Name: single cell durotaxis assay for assessing mechanical control of cellular movement and related signaling events
Uploaded: 2019-08-27T14:45:00
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1. Fabrication d'hydrogels de polyacrylamide déformables avec microsphères fluorescentes intégrées
REMARQUE: Les instructions décrivent la polymérisation d'un hydrogel de 25 kPa d'un diamètre de 22 m et d'une épaisseur d'environ 66 m. Chacun ou tous ces paramètres peuvent être modifiés et les directions à cet égard peuvent être trouvées dans le tableau 1 et dans les notes17.
<ol><li>Activation de plats à fond d...

<ol>
	<li>Acerbi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+breast+cancer+invasion+and+aggression+correlates+with+ECM+stiffening+and+immune+cell+infiltration.">Human breast cancer invasion and aggression correlates with ECM stiffening and immune cell infiltration.</a> Integrative Biology (Camb. 7 (10), 1120-1134 (2015).</li><li>Mekhdjian, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-mediated+traction+force+enhances+paxillin+molecular+associations+and+adhesion+dynamics+that+increase+the+invasiveness+of+tumor+cells+into+a+three-dimensional+extracellular+matrix.">Integrin-mediated traction force enhances paxillin molecular associations and adhesion dynamics that increase the invasiveness of tumor cells into a three-dimensional extracellular matrix.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (11), 1467-1488 (2017).</li><li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype.">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li><li>Lange, J. R., Fabry, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+tissue+mechanics+in+cell+migration.">Cell and tissue mechanics in cell migration.</a> Experimental Cell Research. 319 (16), 2418-2423 (2013).</li><li>Davidson, L. A., Oster, G. F., Keller, R. E., Koehl, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+mechanical+properties+of+the+blastula+wall+reveal+which+hypothesized+mechanisms+of+primary+invagination+are+physically+plausible+in+the+sea+urchin+Strongylocentrotus+purpuratus.">Measurements of mechanical properties of the blastula wall reveal which hypothesized mechanisms of primary invagination are physically plausible in the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus.</a> Developmental Biology. 209 (2), 221-238 (1999).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mechanical+factors+in+fate+decisions+of+stem+cells.">Role of mechanical factors in fate decisions of stem cells.</a> Regenerative Medicine. 6 (2), 229-240 (2011).</li><li>Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+stiffness+dictates+development,+homeostasis,+and+disease+progression.">Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression.</a> Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).</li><li>Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+movement+is+guided+by+the+rigidity+of+the+substrate.">Cell movement is guided by the rigidity of the substrate.</a> Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).</li><li>Kuo, C. H., Xian, J., Brenton, J. D., Franze, K., Sivaniah, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+stiffness+gradient+substrates+for+studying+mechanotactic+cell+migration.">Complex stiffness gradient substrates for studying mechanotactic cell migration.</a> Advanced Materials. 24 (45), 6059-6064 (2012).</li><li>Breckenridge, M. T., Desai, R. A., Yang, M. T., Fu, J., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrates+with+engineered+step+changes+in+rigidity+induce+traction+force+polarity+and+durotaxis.">Substrates with engineered step changes in rigidity induce traction force polarity and durotaxis.</a> Cell and Molecular Bioengineering. 7 (1), 26-34 (2014).</li><li>Goreczny, G. J., Wormer, D. B., Turner, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+System+for+Evaluating+Cell+Mechanosensing+and+Durotaxis+In+Vitro.">A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e52949 (2015).</li><li>Hartman, C. D., Isenberg, B. C., Chua, S. G., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+cell+durotaxis+depends+on+extracellular+matrix+composition.">Vascular smooth muscle cell durotaxis depends on extracellular matrix composition.</a> Proceedings of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 113 (40), 11190-11195 (2016).</li><li>Vincent, L. G., Choi, Y. S., Alonso-Latorre, B., del Alamo, J. C., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+durotaxis+depends+on+substrate+stiffness+gradient+strength.">Mesenchymal stem cell durotaxis depends on substrate stiffness gradient strength.</a> Biotechnology Journal. 8 (4), 472-484 (2013).</li><li>Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+hydrogels+with+steep+stiffness+gradients+for+studying+cell+mechanical+response.">Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response.</a> PLoS One. 7 (10), e46107 (2012).</li><li>Martinez, J. S., Lehaf, A. M., Schlenoff, J. B., Keller, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+durotaxis+on+polyelectrolyte+multilayers+with+photogenerated+gradients+of+modulus.">Cell durotaxis on polyelectrolyte multilayers with photogenerated gradients of modulus.</a> Biomacromolecules. 14 (5), 1311-1320 (2013).</li><li>Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+fluctuations+within+focal+adhesions+mediate+ECM-rigidity+sensing+to+guide+directed+cell+migration.">Force fluctuations within focal adhesions mediate ECM-rigidity sensing to guide directed cell migration.</a> Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).</li><li>McKenzie, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+microenvironment+regulates+ovarian+cancer+cell+morphology,+migration,+and+spheroid+disaggregation.">The mechanical microenvironment regulates ovarian cancer cell morphology, migration, and spheroid disaggregation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7228 (2018).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Grashoff, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mechanical+tension+across+vinculin+reveals+regulation+of+focal+adhesion+dynamics.">Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics.</a> Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).</li><li>McKenzie, A. J., Campbell, S. L., Howe, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+A+activity+and+anchoring+are+required+for+ovarian+cancer+cell+migration+and+invasion.">Protein kinase A activity and anchoring are required for ovarian cancer cell migration and invasion.</a> PLoS One. 6 (10), e26552 (2011).</li><li>Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyacrylamide+hydrogels+for+cell+mechanics:+steps+toward+optimization+and+alternative+uses.">Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses.</a> Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).</li><li>Plotnikov, S. V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+traction+force+microscopy.">High-resolution traction force microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 123, 367-394 (2014).</li><li>Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+localizing+reporter+fluorescent+beads+near+the+cell+culture+surface+for+traction+force+microscopy.">A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), 51873 (2014).</li></ol>

Démontré ici est un reproductible, un seul-cellule durotaxis analyse qui permet d'évaluer la capacité d'une cellule à modifier son comportement de migration en réponse à des indices mécaniques aigus. Cette technique peut également être utilisée en combinaison avec la microscopie à fluorescence et des protéines de fusion ou biocapteurs appropriés pour examiner la signalisation sous-cellulaire et les événements cytosquelettiques dans les secondes suivant la stimulation mécanique ou sur une plus longue pér...

Au cours des dernières décennies, l'importance des propriétés mécaniques de l'environnement d'une cellule a acquis une reconnaissance croissante en biologie cellulaire. Différents tissus et matrices extracellulaires ont des rigidités relatives différentes et, comme les cellules migrent dans tout le corps, ils naviguent dans ces changements, en utilisant ces propriétés mécaniques pour les guider1,2,3 , 4 ( en plus) , 5 Annonces , 6 Annonces , 7. Les cellules utilisent la rigidité d'un tissu donné pour éclairer leur comportement motile pendant des processus tels que le développement, la guérison des plaies et les métastes cancéreuses. Cependant, les mécanismes moléculaires qui permettent la sensation et la réponse à ces entrées mécaniques restent largement inconnus1,2,3,4,5, 6 Annonces , 7.
Afin d'étudier les mécanismes par lesquels les cellules réagissent aux indices environnementaux physiques, la rigidité ou la rigidité du substrat sous-jacent aux cellules adhérentes doit être manipulée. En 2000, Chun-Min Lo, Yu-Li Wang et ses collègues ont mis au point un essai8 par lequel la réponse motile d'une cellule individuelle aux indices mécaniques changeants pouvait être directement testée en étirant la matrice extracellulaire déformable (ECM) enduite de polyacrylamide hydrogels sur lesquels les cellules ont été plaquées. Les cellules présentent une préférence significative pour la migration vers des substrats plus rigides, un phénomène qu'elles ont surnommé « durotaxis ».
Depuis le rapport original de 2000, de nombreuses autres techniques ont été utilisées pour l'étude du durotaxis. Des gradients de rigidité raide ont été fabriqués en jetant des gels sur des caractéristiques rigides telles que les perles de polystyrène9 ou les poteaux de polymère rigide s'il en est à10 ou en polymérisant le substrat sur les bords d'un verrecouvre 11 pour créer des step-boundaries ». Alternativement, les hydrogels avec des gradients de rigidité moins profonds mais fixes ont été fabriqués par une variété de méthodes telles que des gradients de crosslinker créés par des dispositifs microfluidiques12,13 ou côte à côte gouttelettes de solution hydrogel de rigidité différente8, ou hydrogels avec crosslinker photoréactive traité avec une exposition à la lumière UV graduée pour créer un gradient de rigidité linéaire14,15. Ces techniques ont été utilisées à grand effet pour étudier le mouvement cellulaire durotactic en masse au fil du temps. Cependant, généralement ces caractéristiques sont fabriquées à l'avance du placage cellulaire et leurs propriétés restent cohérentes au cours de l'expérience, en s'appuyant sur le mouvement aléatoire des cellules pour l'échantillonnage des gradients mécaniques. Aucune de ces techniques ne sont propices à l'observation de changements rapides dans le comportement cellulaire en réponse à un stimulus mécanique aigu.
Afin d'observer les réponses cellulaires aux changements aigus dans l'environnement mécanique, les essais de durotaxis à cellule unique offrent plusieurs avantages. Dans ces essais, les cellules individuelles sont donnés un stimulus mécanique aigu en tirant le substrat sous-jacent loin de la cellule avec une micropipette en verre, introduisant de ce fait un gradient directionnel de tension de cellule-matrice. Les changements dans le comportement motile, tels que la vitesse ou la direction de la migration, sont ensuite observés par microscopie de contraste de phase de cellule vivante. Cette approche facilite l'observation directe des relations de cause à effet entre les stimuli mécaniques et la migration cellulaire, car elle permet une manipulation rapide et itérative de la direction et de l'ampleur du gradient de tension et l'évaluation des réponses cellulaires en temps réel. En outre, cette méthode peut également être utilisée pour stimuler mécaniquement les cellules exprimant des protéines fluorescentes de fusion ou des biocapteurs pour visualiser les changements dans la quantité, l'activité ou la localisation subcellulaire des protéines soupçonnées d'être impliquées dans la mécanoceles et durotaxis.
Cette technique a été utilisée par des groupes qui étudient la durotaxique8,16 et est décrite ici comme il a été adapté par le laboratoire Howe pour étudier le comportement durotactic des cellules cancéreuses ovariennes SKOV-3 et les mécanismes moléculaires qui sous-durotaxis17. En outre, une méthode modifiée est décrite pour la fabrication d'hydrogels avec une seule couche uniforme de microsphères fluorescentes près de la surface de la culture cellulaire; cela facilite la visualisation et l'optimisation des gradients de tension générés par micropipette et peut permettre l'évaluation de la contractilité cellulaire par microscopie de force de traction.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylamide 40 %&#160;</td>
			<td>National Diagnostic</td>
			<td>EC-810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP179-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD20A High frequency generator</td>
			<td>Electro Technic Products</td>
			<td>12011A</td>
			<td>115 V -&#160;Handheld Corona Wand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bind Silane (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane) (</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-acrylamide 2%&#160;</td>
			<td>National Diagnostic</td>
			<td>EC-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 2510 Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Bransonic</td>
			<td></td>
			<td>40 kHz frequency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coarse Manipulator</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MC35A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM without phenol red</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Stage Glass Micropipette Puller</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco-aaper</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (Qualified One Shot)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A31606-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>FC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluospheres Carboxylate 0.2 um&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8810, F8807, F8811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene 6</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1815091</td>
			<td>1.5 ug DNA / 6uL fugene 6 per 35mm dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38SI-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Dish</td>
			<td>CellVis</td>
			<td>D60-60-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslip</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72224-01</td>
			<td>22 mm, #1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>9535-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III&#160;Special cleaning concentrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z805939</td>
			<td>Used at 2% in ddH2O for cleaning coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES powder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Make 50mM HEPES buffer, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intelli-Ray 400 Shuttered UV Flood Light</td>
			<td>Uviton International</td>
			<td>UV0338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A417-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MF900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MHW3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanopure Life Science UV/UF System</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>D11931</td>
			<td>ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Bemis Company, Inc</td>
			<td>PM-992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>139 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 28.6 mM Na2HPO4, 1.6 mM KH2PO4, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ref52</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rat embryonic fibroblast cell line; Culture in DMEM + 10% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringer&#39;s Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>134 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2.4 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 5 mM D-Glucose, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKOV-3</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td></td>
			<td>Culture in DMEM + 10% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH&#160;</td>
			<td>Covachem</td>
			<td>&#160;12414-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281-50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell durotaxis assay for assessing mechanical control of cellular movement and related signaling events

Durotaxis est le processus par lequel les cellules détectent et réagissent aux gradients de tension. Afin d'étudier ce processus in vitro, la rigidité du substrat sous-jacent à une cellule doit être manipulée. Tandis que les hydrogels avec la rigidité graduée et les essais à long terme de migration se sont avérés utiles dans des études de durotaxis, les réponses immédiates et aigues aux changements locaux dans la tension de substrat permettent l'étude focalisée des mouvements individuels de cellules et des événements subcellulaires de signalisation. Pour tester à répétition la capacité des cellules à détecter et à répondre à la rigidité sous-jacente du substrat, une méthode modifiée pour l'application de gradients aigus de tension accrue aux cellules individuelles cultivées sur des hydrogels déformables est utilisée qui permet de temps réel manipulation de la force et de la direction des gradients de rigidité transmis aux cellules en question. En outre, en affinant les détails et les paramètres de l'analyse, tels que la forme et les dimensions de la micropipette ou la position relative, le placement et la direction du gradient appliqué, l'analyse peut être optimisée pour l'étude de tout mécaniquement type et système de cellules sensibles. Ces paramètres peuvent être modifiés pour modifier de manière fiable le stimulus appliqué et élargir la fonctionnalité et la polyvalence de l'analyse. Cette méthode permet l'examen du mouvement durotactic à long terme aussi bien que des changements plus immédiats dans la signalisation cellulaire et la dynamique morphologique en réponse à la rigidité changeante.

En préparant des micropipettes (figure 1) et en normalisant la génération de force des tractions (figure 2 et figure 3) comme décrit ci-dessus, des conditions durotactiques optimales ont été identifiées pour plusieurs lignées cellulaires. À l'aide de cette technique, telle qu'elle est décrite à la figure 4, les cellules cancéreuses ovariennes SKOV-317 et les fibroblas...

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Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events

Les forces mécaniques sont importantes pour contrôler la migration cellulaire. Ce protocole démontre l'utilisation d'hydrogels élastiques qui peuvent être déformés à l'aide d'une micropipette en verre et d'un micromanipulateur pour stimuler les cellules avec un gradient de rigidité local pour provoquer des changements dans la structure cellulaire et la migration.

Exemple de Durotaxis à cellule unique pour évaluer le contrôle mécanique du mouvement cellulaire et les événements de signalisation connexes

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate ...

On apprécie de plus en plus l’impact du microenvironnement mécanique sur la signalisation cellulaire et la migration. Nécessité de l’utilisation d’approches expérimentales uniques pour fournir une stimulation mécanique à chaque cellule. Cette technique permet la manipulation dynamique du micro-environnement mécanique sous une cellule en temps réel.Permettre l’observation de changements mécaniquement réglementés dans le comportement de migration cellulaire, et les événements de signalisation sous-cellulaire. Nyla Naim, post-doc, et Johnathan Patterson, technicien de notre laboratoire, feront la démonstration de la procédure avec moi. Commencez par utiliser un Chorono-1 pour activer la surface vitrée de chaque glissement de couverture inférieure pendant 20 secondes, avant de sur-poser immédiatement 50 microlitres de solution de travail de liaison silane sur chaque glissement de couvercle.Laisser sécher la solution pendant 10 minutes avant de rincer le couvercle glisse deux fois avec 95% d’éthanol et deux fois avec de l’isopropanol. Ensuite, laissez le couvercle glisser à l’air sec pendant environ 20 minutes. Pour le dépôt fluorescent de micro-perles, soniquez d’abord la solution de micro-perle de travail pendant une heure.15 minutes avant la fin de la sonication, placez le couvercle activé glisse verticalement dans un porte-feuillet de couvercle en céramique et transférez le support dans un nettoyant plasma à table pour un traitement plasma air-pièce pendant trois minutes. Ensuite, placez des morceaux de film de paraffine dans des couvercles de boîte de Petri de 60 millilitres, et placez les feuillets de couverture sur les films, tapant légèrement chaque glissement de couverture pour assurer un bon contact entre le film et le coverslip. Ensuite, ajoutez 150 microlitres de la solution de perles de travail au sommet de chaque coverslip, et aspirez immédiatement la solution d’éthanol du côté des coverslips, laissant les perles sur le coverslip.Pour lancer les Hydrogels immédiatement après leur préparation, ajouter une gouttelette de 25 microlitres de solution Hydrogel sur le côté activé de chaque coverslip inférieur, et retourner immédiatement les couvre-coverslips dessus perlés, côté perle vers le bas, sur la gouttelette. Laisser les gels polymériser pendant 30 minutes avant d’utiliser des forceps pour enlever délicatement les coverslips. Ensuite, rincer les gels avec trois lavages de cinq minutes dans 50 hepes miliMoler frais par lavage.Pour activer les surfaces Hydrogels, incuber les gels dans 50 hepes miliMoler frais, complétés par 0,4 miliMolar Sulfo Sanpah, et exposer immédiatement les gels à une lampe à arc ultraviolet dans une zone fermée pendant 90 secondes. À la fin de l’activation, laver les gels avec trois lavages de cinq minutes dans des hepes fraîches, et traiter les Hydrogels activés avec 20 microgrammes par millilitre de fibronectine pendant une heure à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, aspirer l’excès de solution de fibronectine et laver les gels trois fois en PBS pendant cinq minutes par lavage.Après le dernier lavage, placer les Hydrogels dans un petit volume de PBS et stériliser les gels pendant 15 minutes sous la lumière ultra-violette dans une hotte de culture tissulaire. Ensuite, lavez les gels une fois dans pbs frais. Pour le placage cellulaire, les graines 2,1 fois 10 les quatre cellules d’intérêt dans trois millilitres de moyen par Hydrogel et permettent aux cellules d’adhérer à 37 degrés Celsius pendant quatre à 18 heures.Pendant que les cellules équilibrent, utilisez un tireur de micro-pipette pour tirer un diamètre d’un millimètre par micro-pipette en verre borosilicate de 100 millimètres de long, pour obtenir un cône de plus de deux millimètres de diamètre qui réduit à environ 50 micromètres de diamètre dans le premier millimètre, et s’étend à un long tube parallèle de 10 micromètres de diamètre dans le dernier millimètre. Ensuite, chargez la pipette dans un microforge et façonnez la pipette pour avoir une pointe émoussée de 15 micromètres qui est enfermée à l’extrémité d’une section de 250 micromètres, pliée à environ 35 degrés ange du reste de la pipette. Le diamètre approximatif à la courbure doit être d’environ 30 micromètres pour donner de la force à la pointe.Ensuite, placez un Hydrogel sur la scène d’un microscope inversé. Couvrir le milieu d’huile minérale et sélectionner l’objectif 10x. Stériliser la micro-pipette préparée avec l’alcool à 70%.Ensuite, insérez dans le support de micro-pipette avec le crochet pointé vers le plat, et utilisez le manipulateur de cours pour abaisser la pipette jusqu’à ce que le crochet touche juste la surface du liquide. Concentrez le microscope sur les cellules adhéré au dessus du gel, et en prenant soin que l’objectif n’est pas en danger de frapper l’échantillon ou le stade, amener la mise au point au-dessus du gel pour trouver la pointe de la micro-pipette. Faites pivoter la pipette jusqu’à ce que la pointe soit perpendiculaire au plan focal, de sorte que l’extrémité émoussée de la micro-pipette soit pointée vers le bas, et recentrer sur la pointe de la pipette au besoin.Concentrez-vous vers le bas à la couche cellulaire pour évaluer la distance de la pipette est de la surface du gel, et se concentrer de nouveau à un plan qui est à mi-chemin entre le gel et la pointe de pipette. Ensuite, abaissez lentement la pipette pour atteindre le plan focal intermédiaire, et augmentez le grossissement à celui qui sera utilisé dans l’expérience, avant d’abaisser la pipette jusqu’à ce qu’elle plane juste au-dessus de la surface de l’Hydrogel. Pour l’étalonnage du micro-manipulateur, imagez une zone dépourvue de cellules, une zone avec des perles, mais pas de manipulation, avec la pipette engageant le gel, et avec la pipette engagée tirant le gel.Ensuite, utilisez l’image J pour comparer les champs sans perles aux champs de perles sans engagement, les champs de perles avec le gel engagé, et le gel tiré pour calculer les déplacements relatifs de perles et la force appliquée sur les gels. Pour effectuer un essai de durotaxis, surveillez un groupe de cellules pendant 30 minutes pour identifier les cellules qui se déplacent d’une manière dirigée. Sélectionnez une cellule qui se déplace régulièrement dans une direction et surveillez les cellules de la fréquence d’image désirée pendant 30 minutes supplémentaires.Ensuite, placez la pipette à environ 50 micromètres devant le côté proche du bord d’attaque de la cellule sélectionnée, et déplacez le micro-manipulateur de telle sorte que le gel soit déformé orthogonally à la direction de la cellule de voyage. Ensuite, observez la cellule au fil du temps car elle répond au gradient aigu et local de la rigidité Hydrogel. En utilisant cette technique comme démontré, les fibroblastes embryonnaires de rat se déplacent vers la rigidité accrue dans les gradients appliqués par une micro-pipette en verre.Les cellules embryonnaires de fibroblaste de rat, exprimant transitoirement le capteur de tension de vinculin sur 125 gels kilopascal de polyacrylamide démontrent également la formation des adhérences focales dans les directions de l’étirement sur une période de 40 minutes. L’analyse de transfert d’énergie de résonance de Forster indique que la vinculine localisée aux adhérences focales éprouve un changement immédiat de tension, une fois présenté avec une stimulation durotactic aiguë. Étendre l’utilité de cet essai à l’observation d’événements de signalisation sous-cellulaires, en réponse à la stimulation durotactic.Si vous faites plusieurs tentatives pour étirer une cellule, ou si le microneedle glisse pendant l’analyse, recommencez avec une nouvelle cellule pour éviter de transmettre plusieurs stimuli mécaniques variables. Au-delà de son utilité pour l’analyse durotaxis, cette technique peut être combinée avec des approches génétiques, telles que les biocapteurs, RNAI, ou l’édition de gènes pour aider à délimifier les mécanismes moléculaires impliqués dans la mécanotransduction.

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