Name: single cell durotaxis assay for assessing mechanical control of cellular movement and related signaling events
Uploaded: 2019-08-27T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events at JoVE.com

1. fabrikation af deformerbare polyacrylamid Hydrogels med indlejrede fluorescerende mikrokugler
Bemærk: Vejledning beskriver polymerisering af en 25 kPa hydrogel, der er 22 μm i diameter og ca. 66 μm tyk. Hver eller alle af disse parametre kan ændres og anvisninger til at gøre det kan findes i tabel 1 og i noterne17.
<ol><li>Aktivering af glasbund retter eller dæksedler
	<ol>
<li>Forbered bind silan-arbejdsopl?...

<ol>
	<li>Acerbi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+breast+cancer+invasion+and+aggression+correlates+with+ECM+stiffening+and+immune+cell+infiltration.">Human breast cancer invasion and aggression correlates with ECM stiffening and immune cell infiltration.</a> Integrative Biology (Camb. 7 (10), 1120-1134 (2015).</li><li>Mekhdjian, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-mediated+traction+force+enhances+paxillin+molecular+associations+and+adhesion+dynamics+that+increase+the+invasiveness+of+tumor+cells+into+a+three-dimensional+extracellular+matrix.">Integrin-mediated traction force enhances paxillin molecular associations and adhesion dynamics that increase the invasiveness of tumor cells into a three-dimensional extracellular matrix.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (11), 1467-1488 (2017).</li><li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype.">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li><li>Lange, J. R., Fabry, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+tissue+mechanics+in+cell+migration.">Cell and tissue mechanics in cell migration.</a> Experimental Cell Research. 319 (16), 2418-2423 (2013).</li><li>Davidson, L. A., Oster, G. F., Keller, R. E., Koehl, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+mechanical+properties+of+the+blastula+wall+reveal+which+hypothesized+mechanisms+of+primary+invagination+are+physically+plausible+in+the+sea+urchin+Strongylocentrotus+purpuratus.">Measurements of mechanical properties of the blastula wall reveal which hypothesized mechanisms of primary invagination are physically plausible in the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus.</a> Developmental Biology. 209 (2), 221-238 (1999).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mechanical+factors+in+fate+decisions+of+stem+cells.">Role of mechanical factors in fate decisions of stem cells.</a> Regenerative Medicine. 6 (2), 229-240 (2011).</li><li>Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+stiffness+dictates+development,+homeostasis,+and+disease+progression.">Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression.</a> Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).</li><li>Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+movement+is+guided+by+the+rigidity+of+the+substrate.">Cell movement is guided by the rigidity of the substrate.</a> Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).</li><li>Kuo, C. H., Xian, J., Brenton, J. D., Franze, K., Sivaniah, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+stiffness+gradient+substrates+for+studying+mechanotactic+cell+migration.">Complex stiffness gradient substrates for studying mechanotactic cell migration.</a> Advanced Materials. 24 (45), 6059-6064 (2012).</li><li>Breckenridge, M. T., Desai, R. A., Yang, M. T., Fu, J., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrates+with+engineered+step+changes+in+rigidity+induce+traction+force+polarity+and+durotaxis.">Substrates with engineered step changes in rigidity induce traction force polarity and durotaxis.</a> Cell and Molecular Bioengineering. 7 (1), 26-34 (2014).</li><li>Goreczny, G. J., Wormer, D. B., Turner, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+System+for+Evaluating+Cell+Mechanosensing+and+Durotaxis+In+Vitro.">A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e52949 (2015).</li><li>Hartman, C. D., Isenberg, B. C., Chua, S. G., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+cell+durotaxis+depends+on+extracellular+matrix+composition.">Vascular smooth muscle cell durotaxis depends on extracellular matrix composition.</a> Proceedings of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 113 (40), 11190-11195 (2016).</li><li>Vincent, L. G., Choi, Y. S., Alonso-Latorre, B., del Alamo, J. C., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+durotaxis+depends+on+substrate+stiffness+gradient+strength.">Mesenchymal stem cell durotaxis depends on substrate stiffness gradient strength.</a> Biotechnology Journal. 8 (4), 472-484 (2013).</li><li>Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+hydrogels+with+steep+stiffness+gradients+for+studying+cell+mechanical+response.">Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response.</a> PLoS One. 7 (10), e46107 (2012).</li><li>Martinez, J. S., Lehaf, A. M., Schlenoff, J. B., Keller, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+durotaxis+on+polyelectrolyte+multilayers+with+photogenerated+gradients+of+modulus.">Cell durotaxis on polyelectrolyte multilayers with photogenerated gradients of modulus.</a> Biomacromolecules. 14 (5), 1311-1320 (2013).</li><li>Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+fluctuations+within+focal+adhesions+mediate+ECM-rigidity+sensing+to+guide+directed+cell+migration.">Force fluctuations within focal adhesions mediate ECM-rigidity sensing to guide directed cell migration.</a> Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).</li><li>McKenzie, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+microenvironment+regulates+ovarian+cancer+cell+morphology,+migration,+and+spheroid+disaggregation.">The mechanical microenvironment regulates ovarian cancer cell morphology, migration, and spheroid disaggregation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7228 (2018).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Grashoff, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mechanical+tension+across+vinculin+reveals+regulation+of+focal+adhesion+dynamics.">Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics.</a> Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).</li><li>McKenzie, A. J., Campbell, S. L., Howe, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+A+activity+and+anchoring+are+required+for+ovarian+cancer+cell+migration+and+invasion.">Protein kinase A activity and anchoring are required for ovarian cancer cell migration and invasion.</a> PLoS One. 6 (10), e26552 (2011).</li><li>Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyacrylamide+hydrogels+for+cell+mechanics:+steps+toward+optimization+and+alternative+uses.">Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses.</a> Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).</li><li>Plotnikov, S. V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+traction+force+microscopy.">High-resolution traction force microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 123, 367-394 (2014).</li><li>Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+localizing+reporter+fluorescent+beads+near+the+cell+culture+surface+for+traction+force+microscopy.">A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), 51873 (2014).</li></ol>

Demonstreret her er en gentagelig, enkelt celle durotaxis assay, der giver mulighed for vurdering af en celles evne til at ændre sin migration adfærd som reaktion på akutte mekaniske signaler. Denne teknik kan også anvendes i kombination med Fluorescens mikroskopi og passende fusions proteiner eller biosensorer til at undersøge subcellulære signalering og cytoskeletale hændelser inden for sekunder af mekanisk stimulation eller over en længere tidshorisont under durotaktisk bevægelse. Forståelse af en celles for...

I løbet af de sidste par årtier har betydningen af de mekaniske egenskaber af en celles miljø vundet stigende anerkendelse i cellebiologi. Forskellige væv og ekstracellulære matricer har forskellige relative stivhed og, som celler migrere i hele kroppen, de navigerer disse ændringer, ved hjælp af disse mekaniske egenskaber til at vejlede dem1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7. cellerne bruger stivheden i et givet væv til at informere deres motile sædceller adfærd under processer som udvikling, sårheling og kræft metastaser. De molekylære mekanismer, der giver mulighed for at føle og reagere på disse mekaniske indgange, er dog stort set ukendte1,2,3,4,5, 6 , 7.
For at studere de mekanismer, hvorigennem cellerne reagerer på fysiske Miljøsignaler, skal stivhed eller stivhed af substratet underliggende celler manipuleres. I 2000 udviklede Chun-min Lo, Yu-Li Wang og kollegaer en assay8 , hvorved en individuel celles motile sædceller respons på skiftende mekaniske signaler kunne testes direkte ved at strække deformerbare ekstracellulære matrix (ECM)-belagt polyacrylamid silicagelrogeler, som cellerne blev belagt på. Celler udviser en betydelig præference for at migrere mod stivere substrater, et fænomen, de døbt "durotaxis."
Siden den oprindelige rapport i 2000, mange andre teknikker har været ansat til studiet af durotaxis. Stejle stivhed gradienter er blevet fremstillet ved støbning geler over stive funktioner såsom polystyren perler9 eller stiv polymer stillinger10 eller ved polymeriserende substrat omkring kanterne af et glas dæksedler11 at skabe mekaniske ' trin-grænser «. Alternativt, silicagelrogeler med lavvandede men faste stivhed gradienter er blevet fremstillet af en række forskellige metoder såsom gradienter af krydsbinderens skabt af mikrofluidisk enheder12,13 eller side-by-side hydrogel opløsning dråber af forskellig stivhed8, eller silicagelrogeler med foto aktiv krydsbinderens behandlet med klassificeret UV lys eksponering for at skabe en lineær stivhed gradient14,15. Disse teknikker er blevet brugt til stor effekt til at undersøge durotaktisk cellulære bevægelse en masse over tid. Men, typisk disse funktioner er fremstillet i forvejen af celle plating og deres egenskaber forbliver konsekvent i løbet af eksperimentet, afhængige af tilfældige celle bevægelse for prøvetagning af mekaniske gradienter. Ingen af disse teknikker er modtagelig for observation af hurtige ændringer i cellulære adfærd som reaktion på akut mekanisk stimulus.
For at observere cellulære reaktioner på akutte ændringer i det mekaniske miljø, enkelt celle durotaxis assays tilbyder flere fordele. I disse analyser får individuelle celler en akut, mekanisk stimulus ved at trække det underliggende substrat væk fra cellen med en glas mikropipette, hvorved der indføres en retningsbestemt gradient af cellematrix spændinger. Ændringer i den motile sædceller adfærd, såsom hastighed eller retning af migration, er derefter observeret af levende celle fasekontrast mikroskopi. Denne fremgangsmåde letter direkte observation af årsag og virkning forholdet mellem mekaniske stimuli og celle migration, da det giver mulighed for hurtig, iterativ manipulation af retningen og størrelsen af spændings gradient og vurdering af deraf følgende cellulære svar i realtid. Desuden kan denne metode også anvendes til mekanisk stimulering af celler, der udtrykker fluorescerende fusions proteiner eller biosensorer, for at visualisere ændringer i mængden, aktiviteten eller den subcellulære lokalisering af proteiner, der mistænkes for at være involveret i mekaniserende og durotaxis.
Denne teknik har været anvendt af grupper, der studerer durotaxis8,16 og er beskrevet her, da det er blevet tilpasset af Howe Laboratory til at studere durotaktisk opførsel af skov-3 ovariecancerceller og de molekylære mekanismer, der bagvedlig durotaxis17. Derudover beskrives en modificeret metode til fremstilling af silicagelrogeler med et enkelt, jævnt lag af fluorescerende mikrosfærer nær celle kulturens overflade; Dette letter visualisering og optimering af mikropipette genererede stamme gradienter og kan tillade vurdering af celle kontraktilitet ved trækkraft mikroskopi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylamide 40 %&#160;</td>
			<td>National Diagnostic</td>
			<td>EC-810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP179-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD20A High frequency generator</td>
			<td>Electro Technic Products</td>
			<td>12011A</td>
			<td>115 V -&#160;Handheld Corona Wand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bind Silane (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane) (</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-acrylamide 2%&#160;</td>
			<td>National Diagnostic</td>
			<td>EC-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 2510 Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Bransonic</td>
			<td></td>
			<td>40 kHz frequency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coarse Manipulator</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MC35A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM without phenol red</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Stage Glass Micropipette Puller</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco-aaper</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (Qualified One Shot)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A31606-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>FC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluospheres Carboxylate 0.2 um&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8810, F8807, F8811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene 6</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1815091</td>
			<td>1.5 ug DNA / 6uL fugene 6 per 35mm dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38SI-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Dish</td>
			<td>CellVis</td>
			<td>D60-60-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslip</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72224-01</td>
			<td>22 mm, #1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>9535-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III&#160;Special cleaning concentrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z805939</td>
			<td>Used at 2% in ddH2O for cleaning coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES powder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Make 50mM HEPES buffer, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intelli-Ray 400 Shuttered UV Flood Light</td>
			<td>Uviton International</td>
			<td>UV0338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A417-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MF900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MHW3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanopure Life Science UV/UF System</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>D11931</td>
			<td>ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Bemis Company, Inc</td>
			<td>PM-992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>139 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 28.6 mM Na2HPO4, 1.6 mM KH2PO4, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ref52</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rat embryonic fibroblast cell line; Culture in DMEM + 10% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringer&#39;s Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>134 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2.4 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 5 mM D-Glucose, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKOV-3</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td></td>
			<td>Culture in DMEM + 10% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH&#160;</td>
			<td>Covachem</td>
			<td>&#160;12414-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281-50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell durotaxis assay for assessing mechanical control of cellular movement and related signaling events

Durotaxis er den proces, hvorved cellerne fornemmer og reagerer på gradienter af spændinger. For at studere denne proces in vitro, skal stivheden af substratet underliggende en celle manipuleres. Mens silicagelrogeler med gradueret stivhed og langtids migration assays har vist sig nyttige i durotaxis undersøgelser, umiddelbare, akutte reaktioner på lokale ændringer i substrat spændinger tillader fokuseret undersøgelse af individuelle celle bevægelser og subcellulære signalering begivenheder. For at gentage test af cellernes evne til at fornemme og reagere på den underliggende substrat stivhed anvendes en modificeret metode til anvendelse af akutte stigninger i øget spænding til individuelle celler, der dyrkes på deformerbare silicagelrogeler, hvilket giver mulighed for realtid manipulation af styrken og retningen af stivhed gradienter skiltes på celler pågældende. Ved finjustering af analysens detaljer og parametre, såsom mikropipettens form og dimensioner eller den relative placering, placering og retning af den anvendte gradient, kan analysen desuden optimeres til studiet af enhver mekanisk følsom celletype og system. Disse parametre kan ændres til pålideligt at ændre den anvendte stimulus og udvide funktionaliteten og alsidigheden af analysen. Denne metode giver mulighed for undersøgelse af både langsigtede durotaktisk bevægelse samt mere umiddelbare ændringer i cellulære signalering og morfologiske dynamik som reaktion på skiftende stivhed.

Ved at tilberede Mikropipetter (figur 1) og normalisere kraft genereringen af træk (figur 2 og figur 3) som beskrevet ovenfor er der identificeret optimale durotaktiske betingelser for flere cellelinjer. Ved hjælp af denne teknik, som beskrevet i figur 4, BEVÆGER både skov-3 ovariecancerceller17 og Ref52 rotte embryonale fibroblaster (figur 5) si...

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events at JoVE.com

Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events

Mekaniske kræfter er vigtige for at kontrollere celle migration. Denne protokol demonstrerer brugen af elastiske silicagelrogeler, der kan deformeres ved hjælp af en glas mikropipette og en micromanipulator for at stimulere celler med en lokal stivhed gradient til at fremkalde ændringer i cellestruktur og migration.

Enkelt celle Durotaxis analyse til vurdering mekanisk kontrol af cellulære bevægelse og relaterede signalering begivenheder

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate ...

Der er stigende forståelse for virkningen af det mekaniske mikromiljø på cellesignalering og migration. Nødvendiggør brugen af unikke, eksperimentelle tilgange til at levere mekanisk stimulation til den enkelte celle. Denne teknik giver mulighed for dynamisk manipulation af det mekaniske mikromiljø under en celle i realtid.Tillade observation af mekanisk regulerede ændringer i cellemigration adfærd, og sub-cellulære signalering begivenheder. Demonstration af proceduren med mig vil være Nyla Naim, en post-doc og Johnathan Patterson, en tekniker fra vores laboratorium. Begynd med at bruge en Chorono-1 til at aktivere glasoverfladen af hver bunddæksel slip i 20 sekunder, før straks over-æglæggende 50 mikroliter af binde silan arbejdsopløsning på hver dæksel slip.Opløsningen tørres i 10 minutter, før dækslet skylles to gange med 95 % ethanol og to gange med isopropanol. Lad derefter dækslet tørre i ca. 20 minutter. Til fluorescerende mikroperle aflejring skal den arbejdende mikroperleopløsning først sonikeres i en time.15 minutter før sonikeringens afslutning skal det aktiverede dæksel glide lodret i en keramisk dækselholder og overføre holderen til en table-top plasmarens til rumluftplasmabehandling i tre minutter. Dernæst placere stykker af paraffin film i 60 milliliter Petri fad låg, og placere dækslet glider på filmene, let trykke på hver dæksel slip for at sikre en god kontakt mellem filmen og coverslip. Derefter tilsættes 150 mikroliter af arbejdsperleopløsningen til toppen af hver coverslip, og aspirer straks ethanolopløsningen fra siden af dækslerne, så perlerne på dækslæbet efterlades.For at kaste Hydrogels umiddelbart efter deres forberedelse, tilsættes en 25 mikroliter dråbe Hydrogel opløsning til den aktiverede side af hver bund coverslip, og straks vende beaded top coverslips, perle-side ned, på dråben. Lad gelerne polymerisere i 30 minutter, før du bruger snævler til forsigtigt at fjerne dækslerne. Skyl derefter gelerne med tre, fem minutters vask i frisk 50 miliMoler Hepes per vask.For at aktivere Hydrogels overflader, inkubere gelerne i frisk 50 miliMoler Hepes, suppleret med 0,4 miliMolar Sulfo Sanpah, og straks udsætte geler til en ultraviolet bue lampe i et lukket område i 90 sekunder. Ved afslutningen af aktiveringen vaskes gelerne med tre, fem minutters vask i friske Hepes, og de aktiverede Hydrogels behandles med 20 mikrogram pr. milliliter fibronectin i en time ved 37 grader Celsius. Ved inkubationens afslutning aspirere den overskydende fibronectinopløsning og gelerne vaskes tre gange i PBS i fem minutter pr. vask.Efter den sidste vask, placere Hydrogels i en lille mængde PBS og sterilisere gelerne i 15 minutter under ultraviolet lys i et væv kultur hætte. Vask derefter gelerne én gang i frisk PBS. For celleplettering, frø 2,1 gange 10 de fire af de celler af interesse i tre milliliter medium pr-Hydrogel og lad cellerne til at overholde ved 37 grader Celsius i fire til 18 timer.Mens cellerne er ækvilibrering, skal du bruge en mikro-pipette puller til at trække en en millimeter diameter med 100 millimeter lang borosilikat glas mikro-pipette, for at opnå en konus på over to millimeter, der reducerer til ca 50 mikrometer i diameter i den første millimeter, og strækker sig til en lang, parallel 10 mikrometer diameter rør i den sidste millimeter. Dernæst indlæse pipetten i en mikroforge og forme pipetten for at få en 15 mikrometer afstumpet spids, der er lukket i slutningen af en 250 mikrometersektion, bøjet på ca. 35 graders engel fra resten af pipetten. Den omtrentlige diameter ved svinget skal være omkring 30 mikrometer for at give styrke til spidsen.Dernæst placere en Hydrogel på scenen af en omvendt mikroskop. Dæk mediet med mineralsk olie og vælg 10x målet. Steriliser den forberedte mikropipette med 70%alkohol.Derefter indsættes i mikro-pipetteholderen med krogen pegede mod skålen, og brug kurset manipulator til at sænke pipetten, indtil krogen bare rører overfladen af væsken. Fokuser mikroskopet på cellerne, der er klæbet til toppen af gelen, og pas på, at målet ikke er i fare for at ramme prøven eller scenen, bringe fokus over gelen for at finde spidsen af mikropipetten. Drej pipetten, indtil spidsen er vinkelret på brændplanet, så den afstumpede spids af mikropipetten peger ned, og fokuser på spidsen af pipetten efter behov.Fokus tilbage ned til cellelaget for at måle, hvor langt pipetten er fra geloverfladen, og fokuser tilbage op til et plan, der er halvvejs mellem gelen og spidsen af pipetten. Derefter langsomt sænke pipetten for at nå den mellemliggende brændplan, og øge forstørrelsen til det, der vil blive brugt i forsøget, før du sænker pipetten, indtil den svæver lige over overfladen af Hydrogel. For mikro-manipulator kalibrering, billede et område blottet for celler, et område med perler, men ingen manipulation, med pipetten engagere gelen, og med den engagerede pipette trække gelen.Brug derefter billede J til at sammenligne no perlefelterne med perlefelterne uden engagement, perlefelterne med gelen aktiveret, og den trak gel til at beregne de relative perleforskydninger og kraft, der påføres gelerne. For at udføre en durotaxis assay, overvåge en gruppe af celler i 30 minutter for at identificere celler, der bevæger sig på en instrueret måde. Marker en celle, der bevæger sig støt i én retning, og overvåg cellerne i den ønskede billedhastighed i yderligere 30 minutter.Dernæst placere pipetten omkring 50 mikrometer foran den nærmeste side af forkanten af den valgte celle, og flytte mikro-manipulator sådan, at gelen er deformeret ortogonally til cellens kørselsretning. Derefter observere cellen over tid, da den reagerer på den akutte, lokale gradient af Hydrogel stivhed. Ved hjælp af denne teknik som påvist bevæger rotte embryonale fibroblaster sig mod den øgede stivhed i gradienter, der påføres af en mikropipette af glas.Rotte embryonale fibroblast celler, forbigående udtrykke vinculin spænding sensor på 125 kilopascal polyacrylamid geler også demonstrere dannelsen af fokale sammenvoksninger i retninger af strækningen over en periode på 40 minutter. Forster Resonance Energy Transfer analyse afslører, at vinkulin lokaliseret til fokale sammenvoksninger oplever en umiddelbar ændring i spænding, når de præsenteres med en akut durotactic stimulation. Udvidelse af nytten af denne analyse til observation af sub-cellulære signalering begivenheder, som reaktion på durotactic stimulation.Hvis du gør flere forsøg på at strække en celle, eller hvis mikronålen glider under analysen, starte forfra med en ny celle for at undgå at give flere, variable, mekaniske stimuli. Ud over sin nytte for assaying durotaxis, kan denne teknik kombineres med genetiske tilgange, såsom biosensorer, RNAI, eller genredigering for at hjælpe afgrænse de molekylære mekanismer, der er involveret i mechanotransduction.

Research

JoVE Journal

Biology

Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

FRET mikroskopi af Real-time overvågning af signalering begivenheder i levende celler Brug unimolekylær Biosensorer

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

En Eksplantation Assay for vurdering Cellulær Behavior af Cranial mesenkym

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Mekanisk Stimulation-induceret Calcium bølgeudbredelse i cellemonolag: eksempel med Bovin hornhindeendothelceller

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Single-celle Mikroinjektion for Cell Kommunikation Analyse

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

En forenklet system for Evaluering Cell Mechanosensing og Durotaxis<em&gt; In vitro</em

The composition and mechanical properties of the extracellular matrix are highly variable between tissue types. This connective tissue stroma diversity ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Spatiotemporal Analyse af Cytokinetic Begivenheder i Fission Gær

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Encellede mikrofluid analyse af Bacillus subtilis

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers ...