Name: single cell durotaxis assay for assessing mechanical control of cellular movement and related signaling events
Uploaded: 2019-08-27T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events at JoVE.com

1. vervaardiging van vervormbare Polyacrylamidehydrogels met ingesloten fluorescerende microsferen
Opmerking: Aanwijzingen beschrijven polymerisatie van een 25 kPa hydrogel met een diameter van 22 μm en ongeveer 66 μm dik. Elk van deze parameters kan worden gewijzigd en de aanwijzingen hiervoor zijn te vinden in tabel 1 en in toelichting17.
<ol><li>Activering van glasbodem gerechten of dekstroken
	<ol>
<li>Bereid de...

<ol>
	<li>Acerbi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+breast+cancer+invasion+and+aggression+correlates+with+ECM+stiffening+and+immune+cell+infiltration.">Human breast cancer invasion and aggression correlates with ECM stiffening and immune cell infiltration.</a> Integrative Biology (Camb. 7 (10), 1120-1134 (2015).</li><li>Mekhdjian, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-mediated+traction+force+enhances+paxillin+molecular+associations+and+adhesion+dynamics+that+increase+the+invasiveness+of+tumor+cells+into+a+three-dimensional+extracellular+matrix.">Integrin-mediated traction force enhances paxillin molecular associations and adhesion dynamics that increase the invasiveness of tumor cells into a three-dimensional extracellular matrix.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (11), 1467-1488 (2017).</li><li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype.">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li><li>Lange, J. R., Fabry, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+tissue+mechanics+in+cell+migration.">Cell and tissue mechanics in cell migration.</a> Experimental Cell Research. 319 (16), 2418-2423 (2013).</li><li>Davidson, L. A., Oster, G. F., Keller, R. E., Koehl, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+mechanical+properties+of+the+blastula+wall+reveal+which+hypothesized+mechanisms+of+primary+invagination+are+physically+plausible+in+the+sea+urchin+Strongylocentrotus+purpuratus.">Measurements of mechanical properties of the blastula wall reveal which hypothesized mechanisms of primary invagination are physically plausible in the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus.</a> Developmental Biology. 209 (2), 221-238 (1999).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mechanical+factors+in+fate+decisions+of+stem+cells.">Role of mechanical factors in fate decisions of stem cells.</a> Regenerative Medicine. 6 (2), 229-240 (2011).</li><li>Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+stiffness+dictates+development,+homeostasis,+and+disease+progression.">Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression.</a> Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).</li><li>Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+movement+is+guided+by+the+rigidity+of+the+substrate.">Cell movement is guided by the rigidity of the substrate.</a> Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).</li><li>Kuo, C. H., Xian, J., Brenton, J. D., Franze, K., Sivaniah, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+stiffness+gradient+substrates+for+studying+mechanotactic+cell+migration.">Complex stiffness gradient substrates for studying mechanotactic cell migration.</a> Advanced Materials. 24 (45), 6059-6064 (2012).</li><li>Breckenridge, M. T., Desai, R. A., Yang, M. T., Fu, J., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrates+with+engineered+step+changes+in+rigidity+induce+traction+force+polarity+and+durotaxis.">Substrates with engineered step changes in rigidity induce traction force polarity and durotaxis.</a> Cell and Molecular Bioengineering. 7 (1), 26-34 (2014).</li><li>Goreczny, G. J., Wormer, D. B., Turner, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+System+for+Evaluating+Cell+Mechanosensing+and+Durotaxis+In+Vitro.">A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e52949 (2015).</li><li>Hartman, C. D., Isenberg, B. C., Chua, S. G., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+cell+durotaxis+depends+on+extracellular+matrix+composition.">Vascular smooth muscle cell durotaxis depends on extracellular matrix composition.</a> Proceedings of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 113 (40), 11190-11195 (2016).</li><li>Vincent, L. G., Choi, Y. S., Alonso-Latorre, B., del Alamo, J. C., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+durotaxis+depends+on+substrate+stiffness+gradient+strength.">Mesenchymal stem cell durotaxis depends on substrate stiffness gradient strength.</a> Biotechnology Journal. 8 (4), 472-484 (2013).</li><li>Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+hydrogels+with+steep+stiffness+gradients+for+studying+cell+mechanical+response.">Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response.</a> PLoS One. 7 (10), e46107 (2012).</li><li>Martinez, J. S., Lehaf, A. M., Schlenoff, J. B., Keller, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+durotaxis+on+polyelectrolyte+multilayers+with+photogenerated+gradients+of+modulus.">Cell durotaxis on polyelectrolyte multilayers with photogenerated gradients of modulus.</a> Biomacromolecules. 14 (5), 1311-1320 (2013).</li><li>Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+fluctuations+within+focal+adhesions+mediate+ECM-rigidity+sensing+to+guide+directed+cell+migration.">Force fluctuations within focal adhesions mediate ECM-rigidity sensing to guide directed cell migration.</a> Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).</li><li>McKenzie, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+microenvironment+regulates+ovarian+cancer+cell+morphology,+migration,+and+spheroid+disaggregation.">The mechanical microenvironment regulates ovarian cancer cell morphology, migration, and spheroid disaggregation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7228 (2018).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Grashoff, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mechanical+tension+across+vinculin+reveals+regulation+of+focal+adhesion+dynamics.">Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics.</a> Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).</li><li>McKenzie, A. J., Campbell, S. L., Howe, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+A+activity+and+anchoring+are+required+for+ovarian+cancer+cell+migration+and+invasion.">Protein kinase A activity and anchoring are required for ovarian cancer cell migration and invasion.</a> PLoS One. 6 (10), e26552 (2011).</li><li>Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyacrylamide+hydrogels+for+cell+mechanics:+steps+toward+optimization+and+alternative+uses.">Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses.</a> Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).</li><li>Plotnikov, S. V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+traction+force+microscopy.">High-resolution traction force microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 123, 367-394 (2014).</li><li>Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+localizing+reporter+fluorescent+beads+near+the+cell+culture+surface+for+traction+force+microscopy.">A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), 51873 (2014).</li></ol>

Hier gedemonstreerd is een herhaalbare, eencellige durotaxis assay die het mogelijk maakt om de mogelijkheid van een cel om zijn migratie gedrag te veranderen in reactie op acute mechanische aanwijzingen. Deze techniek kan ook worden gebruikt in combinatie met fluorescentiemicroscopie en geschikte fusie proteïnen of biosensoren om subcellulaire signalering en cytoskelet gebeurtenissen binnen enkele seconden na mechanische stimulatie of over een langere tijdschaal te onderzoeken tijdens durotactische beweging. Het begrij...

De laatste decennia is het belang van de mechanische eigenschappen van de omgeving van een cel toegenomen erkenning in de celbiologie. Verschillende weefsels en extracellulaire matrices hebben verschillende relatieve verstijmen en, als cellen migreren door het hele lichaam, ze navigeren deze veranderingen, met behulp van deze mechanische eigenschappen om hen te begeleiden1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7. cellen gebruiken de stijfheid van een bepaald weefsel om hun beweeglijke gedrag te informeren tijdens processen zoals ontwikkeling, wondgenezing en kanker metastasen. Echter, de moleculaire mechanismen die het gevoel van en reactie op deze mechanische ingangen kunnen blijven grotendeels onbekend1,2,3,4,5, 6 , 7.
Om de mechanismen te bestuderen waardoor cellen reageren op fysieke omgevings aanwijzingen, moeten de stijfheid of stijfheid van het onderliggende substraat van de cellen worden gemanipuleerd. In 2000 ontwikkelden Chun-min Lo, Yu-Li Wang en collega's een assay8 waarbij de beweeglijke respons van een individuele cel op veranderende mechanische signalen direct kan worden getest door het strekken van vervormbare extracellulaire matrix (ECM)-gecoate Polyacrylamide hydrogels waarop de cellen zijn geplateerd. Cellen vertoont een belangrijke voorkeur voor de migratie naar stijvere substraten, een fenomeen dat ze "durotaxis" nagesynchroniseerde.
Sinds het oorspronkelijke rapport in 2000 zijn vele andere technieken gebruikt voor de studie van durotaxis. Steile stijfheids gradiënten zijn vervaardigd door gels te gieten over stijve functies zoals polystyreen kralen9 of stijve polymeer palen10 of door het substraat rond de randen van een glazen dekstroken te polymeriseren11 om mechanische ' Step-grenzen '. Als alternatief zijn hydrogels met onlagere maar vaste stijfheids gradiënten vervaardigd door een verscheidenheid aan methoden, zoals gradiënten van als gemaakt door microfluïdische apparaten12,13 of side-by-side hydrogel oplossing druppels van verschillende stijfheid8, of hydrogels met photoreactive als behandeld met Graded blootstelling aan UV-licht om een lineaire stijfheid gradiënt14,15te creëren. Deze technieken zijn gebruikt om een groot effect te onderzoeken durotactische cellulaire beweging en masse na verloop van tijd. Echter, meestal zijn deze functies vervaardigd op voorhand van celplating en hun eigenschappen blijven consistent in de loop van het experiment, afhankelijk van willekeurige celbeweging voor bemonstering van mechanische verlopen. Geen van deze technieken zijn vatbaar voor waarneming van snelle veranderingen in cellulaire gedrag in reactie op acute mechanische stimulus.
Om te observeren cellulaire reacties op acute veranderingen in de mechanische omgeving, eencellige durotaxis assays bieden verschillende voordelen. In deze tests krijgen individuele cellen een acute, mechanische stimulans door het onderliggende substraat weg te trekken van de cel met een glazen micro Pipet, waardoor een richtings gradiënt van de celmatrix spanning wordt ingevoerd. Veranderingen in het beweeglijke gedrag, zoals snelheid of richting van de migratie, worden vervolgens waargenomen door de Live-cel fase contrast microscopie. Deze aanpak vergemakkelijkt directe observatie van oorzaak en gevolg relaties tussen mechanische stimuli en Celmigratie, omdat het een snelle, iteratieve manipulatie van de richting en de grootte van de spannings gradiënt mogelijk maakt en de beoordeling van de daaruit voortvloeiende cellulaire reacties in real-time. Verder kan deze methode ook worden gebruikt om cellen die fluorescerende fusie proteïnen of biosensoren uitdrukken, mechanisch te stimuleren om veranderingen in de hoeveelheid, activiteit of subcellulaire lokalisatie van eiwitten die vermoedelijk betrokken zijn bij mechanosensing te visualiseren en durotaxis.
Deze techniek is gebruikt door groepen die durotaxis8,16 bestuderen en wordt hier beschreven omdat het door het Howe laboratorium is aangepast om het durotactische gedrag van SKOV-3 ovariële kankercellen te bestuderen en de moleculaire mechanismen die rela durotaxis17. Daarnaast wordt een gemodificeerde methode beschreven voor de fabricage van hydrogels met een enkele, gelijkmatige laag van fluorescerende microsferen in de buurt van het celkweek oppervlak; Dit vergemakkelijkt de visualisatie en optimalisatie van door micro pipet gegenereerde stam gradiënten en kan een beoordeling van de contractiliteit van de cellen door tractiekracht microscopie mogelijk maken.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylamide 40 %&#160;</td>
			<td>National Diagnostic</td>
			<td>EC-810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP179-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD20A High frequency generator</td>
			<td>Electro Technic Products</td>
			<td>12011A</td>
			<td>115 V -&#160;Handheld Corona Wand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bind Silane (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane) (</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-acrylamide 2%&#160;</td>
			<td>National Diagnostic</td>
			<td>EC-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 2510 Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Bransonic</td>
			<td></td>
			<td>40 kHz frequency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coarse Manipulator</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MC35A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM without phenol red</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Stage Glass Micropipette Puller</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco-aaper</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (Qualified One Shot)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A31606-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>FC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluospheres Carboxylate 0.2 um&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8810, F8807, F8811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene 6</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1815091</td>
			<td>1.5 ug DNA / 6uL fugene 6 per 35mm dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38SI-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Dish</td>
			<td>CellVis</td>
			<td>D60-60-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslip</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72224-01</td>
			<td>22 mm, #1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>9535-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III&#160;Special cleaning concentrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z805939</td>
			<td>Used at 2% in ddH2O for cleaning coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES powder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Make 50mM HEPES buffer, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intelli-Ray 400 Shuttered UV Flood Light</td>
			<td>Uviton International</td>
			<td>UV0338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A417-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MF900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MHW3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanopure Life Science UV/UF System</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>D11931</td>
			<td>ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Bemis Company, Inc</td>
			<td>PM-992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>139 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 28.6 mM Na2HPO4, 1.6 mM KH2PO4, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ref52</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rat embryonic fibroblast cell line; Culture in DMEM + 10% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringer&#39;s Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>134 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2.4 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 5 mM D-Glucose, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKOV-3</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td></td>
			<td>Culture in DMEM + 10% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH&#160;</td>
			<td>Covachem</td>
			<td>&#160;12414-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281-50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell durotaxis assay for assessing mechanical control of cellular movement and related signaling events

Durotaxis is het proces waarbij cellen zich voelen en reageren op gradiënten van spanningen. Om dit proces in vitro te bestuderen, moet de stijfheid van de onderliggende ondergrond van een cel worden gemanipuleerd. Terwijl hydrogels met gegradeerde stijfheid en lange termijn Migratietesten zijn nuttig gebleken in durotaxis studies, onmiddellijke, acute reacties op lokale veranderingen in substraat spanning toestaan gerichte studie van individuele celbewegingen en subcellulaire signalering van gebeurtenissen. Om het vermogen van cellen op een herhaaldelijk manier te testen en te reageren op de onderliggende substraat stijfheid, wordt een aangepaste methode gebruikt voor het aanbrengen van acute gradiënten van verhoogde spanning op individuele cellen die worden gekweekt op vervormbare hydrogels, die real-time manipulatie van de sterkte en de richting van de stijfheid gradiënten op de cellen in kwestie. Door de details en parameters van de Assay, zoals de vorm en afmetingen van de micro pipet of de relatieve positie, plaatsing en richting van de toegepaste gradiënt, te finetuning, kan de test bovendien worden geoptimaliseerd voor de studie van een mechanisch gevoelig celtype en-systeem. Deze parameters kunnen worden gewijzigd om de toegepaste stimulus betrouwbaar te veranderen en de functionaliteit en veelzijdigheid van de test uit te breiden. Deze methode maakt onderzoek van zowel de lange termijn durotactische beweging als meer directe veranderingen in cellulaire signalering en morfologische dynamiek in reactie op veranderende stijfheid.

Door micropipetten voor te bereiden (Figuur 1) en de kracht opwekking van de trekkrachten te normaliseren (Figuur 2 en Figuur 3), zoals hierboven beschreven, zijn voor meerdere cellijnen optimale durotactische condities vastgesteld. Met behulp van deze techniek, zoals uiteengezet in Figuur 4, bewegen zowel SKOV-3 ovariële kankercellen17 en Ref52 rat embryonale fibroblasten (<str...

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events at JoVE.com

Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events

Mechanische krachten zijn belangrijk voor het beheersen van de Celmigratie. Dit protocol demonstreert het gebruik van elastische hydrogels die kunnen worden vervormd met behulp van een glazen micro pipet en een micro manipulator om cellen te stimuleren met een lokale stijfheids gradiënt om veranderingen in celstructuur en migratie teweeg te brengen.

Enkelvoudige cel Duro Taxis assay voor de beoordeling van de mechanische controle van cellulaire beweging en gerelateerde signalering van gebeurtenissen

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate ...

Er is een groeiende waardering voor de impact van de mechanische micro-omgeving op celsignalering en migratie. Noodzakelijk het gebruik van unieke, experimentele benaderingen om mechanische stimulatie te leveren aan individuele cellen. Deze techniek maakt het mogelijk om de mechanische micro-omgeving onder een cel in realtime te manipuleren.Het toestaan van de observatie van mechanisch gereguleerde veranderingen in celmigratiegedrag en subcellulaire signaleringsgebeurtenissen. Het aantonen van de procedure met mij zal Nyla Naim, een post-doc en Johnathan Patterson, een technicus van ons laboratorium. Begin met het gebruik van een Chorono-1 om het glazen oppervlak van elke bodemdeksel gedurende 20 seconden te activeren, voordat onmiddellijk 50 microliters bind silane werkoplossing op elke afdeksel slip.Laat de oplossing 10 minuten drogen voordat u de afdektol twee keer spoelt met 95% ethanol en twee keer met isopropanol. Laat vervolgens de afdekking ongeveer 20 minuten aan de lucht drogen. Voor fluorescerende micro-kraalafzetting, eerste sonicate de werkende micro-kraal oplossing voor een uur.Plaats 15 minuten voor het einde van de sonicatie de geactiveerde afdekking verticaal in een keramische afdekselhouder en breng de houder gedurende drie minuten over in een plasmareiniger aan tafeltop voor een kamerluchtplasmabehandeling. Plaats vervolgens stukjes paraffinefilm in 60 milliliter petrischaaldeksels en plaats de hoes op de films, licht tikkend op elke cover slip om een goed contact tussen de film en de coverslip te garanderen. Voeg vervolgens 150 microliter van de werkkraaloplossing toe aan de bovenkant van elke coverslip en vervolgens onmiddellijk de ethanoloplossing vanaf de zijkant van de coverslips aan te sporen, waardoor de kralen op de coverslip blijven.Om de Hydrogels onmiddellijk na hun voorbereiding te werpen, voeg je een 25 microliter druppel hydrogel-oplossing toe aan de geactiveerde kant van elke onderste coverlip, en draai je onmiddellijk de kralen bovenste coverslips, kraalzijde naar beneden, op de druppel. Laat de gels 30 minuten polymeriseren voordat u tangen gebruikt om de afdekken voorzichtig te verwijderen. Spoel vervolgens de gels af met drie, vijf minuten wasbeurten in verse 50 miliMoler Hepes per wasbeurt.Om de Hydrogels oppervlakken te activeren, 1cubaat de gels in verse 50 miliMoler Hepes, aangevuld met 0,4 miliMolar Sulfo Sanpah, en onmiddellijk bloot de gels aan een ultraviolette boog lamp in een afgesloten gebied voor 90 seconden. Aan het einde van de activering, was de gels met drie, vijf minuten wast in verse Hepes, en behandel de geactiveerde Hydrogels met 20 microgram per milliliter fibronectine gedurende een uur op 37 graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, aspirate de overtollige fibronectin oplossing, en was de gels drie keer in PBS gedurende vijf minuten per wasbeurt.Na de laatste wasbeurt, plaats de Hydrogels in een klein volume van PBS en steriliseren de gels gedurende 15 minuten onder ultraviolet licht in een weefselkweekkap. Was vervolgens de gels een keer in verse PBS. Voor celbeplating, zaad 2,1 keer 10 de vier van de cellen van belang in drie milliliter medium per Hydrogel en laat de cellen te hechten op 37 graden Celsius gedurende vier tot 18 uur.Terwijl de cellen zijn evenwicht, gebruik maken van een micro-pipet trekker om een diameter van een millimeter te trekken door 100 millimeter lang borosilicaat glas micro-pipet, om een taper van meer dan twee millimeter die vermindert tot ongeveer 50 micrometer in diameter in de eerste millimeter te verkrijgen, en strekt zich uit tot een lange, parallelle 10 micro diameter buis in de laatste millimeter. Laad vervolgens de pipet in een microforge en vorm de pipet om een 15 micrometer afgestompte punt te hebben die is ingesloten aan het einde van een 250 micrometersectie, gebogen op ongeveer 35 graden engel van de rest van de pipet. De geschatte diameter bij de bocht moet ongeveer 30 micrometer zijn om de punt sterkte te geven.Plaats vervolgens een Hydrogel op het podium van een omgekeerde microscoop. Bedek het medium met minerale olie en selecteer de 10x doelstelling. Steriliseer de bereide micropipet met de 70%alcohol.Steek vervolgens in de micropipet houder met de haak gericht in de richting van de schotel, en gebruik de cursus manipulator om de pipet lager totdat de haak net raakt het oppervlak van de vloeistof. Focus de microscoop op de cellen die aan de bovenkant van de gel zijn vastgehangen, en zorg ervoor dat het doel geen gevaar is om het monster of de fase te raken, breng de focus boven de gel om de punt van de micropipet te vinden. Draai de pipet totdat de punt loodrecht op het brandpuntsvlak staat, zodat de afgestompte punt van de micropipet naar beneden wijst en zich indien nodig opnieuw op de punt van de pipet richt.Focus terug naar de cellaag om te meten hoe ver de pipet is van het geloppervlak, en focus terug naar een vlak dat deel-weg tussen de gel en de punt van pipet. Laat vervolgens de pipet langzaam zakken om het middenpuntvlak te bereiken en verhoog de vergroting tot die welke in het experiment zal worden gebruikt, voordat u de pipet verlaagt totdat deze net boven het oppervlak van de Hydrogel zweeft. Voor micro-manipulator kalibratie, beeld een gebied verstoken van cellen, een gebied met kralen, maar geen manipulatie, met de pipet boeiende de gel, en met de ingeschakelde pipet trekken van de gel.Gebruik vervolgens afbeelding J om de velden geen kralen te vergelijken met de beadvelden zonder betrokkenheid, de kraalvelden met de ingeschakelde gel en de getrokken gel om de relatieve kraalverplaatsingen en kracht te berekenen die op de gels worden toegepast. Als u een durotaxis-test wilt uitvoeren, controleert u gedurende 30 minuten een groep cellen om cellen te identificeren die op een gerichte manier bewegen. Selecteer een cel die gestaag in één richting beweegt en controleer de cellen van de gewenste framesnelheid gedurende nog eens 30 minuten.Plaats vervolgens de pipet ongeveer 50 micrometer voor de nabije kant van de voorrand van de geselecteerde cel en verplaats de micromanipulator zodanig dat de gel orthogonaal wordt vervormd naar de rijrichting van de cel. Observeer vervolgens de cel na verloop van tijd als het reageert op de acute, lokale gradiënt van Hydrogel stijfheid. Met behulp van deze techniek zoals aangetoond, rat embryonale fibroblasten bewegen in de richting van de verhoogde stijfheid in gradiënten toegepast door een glazen micro-pipet.Rat embryonale fibroblastcellen, die van voorbijgaande aard vinculinspanningssensor uitdrukken op 125 kilopascal polyacrylamide gels tonen ook de vorming van brandpuntsverklevingen in de richtingen van het traject gedurende een periode van 40 minuten. Forster Resonance Energy Transfer analyse blijkt dat vinculin gelokaliseerd op focale verklevingen ervaart een onmiddellijke verandering in spanning, wanneer gepresenteerd met een acute durotactische stimulatie. Uitbreiding van het nut van deze test om de observatie van subcellulaire signalering gebeurtenissen, in reactie op durotactische stimulatie.Als u meerdere pogingen doet om een cel uit te rekken, of als de microneedle glijdt tijdens de test, opnieuw beginnen met een nieuwe cel om te voorkomen dat het geven van meerdere, variabele, mechanische stimuli. Naast het nut voor het testen van durotaxis, kan deze techniek worden gecombineerd met genetische benaderingen, zoals biosensoren, RNAI, of genbewerking om te helpen de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij mechanotransductie af te bakenen.

Research

JoVE Journal

Biology

Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay

Cellulaire toxiciteit van Nanogenomedicine in MCF-7 cellijn: MTT-test

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Imaging G-eiwit gekoppelde receptor (GPCR)-gemedieerde Signaling Gebeurtenissen die controle Chemotaxis van Dictyostelium discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

FRET microscopie voor Real-time monitoring van Signalering Evenementen in levende cellen met behulp Unimoleculaire Biosensoren

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

Een Explantatie Assay voor het beoordelen van cellulair gedrag van de craniale mesenchym

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Mechanische stimulatie geïnduceerde Calcium golfvoortplanting in celmonolagen: Het voorbeeld van Bovine corneale endotheelcellen

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Eencellige micro-injectie voor mobiele Communicatie Analyse

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

Een vereenvoudigd systeem voor het evalueren van de Cel Mechanosensing en Durotaxis<em&gt; In Vitro</em

The composition and mechanical properties of the extracellular matrix are highly variable between tissue types. This connective tissue stroma diversity ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Spatiotemporele analyse van Cytokinetic Evenementen in Fission Yeast

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Eencellige Microfluidic analyse van Bacillus subtilis

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers ...