenvironment+regulates+ovarian+cancer+cell+morphology,+migration,+and+spheroid+disaggregation.">The mechanical microenvironment regulates ovarian cancer cell morphology, migration, and spheroid disaggregation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7228 (2018).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Grashoff, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mechanical+tension+across+vinculin+reveals+regulation+of+focal+adhesion+dynamics.">Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics.</a> Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).</li><li>McKenzie, A. J., Campbell, S. L., Howe, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+A+activity+and+anchoring+are+required+for+ovarian+cancer+cell+migration+and+invasion.">Protein kinase A activity and anchoring are required for ovarian cancer cell migration and invasion.</a> PLoS One. 6 (10), e26552 (2011).</li><li>Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyacrylamide+hydrogels+for+cell+mechanics:+steps+toward+optimization+and+alternative+uses.">Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses.</a> Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).</li><li>Plotnikov, S. V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+traction+force+microscopy.">High-resolution traction force microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 123, 367-394 (2014).</li><li>Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+localizing+reporter+fluorescent+beads+near+the+cell+culture+surface+for+traction+force+microscopy.">A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), 51873 (2014).</li></ol>

يظهر هنا هو تكرار، فحص durotaxis خلية واحدة التي تسمح بتقييم قدرة الخلية على تغيير سلوكها الهجرة استجابة للإشارات الميكانيكية الحادة. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه التقنية في تركيبة مع المجهرية الفلورية والبروتينات الانصهار المناسبة أو أجهزة الاستشعار الحيوية لفحص الإشارات دون الخلوية والأحداث ...

على مدى العقود القليلة الماضية، وقد حصلت أهمية الخصائص الميكانيكية لبيئة الخلية على اعتراف متزايد في بيولوجيا الخلايا. الأنسجة المختلفة والمصفوفات خارج الخلية لها تصلب نسبي مختلف، وكما تهاجر الخلايا في جميع أنحاءالجسم، فإنها تنقل هذه التغييرات، وذلك باستخدام هذه الخصائص الميكانيكية لتوجيهها 1،2،3 , 4 , 5 , 6 , 7.تستخدم الخلايا صلابة أنسجة معينة لإعلام سلوكها الميتيلي أثناء عمليات مثل التنمية، والتئام الجروح، وورم السرطان. ومع ذلك، فإن الآليات الجزيئية التي تسمح الإحساس والاستجابة لهذه المدخلات الميكانيكية لا تزال غير معروفة إلى حد كبير1،2،3،4،5، 6 , 7.
من أجل دراسة الآليات التي من خلالها الخلايا تستجيب للإشارات البيئية المادية، يجب التلاعب صلابة أو صلابة الركيزة الكامنة وراء الخلايا الملتصقة. في عام 2000، وضعت تشون مين لو، يو لي وانغ وزملاؤه اختبار8 حيث استجابة الخلية الفردية motile لتغيير العظة الميكانيكية يمكن اختبارها مباشرة عن طريق تمتد مصفوفة خارج الخلية مشوهة (ECM) المغلفة بولياكريلاميد هيدروجيلات التي كانت مطلية الخلايا. تظهر الخلايا تفضيلًا كبيرًا للهجرة نحو ركائز أكثر صلابة، وهي ظاهرة أطلقوا عليها اسم "durotaxis".
ومنذ التقرير الأصلي في عام 2000، استخدمت تقنيات أخرى كثيرة لدراسة الدوتاكسيات. وقد تم تصنيع التدرجات صلابة حاد من قبل صب المواد الهلامية على ميزات جامدة مثل حبات البوليسترين9 أو وظائف البوليمر قاسية10 أو عن طريق البلمرة الركيزة حول حواف الأغطية الزجاجية11 لخلق الميكانيكية ' خطوة الحدود". بدلا من ذلك، تم تصنيع هيدروجيلات مع التدرجات تصلب الضحلة ولكن ثابتة من قبل مجموعة متنوعة من الأساليب مثل التدرجات من كروسلينكر التي أنشأتها أجهزة microfluidic12،13 أو جنبا إلى جنب قطرات محلول هيدروجيل من صلابةمختلفة 8، أو هيدروجيلمع كروسلينكر رد الفعل الضوئي تعامل مع التعرض للأشعة فوق البنفسجية متدرجة لخلق التدرج صلابة خطي14،15. وقد استخدمت هذه التقنيات إلى تأثير كبير للتحقيق في الحركة الخلوية الجوروتيك بشكل جماعي مع مرور الوقت. ومع ذلك، عادة ما يتم تصنيع هذه الميزات مقدما من طلاء الخلايا وخصائصها لا تزال متسقة على مدى التجربة، والاعتماد على حركة الخلايا العشوائية لأخذ العينات من التدرجات الميكانيكية. لا يمكن لأي من هذه التقنيات مراقبة التغيرات السريعة في السلوك الخلوي استجابة للمحفزات الميكانيكية الحادة.
من أجل مراقبة الاستجابات الخلوية للتغيرات الحادة في البيئة الميكانيكية، والاختبارات durotaxis خلية واحدة تقدم العديد من المزايا. في هذه الاختبارات، يتم إعطاء الخلايا الفردية التحفيز الحاد والميكانيكي عن طريق سحب الركيزة الكامنة بعيدا عن الخلية مع micropipette الزجاج، وبالتالي إدخال التدرج الاتجاهي من التوتر مصفوفة الخلية. ثم يتم ملاحظة التغيرات في سلوك motile، مثل سرعة أو اتجاه الهجرة، بواسطة مجهرية تباين مرحلة الخلية الحية. وييسر هذا النهج المراقبة المباشرة للعلاقات السببية والفعالة بين المحفزات الميكانيكية وهجرة الخلايا، حيث أنه يسمح بالتلاعب السريع والمتكرر في اتجاه وحجم تدرج التوتر وتقييم ما يترتب عليه من ذلك الردود الخلوية في الوقت الحقيقي. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لتحفيز ميكانيكيا الخلايا التي تعبر عن البروتينات الانصهار الفلورسنت أو أجهزة الاستشعار الحيويلتصور التغيرات في كمية، نشاط، أو توطين تحت الخلية من البروتينات يشتبه في أن تشارك في المكننة و الدوروسات.
وقد استخدمت هذه التقنية من قبل المجموعات التي تدرس durotaxis8،16 ويوصف هنا كما تم تكييفها من قبل مختبر هاو لدراسة السلوك الجوروتيك من الخلايا السرطانية SKOV-3 والآليات الجزيئية التي تحت [دوروتاكسيس]17. بالإضافة إلى ذلك، يتم وصف طريقة معدلة لتصنيع هيدروجيلمع طبقة واحدة، حتى من ميكروسفيرز الفلورسنت بالقرب من سطح ثقافة الخلية. وهذا يسهل التصور والاستفادة المثلى من التدرجات سلالة micropipette ولدت ويمكن أن تسمح بتقييم انقباض الخلايا عن طريق الفحص المجهري قوة الجر.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylamide 40 %&#160;</td>
			<td>National Diagnostic</td>
			<td>EC-810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP179-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD20A High frequency generator</td>
			<td>Electro Technic Products</td>
			<td>12011A</td>
			<td>115 V -&#160;Handheld Corona Wand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bind Silane (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane) (</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-acrylamide 2%&#160;</td>
			<td>National Diagnostic</td>
			<td>EC-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 2510 Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Bransonic</td>
			<td></td>
			<td>40 kHz frequency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coarse Manipulator</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MC35A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM without phenol red</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Stage Glass Micropipette Puller</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco-aaper</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (Qualified One Shot)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A31606-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>FC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluospheres Carboxylate 0.2 um&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8810, F8807, F8811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene 6</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1815091</td>
			<td>1.5 ug DNA / 6uL fugene 6 per 35mm dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38SI-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Dish</td>
			<td>CellVis</td>
			<td>D60-60-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslip</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72224-01</td>
			<td>22 mm, #1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>9535-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III&#160;Special cleaning concentrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z805939</td>
			<td>Used at 2% in ddH2O for cleaning coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES powder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Make 50mM HEPES buffer, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intelli-Ray 400 Shuttered UV Flood Light</td>
			<td>Uviton International</td>
			<td>UV0338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A417-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MF900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MHW3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanopure Life Science UV/UF System</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>D11931</td>
			<td>ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Bemis Company, Inc</td>
			<td>PM-992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>139 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 28.6 mM Na2HPO4, 1.6 mM KH2PO4, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ref52</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rat embryonic fibroblast cell line; Culture in DMEM + 10% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringer&#39;s Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>134 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2.4 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 5 mM D-Glucose, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKOV-3</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td></td>
			<td>Culture in DMEM + 10% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH&#160;</td>
			<td>Covachem</td>
			<td>&#160;12414-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281-50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell durotaxis assay for assessing mechanical control of cellular movement and related signaling events

Durotaxis هي العملية التي الخلايا الشعور والاستجابة لدرجات التوتر. من أجل دراسة هذه العملية في المختبر ، يجب التلاعب بصلابة الركيزة الكامنة وراء الخلية. في حين أن المواد المائية مع صلابة متدرجة والاختبارات الهجرة على المدى الطويل أثبتت فائدتها في الدراسات durotaxis، والاستجابات الفورية والحادة للتغيرات المحلية في التوتر الركيزة تسمح دراسة مركزة لحركات الخلايا الفردية والأحداث الإشارات دون الخلوية. لاختبار تكرار قدرة الخلايا على الشعور والاستجابة لصلابة الركيزة الكامنة، يتم استخدام طريقة معدلة لتطبيق التدرجات الحادة من زيادة التوتر على الخلايا الفردية المستزرعة على هيدروجيلات مشوهة مما يسمح في الوقت الحقيقي التلاعب في قوة واتجاه تصلب التدرجات المنقولة على الخلايا المعنية. بالإضافة إلى ذلك، من خلال ضبط تفاصيل ومعلمات الفحص، مثل شكل وأبعاد micropipette أو الموقف النسبي، ووضع، واتجاه التدرج المطبق، يمكن تحسين الفحص لدراسة أي ميكانيكيا نوع الخلية الحساسة والنظام. ويمكن تغيير هذه المعلمات لتغيير موثوق الحوافز المطبقة وتوسيع وظيفة وبراعة الفحص. تسمح هذه الطريقة بفحص كل من الحركة الجوروتيكعلى المدى الطويل، فضلا عن تغييرات فورية أكثر في الإشارات الخلوية والديناميات المورفولوجية استجابة لتغير صلابة.

من خلال إعداد micropipettes (الشكل 1) وتطبيع توليد قوة السحب (الشكل2 والشكل 3) كما هو موضح أعلاه ، تم تحديد الظروف الجوروتيك الأمثل لخطوط الخلايا المتعددة. باستخدام هذه التقنية، كما هو مبين في الشكل4، كل من SKOV-3 خلايا سرطان المبيض<sup clas...

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events at JoVE.com

Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events

القوى الميكانيكية مهمة للسيطرة على هجرة الخلايا. يوضح هذا البروتوكول استخدام هيدروجيلات مرنة يمكن تشويهها باستخدام ميكرومازيت زجاجي وميكرومنبولاتور لتحفيز الخلايا ذات التدرج المحلي للتصلب لإحداث تغييرات في بنية الخلايا والهجرة.

فحص Durotaxis خلية واحدة لتقييم السيطرة الميكانيكية للحركة الخلوية والأحداث الإشارات ذات الصلة

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate ...

هناك تقدير متزايد لتأثير البيئة الدقيقة الميكانيكية على إشارات الخلايا والهجرة. مما يستلزم استخدام نهج تجريبية فريدة من نوعها لتقديم التحفيز الميكانيكي إلى الخلايا الفردية. هذه التقنية تسمح للتلاعب الديناميكي من البيئة الدقيقة الميكانيكية تحت خلية في الوقت الحقيقي.السماح بمراقبة التغيرات المنظمة ميكانيكياً في سلوك ترحيل الخلايا، وأحداث الإشارات شبه الخلوية. إظهار الإجراء معي ستكون نيلا نعيم، طبيبة ما بعد الطبيب وجوناثان باترسون، فني من مختبرنا. تبدأ باستخدام Chorono-1 لتنشيط السطح الزجاجي لكل زلة الغطاء السفلي لمدة 20 ثانية، قبل أن الإفراط فورا 50 microliters من ربط سيلان حل العمل على كل زلة الغطاء.السماح للمحلول لتجف لمدة 10 دقائق قبل شطف الغطاء زلات مرتين مع 95٪ الإيثانول ومرتين مع ايزبروبانول. ثم، السماح لزلات الغطاء لتجف الهواء لمدة 20 دقيقة تقريبا. لترسب الخرزة الفلورية الصغيرة، sonicate الأول من العمل الحل الخرزة الصغيرة لمدة ساعة واحدة.قبل 15 دقيقة من نهاية سونيكيشن، ضع الغطاء المنشط ينزلق عموديا في حامل زلة غطاء السيراميك ونقل حامل إلى نظافة البلازما الجدول الأعلى لعلاج البلازما غرفة الهواء لمدة ثلاث دقائق. المقبل، مكان قطعة من فيلم البارافين في 60 ملليلتر أغطية طبق بيتري، ووضع غطاء زلات على الأفلام، والنقر بخفة كل زلة غلاف لضمان اتصال جيد بين الفيلم و coverlip. ثم، إضافة 150 ميكرولترات من حل حبة العمل إلى الجزء العلوي من كل غطاء، وعلى الفور الطامح حل الإيثانول من جانب الأغطية، وترك الخرز على غطاء.لإلقاء الهيدروجيل مباشرة بعد إعدادها، إضافة 25 قطرات ميكرولتر من حل هيدروجيل إلى الجانب المنشط من كل غطاء أسفل، وعلى الفور الوجه أغلفة أعلى مطرز، حبة الجانب إلى أسفل، على قطرات. السماح للجل البلمرة لمدة 30 دقيقة قبل استخدام ملقط لإزالة بلطف الأغطية. ثم، شطف المواد الهلامية مع ثلاثة، خمس دقائق يغسل في الطازجة 50 miliMoler Hepes في الغسيل.لتنشيط السطوح Hydrogels، احتضان المواد الهلامية في 50 miliMoler Hepes الطازجة، تستكمل مع 0.4 miliMolar Sulfo Sanpah، ويعرض على الفور المواد الهلامية لمصباح قوس الأشعة فوق البنفسجية في منطقة مغلقة لمدة 90 ثانية. في نهاية التنشيط، وغسل المواد الهلامية مع ثلاثة، خمس دقائق يغسل في hepes الطازجة، وعلاج هيدروجيل المنشط مع 20 ميكروغرام لكل ملليلتر من الليفي لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة ، تعرق محلول الليفي الزائد ، وغسل المواد الهلامية ثلاث مرات في PBS لمدة خمس دقائق لكل غسل.بعد الغسيل الأخير، ضع الهيدروجيل في حجم صغير من برنامج تلفزيوني وتعقيم المواد الهلامية لمدة 15 دقيقة تحت الضوء فوق البنفسجي في غطاء لثقافة الأنسجة. ثم، غسل المواد الهلامية مرة واحدة في برنامج تلفزيوني جديد. بالنسبة لطلاء الخلايا، بذور 2.1 مرة 10 من الخلايا الأربعة من الفائدة في ثلاثة ملليلتر من المتوسطة لكل هيدروجيل والسماح للخلايا للتمسك في 37 درجة مئوية لمدة أربع إلى 18 ساعة.في حين أن الخلايا هي الإكويبت، واستخدام سحب ماصة صغيرة لسحب قطر ملليمتر واحد من قبل 100 ملليمتر طويلة البورسليكات الزجاج الصغير الماص، للحصول على مفتق أكثر من ملليمترين أن يقلل إلى ما يقرب من 50 ميكرومتر في القطر في المليمتر الأول، ويمتد إلى طويلة، موازية 10 ميكرومتر قطر أنبوب في المليمتر الأخير. بعد ذلك، تحميل ماصة في microforge وتشكيل ماصة أن يكون 15 ميكرومتر حادة تلميح التي يتم المرفقة في نهاية قسم 250 ميكرومتر، عازمة على ما يقرب من 35 درجة الملاك من بقية ماصة. يجب أن يكون القطر التقريبي عند الانحناء حوالي 30 ميكرومترًا لتقديم القوة إلى الطرف.بعد ذلك، ضع هيدروجيل على خشبة المجهر المقلوب. تغطية المتوسطة مع النفط المعدني واختيار الهدف 10x. تعقيم الماصات الدقيقة المعدة مع 70٪ الكحول.ثم، إدراج في حامل ماصة صغيرة مع هوك وأشار نحو الطبق، واستخدام المتلاعب بالطبع لخفض ماصة حتى هوك فقط تلامس سطح السائل. تركيز المجهر على الخلايا الملتزمة إلى الجزء العلوي من الجل، والحرص على أن الهدف هو في أي خطر من ضرب العينة أو المرحلة، وجلب التركيز فوق الجل للعثور على غيض من ماصة صغيرة. قم بتدوير الماصة حتى يتم تعامد الطرف على المستوى البؤري، بحيث يشير الطرف الحاد من الماصات الصغيرة إلى الأسفل، ثم يعيد التركيز على طرف الماصات عند الضرورة.التركيز مرة أخرى إلى طبقة الخلية لقياس مدى ما هو الماص من سطح هلام، والتركيز مرة أخرى تصل إلى الطائرة التي هي جزء في الاتجاه بين هلام وتلميح من ماصة. ثم، ببطء خفض ماصة للوصول إلى المستوى البؤري وسيطة، وزيادة التكبير إلى تلك التي سيتم استخدامها في التجربة، قبل خفض ماصة حتى تحوم فوق سطح هيدروجيل. لمعايرة المتلاعبة الدقيقة، صورة منطقة خالية من الخلايا، منطقة مع الخرز، ولكن لا التلاعب، مع ماصة إشراك هلام، ومع ماصة تشارك سحب هلام.ثم، استخدم الصورة J لمقارنة حقول الخرزة إلى حقول الخرز دون مشاركة، وحقول الخرز مع الجل المشاركة، وجل سحبت لحساب التشريد حبة النسبية والقوة المطبقة على المواد الهلامية. لإجراء فحص دوروتاكسي، مراقبة مجموعة من الخلايا لمدة 30 دقيقة لتحديد الخلايا التي تتحرك بطريقة موجهة. حدد خلية تتحرك بثبات في اتجاه واحد، ثم قم بمراقبة خلايا معدل الإطار المطلوب لمدة 30 دقيقة إضافية.بعد ذلك، ضع الماصات حوالي 50 ميكرومتر أمام الجانب القريب من الحافة الأمامية للخلية المختارة، وتحريك المتلاعب الصغير بحيث يتم تشويه الجل بشكل متعمّد إلى اتجاه الخلية من السفر. ثم، مراقبة الخلية مع مرور الوقت لأنها تستجيب للان تدرج حاد، المحلية من صلابة هيدروجيل. باستخدام هذه التقنية كما هو موضح، الجرذ الجنينية الخلايا الليفية التحرك نحو زيادة صلابة في التدرجات المطبقة من قبل ماصة صغيرة الزجاج.الخلايا الليفية الجنينية الفئران، والتعبير عن عابرة استشعار التوتر vinculin على 125 كيلوباسكال polyacrylamide المواد الهلامية تظهر أيضا تشكيل التصاقات البؤري في اتجاهات تمتد على مدى فترة 40 دقيقة. فورستر الرنين نقل الطاقة تحليل يكشف أن vinculin المترجمة إلى الالتصاقات البؤري يواجه تغييرا فوريا في التوتر, عندما قدمت مع التحفيز دوروتتيك الحاد. توسيع فائدة هذا الفحص إلى مراقبة الأحداث إشارات شبه الخلوية، استجابة لتحفيز durotactic.إذا قمت بإجراء محاولات متعددة لتمتد خلية، أو إذا زلات microneedle أثناء الفحص، تبدأ من جديد مع خلية جديدة لتجنب نقل متعددة، متغير، المحفزات الميكانيكية. وإلى جانب فائدتها في تحليل دوروتاكسيس، يمكن الجمع بين هذه التقنية والنهج الجينية، مثل أجهزة الاستشعار البيولوجية، أو الحمض النووي الريبي، أو تحرير الجينات للمساعدة في تحديد الآليات الجزيئية المشاركة في التحويل الميكانيكي.

Research

JoVE Journal

Biology

Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay

سمية Nanogenomedicine الخلوية في الخط الخليوي MCF - 7 : فحص MTT

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

التصوير G - مستقبلات البروتين يقترن (GPCR) بوساطة الأحداث يشير إلى أن التحكم في الانجذاب الكيميائي Dictyostelium Discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

الحنق المجهر لمراقبة الوقت الحقيقي من أحداث في اشارة الخلايا الحية باستخدام أجهزة الاستشعار Unimolecular

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

مقايسة لتقييم سلوك يزدرع الخلوية من اللحمة المتوسطة القحف

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

تحفيز الميكانيكية التي يسببها الكالسيوم انتشار الموجات في الخلية monolayers: مثال من الأبقار الخلايا البطانية القرنية

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

حقن مكروي وحيدة الخلية لتحليل الاتصالات خلية

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

نظام مبسط لMechanosensing تقييم خلية وDurotaxis<em&gt; في المختبر</em

The composition and mechanical properties of the extracellular matrix are highly variable between tissue types. This connective tissue stroma diversity ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

تحليل الزمانية المكانية من Cytokinetic الأحداث في الخميرة الانشطار

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

تحليل موائع جزيئية خلية واحدة نجحت عصية

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers ...