Name: single cell durotaxis assay for assessing mechanical control of cellular movement and related signaling events
Uploaded: 2019-08-27T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events at JoVE.com

1. Herstellung von verformbaren Polyacrylamid-Hydrogelen mit eingebetteten fluoreszierenden Mikrosphären
HINWEIS: Anfahrt s. Beschreibung der Polymerisation eines 25 kPa Hydrogels mit einem Durchmesser von 22 m und einer Dicke von ca. 66 m. Jeder oder alle dieser Parameter können geändert werden, und die Anweisungen hierzu finden Sie in Tabelle 1 und in den Anmerkungen17.
<ol><li>Aktivierung von Glasbodenschalen oder Deckel...

<ol>
	<li>Acerbi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+breast+cancer+invasion+and+aggression+correlates+with+ECM+stiffening+and+immune+cell+infiltration.">Human breast cancer invasion and aggression correlates with ECM stiffening and immune cell infiltration.</a> Integrative Biology (Camb. 7 (10), 1120-1134 (2015).</li><li>Mekhdjian, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-mediated+traction+force+enhances+paxillin+molecular+associations+and+adhesion+dynamics+that+increase+the+invasiveness+of+tumor+cells+into+a+three-dimensional+extracellular+matrix.">Integrin-mediated traction force enhances paxillin molecular associations and adhesion dynamics that increase the invasiveness of tumor cells into a three-dimensional extracellular matrix.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (11), 1467-1488 (2017).</li><li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype.">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li><li>Lange, J. R., Fabry, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+tissue+mechanics+in+cell+migration.">Cell and tissue mechanics in cell migration.</a> Experimental Cell Research. 319 (16), 2418-2423 (2013).</li><li>Davidson, L. A., Oster, G. F., Keller, R. E., Koehl, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+mechanical+properties+of+the+blastula+wall+reveal+which+hypothesized+mechanisms+of+primary+invagination+are+physically+plausible+in+the+sea+urchin+Strongylocentrotus+purpuratus.">Measurements of mechanical properties of the blastula wall reveal which hypothesized mechanisms of primary invagination are physically plausible in the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus.</a> Developmental Biology. 209 (2), 221-238 (1999).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mechanical+factors+in+fate+decisions+of+stem+cells.">Role of mechanical factors in fate decisions of stem cells.</a> Regenerative Medicine. 6 (2), 229-240 (2011).</li><li>Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+stiffness+dictates+development,+homeostasis,+and+disease+progression.">Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression.</a> Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).</li><li>Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+movement+is+guided+by+the+rigidity+of+the+substrate.">Cell movement is guided by the rigidity of the substrate.</a> Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).</li><li>Kuo, C. H., Xian, J., Brenton, J. D., Franze, K., Sivaniah, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+stiffness+gradient+substrates+for+studying+mechanotactic+cell+migration.">Complex stiffness gradient substrates for studying mechanotactic cell migration.</a> Advanced Materials. 24 (45), 6059-6064 (2012).</li><li>Breckenridge, M. T., Desai, R. A., Yang, M. T., Fu, J., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrates+with+engineered+step+changes+in+rigidity+induce+traction+force+polarity+and+durotaxis.">Substrates with engineered step changes in rigidity induce traction force polarity and durotaxis.</a> Cell and Molecular Bioengineering. 7 (1), 26-34 (2014).</li><li>Goreczny, G. J., Wormer, D. B., Turner, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+System+for+Evaluating+Cell+Mechanosensing+and+Durotaxis+In+Vitro.">A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e52949 (2015).</li><li>Hartman, C. D., Isenberg, B. C., Chua, S. G., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+cell+durotaxis+depends+on+extracellular+matrix+composition.">Vascular smooth muscle cell durotaxis depends on extracellular matrix composition.</a> Proceedings of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 113 (40), 11190-11195 (2016).</li><li>Vincent, L. G., Choi, Y. S., Alonso-Latorre, B., del Alamo, J. C., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+durotaxis+depends+on+substrate+stiffness+gradient+strength.">Mesenchymal stem cell durotaxis depends on substrate stiffness gradient strength.</a> Biotechnology Journal. 8 (4), 472-484 (2013).</li><li>Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+hydrogels+with+steep+stiffness+gradients+for+studying+cell+mechanical+response.">Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response.</a> PLoS One. 7 (10), e46107 (2012).</li><li>Martinez, J. S., Lehaf, A. M., Schlenoff, J. B., Keller, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+durotaxis+on+polyelectrolyte+multilayers+with+photogenerated+gradients+of+modulus.">Cell durotaxis on polyelectrolyte multilayers with photogenerated gradients of modulus.</a> Biomacromolecules. 14 (5), 1311-1320 (2013).</li><li>Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+fluctuations+within+focal+adhesions+mediate+ECM-rigidity+sensing+to+guide+directed+cell+migration.">Force fluctuations within focal adhesions mediate ECM-rigidity sensing to guide directed cell migration.</a> Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).</li><li>McKenzie, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+microenvironment+regulates+ovarian+cancer+cell+morphology,+migration,+and+spheroid+disaggregation.">The mechanical microenvironment regulates ovarian cancer cell morphology, migration, and spheroid disaggregation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7228 (2018).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Grashoff, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mechanical+tension+across+vinculin+reveals+regulation+of+focal+adhesion+dynamics.">Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics.</a> Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).</li><li>McKenzie, A. J., Campbell, S. L., Howe, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+A+activity+and+anchoring+are+required+for+ovarian+cancer+cell+migration+and+invasion.">Protein kinase A activity and anchoring are required for ovarian cancer cell migration and invasion.</a> PLoS One. 6 (10), e26552 (2011).</li><li>Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyacrylamide+hydrogels+for+cell+mechanics:+steps+toward+optimization+and+alternative+uses.">Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses.</a> Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).</li><li>Plotnikov, S. V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+traction+force+microscopy.">High-resolution traction force microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 123, 367-394 (2014).</li><li>Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+localizing+reporter+fluorescent+beads+near+the+cell+culture+surface+for+traction+force+microscopy.">A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), 51873 (2014).</li></ol>

Hier wird ein wiederholbarer, einzelliger Durotaxis-Assay gezeigt, der die Beurteilung der Fähigkeit einer Zelle ermöglicht, ihr Migrationsverhalten als Reaktion auf akute mechanische Hinweise zu ändern. Diese Technik kann auch in Kombination mit Fluoreszenzmikroskopie und geeigneten Fusionsproteinen oder Biosensoren eingesetzt werden, um subzelluläre Signalisierung und zytoskelettale Ereignisse innerhalb von Sekunden nach mechanischer Stimulation oder über einen längeren Zeitraum während der durotaktische Bewegun...

In den letzten Jahrzehnten hat die Bedeutung der mechanischen Eigenschaften der Umgebung einer Zelle in der Zellbiologie zunehmend Anerkenntnis gefunden. Verschiedene Gewebe und extrazelluläre Matrizen haben unterschiedliche relative Steifigkeiten und, wie Zellen im ganzen Körper wandern, navigieren sie diese Veränderungen, mit diesen mechanischen Eigenschaften, um sie zu führen1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7. Zellen verwenden die Steifigkeit eines gegebenen Gewebes, um ihr motileverhalten während Vonprozessen wie Entwicklung, Wundheilung und Krebsmetastasierung zu informieren. Die molekularen Mechanismen, die das Aufsehen und die Reaktion auf diese mechanischen Eingänge ermöglichen, bleiben jedoch weitgehend unbekannt1,2,3,4,5, 6 , 7.
Um die Mechanismen zu untersuchen, durch die Zellen auf physikalische Umwelthinweise reagieren, muss die Steifigkeit oder Steifigkeit des Substrats, das den anhaftenden Zellen zugrunde liegt, manipuliert werden. Im Jahr 2000 entwickelten Chun-Min Lo, Yu-Li Wang und Kollegen einen Assay 8, bei dem die motile Reaktion einer einzelnen Zelle auf wechselnde mechanische Hinweise direkt durch Dehnen verformbarer extrazellulärer Matrix (ECM)-beschichteter Polyacrylamid getestet werden konnte. Hydrogele, auf denen die Zellen plattiert wurden. Zellen weisen eine signifikante Präferenz für die Migration zu steiferen Substraten auf, ein Phänomen, das sie als "Durotaxis" bezeichneten.
Seit dem ursprünglichen Bericht im Jahr 2000 wurden viele andere Techniken für die Untersuchung von Durotaxis eingesetzt. Steile Steifigkeitsgradienten wurden hergestellt, indem Gele über starre Merkmale wie Polystyrolperlen9 oder steife Polymerpfosten10 gegossen wurden oder indem das Substrat um die Ränder eines Glasdeckels11 polymerisiert wurde, um mechanische ' Schrittgrenzen". Alternativ wurden Hydrogele mit flacheren, aber festen Steifigkeitsgradienten durch eine Vielzahl von Methoden hergestellt, wie z. B. Gradienten von Vernetzern, die durch mikrofluidische Vorrichtungen12,13 oder nebeneinander gebaute Hydrogellösungströpfchen erzeugt werden. mit unterschiedlicher Steifigkeit8oder Hydrogele mit photoreaktivem Vernetzen, die mit abgestufter UV-Lichtbelichtung behandelt werden, um einen linearen Steifigkeitsgradienten14,15zu erzeugen. Diese Techniken wurden mit großer Wirkung verwendet, um durotaktische zelluläre Bewegung en masse im Laufe der Zeit zu untersuchen. In der Regel werden diese Features jedoch im Vorfeld der Zellbeschichtung hergestellt, und ihre Eigenschaften bleiben im Laufe des Experiments konsistent und stützen sich auf zufällige Zellbewegungen für die Probenahme mechanischer Gradienten. Keine dieser Techniken ist für die Beobachtung schneller Veränderungen des zellulären Verhaltens als Reaktion auf akute mechanische Reize geeignet.
Um zelluläre Reaktionen auf akute Veränderungen in der mechanischen Umgebung zu beobachten, bieten Einzelzelldurotaxis-Assays mehrere Vorteile. In diesen Assays erhalten einzelne Zellen einen akuten, mechanischen Stimulus, indem sie das darunter liegende Substrat mit einer Glasmikropipette aus der Zelle herausziehen und so einen Richtungsgradienten der Zellmatrixspannung einführen. Veränderungen des motilen Verhaltens, wie Geschwindigkeit oder Migrationsrichtung, werden dann durch die Live-Zell-Phasenkontrastmikroskopie beobachtet. Dieser Ansatz erleichtert die direkte Beobachtung von Ursache-Wirkungs-Beziehungen zwischen mechanischen Reizen und Zellmigration, da er eine schnelle, iterative Manipulation der Richtung und Größe des Spannungsgradienten und die Bewertung der daraus resultierenden zelluläre Reaktionen in Echtzeit. Darüber hinaus kann diese Methode auch verwendet werden, um Zellen, die fluoreszierende Fusionsproteine oder Biosensoren exezieren, mechanisch zu stimulieren, um Veränderungen in Menge, Aktivität oder subzellulärer Lokalisierung von Proteinen zu visualisieren, die im Verdacht stehen, an mechanosensing und durotaxis.
Diese Technik wurde von Gruppen eingesetzt, die Durotaxis8,16 studieren und wird hier beschrieben, da sie vom Howe Laboratory angepasst wurde, um das durotaktische Verhalten von SKOV-3 Eierstockkrebszellen und die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die unter ly durotaxis17. Zusätzlich wird ein modifiziertes Verfahren für die Herstellung von Hydrogelen mit einer einzigen, gleichmäßigen Schicht fluoreszierender Mikrosphären in der Nähe der Zellkulturoberfläche beschrieben; Dies erleichtert die Visualisierung und Optimierung von mikropipettegenerierten Dehnungsgradienten und kann die Beurteilung der Zellkontraktilität durch Traktionskraftmikroskopie ermöglichen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylamide 40 %&#160;</td>
			<td>National Diagnostic</td>
			<td>EC-810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP179-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD20A High frequency generator</td>
			<td>Electro Technic Products</td>
			<td>12011A</td>
			<td>115 V -&#160;Handheld Corona Wand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bind Silane (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane) (</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-acrylamide 2%&#160;</td>
			<td>National Diagnostic</td>
			<td>EC-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 2510 Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Bransonic</td>
			<td></td>
			<td>40 kHz frequency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coarse Manipulator</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MC35A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM without phenol red</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Stage Glass Micropipette Puller</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco-aaper</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (Qualified One Shot)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A31606-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>FC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluospheres Carboxylate 0.2 um&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8810, F8807, F8811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene 6</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1815091</td>
			<td>1.5 ug DNA / 6uL fugene 6 per 35mm dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38SI-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Dish</td>
			<td>CellVis</td>
			<td>D60-60-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslip</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72224-01</td>
			<td>22 mm, #1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>9535-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III&#160;Special cleaning concentrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z805939</td>
			<td>Used at 2% in ddH2O for cleaning coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES powder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Make 50mM HEPES buffer, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intelli-Ray 400 Shuttered UV Flood Light</td>
			<td>Uviton International</td>
			<td>UV0338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A417-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MF900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MHW3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanopure Life Science UV/UF System</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>D11931</td>
			<td>ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Bemis Company, Inc</td>
			<td>PM-992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>139 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 28.6 mM Na2HPO4, 1.6 mM KH2PO4, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ref52</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rat embryonic fibroblast cell line; Culture in DMEM + 10% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringer&#39;s Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>134 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2.4 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 5 mM D-Glucose, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKOV-3</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td></td>
			<td>Culture in DMEM + 10% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH&#160;</td>
			<td>Covachem</td>
			<td>&#160;12414-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281-50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell durotaxis assay for assessing mechanical control of cellular movement and related signaling events

Durotaxis ist der Prozess, durch den Zellen Spannungsverspannungen erkennen und darauf reagieren. Um diesen Prozess in vitro zu untersuchen, muss die Steifigkeit des einer Zelle zugrunde liegenden Substrats manipuliert werden. Während sich Hydrogele mit abgestufter Steifigkeit und Langzeit-Migrationstests in Durotaxis-Studien als nützlich erwiesen haben, ermöglichen sofortige, akute Reaktionen auf lokale Veränderungen der Substratspannung eine gezielte Untersuchung einzelner Zellbewegungen und subzellulärer Signalereignisse. Um die Fähigkeit der Zellen, die zugrunde liegende Substratsteifigkeit zu erkennen und darauf zu reagieren, zu testen, wird eine modifizierte Methode zur Anwendung akuter Verspannungen erhöhter Spannung auf einzelne Zellen verwendet, die auf verformbaren Hydrogelen kultiviert werden und echtzeitfähig sind. Manipulation der Festigkeit und Richtung der SteifigkeitGradienten, die den betreffenden Zellen vermittelt werden. Durch feinabstimmung der Details und Parameter des Assays, wie Form und Abmessungen der Mikropipette oder der relativen Position, Platzierung und Richtung des angewendeten Gradienten, kann der Assay für die Untersuchung jeder mechanisch empfindlichen Zelltyp und -system. Diese Parameter können geändert werden, um den angewendeten Stimulus zuverlässig zu verändern und die Funktionalität und Vielseitigkeit des Assays zu erweitern. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung sowohl der langfristigen durotaktischen Bewegung als auch unmittelbarerer Veränderungen der zellulären Signalisierung und morphologischen Dynamik als Reaktion auf sich ändernde Steifigkeit.

Durch die Vorbereitung von Mikropipetten (Abbildung 1) und die Normalisierung der Krafterzeugung der Züge (Abbildung 2 und Abbildung 3), wie oben beschrieben, wurden optimale durotaktische Bedingungen für mehrere Zelllinien identifiziert. Mit dieser Technik, wie in Abbildung 4beschrieben, bewegen sich sowohl die SKOV-3-Ovarialkrebszellen17 als auch die embryonalen Fibroblasten ...

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events at JoVE.com

Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events

Mechanische Kräfte sind wichtig für die Steuerung der Zellmigration. Dieses Protokoll demonstriert die Verwendung von elastischen Hydrogelen, die mit einer Glasmikropipette und einem Mikromanipulator verformt werden können, um Zellen mit einem lokalen Steifigkeitsgradienten zu stimulieren, um Veränderungen in der Zellstruktur und Migration hervorzurufen.

Einzelzelle Durotaxis Assay zur Beurteilung der mechanischen Steuerung der zellulären Bewegung und verwandter Signalereignisse

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate ...

Die Auswirkungen der mechanischen Mikroumgebung auf die Zellsignalisierung und -migration nehmen zu. Die Verwendung einzigartiger, experimenteller Ansätze zur mechanischen Stimulation einzelner Zellen ist erforderlich. Diese Technik ermöglicht die dynamische Manipulation der mechanischen Mikroumgebung unter einer Zelle in Echtzeit.Ermöglicht die Beobachtung mechanisch regulierter Veränderungen des Zellmigrationsverhaltens und subzellulärer Signalereignisse. Mit mir wird das Verfahren demonstriert: Nyla Naim, ein Post-Doc, und Johnathan Patterson, ein Techniker aus unserem Labor. Beginnen Sie mit einem Chorono-1, um die Glasoberfläche jedes Bodendeckels für 20 Sekunden zu aktivieren, bevor Sie sofort 50 Mikroliter Bindesilan-Arbeitslösung auf jeden Deckelschlupf überlagern.Lassen Sie die Lösung für 10 Minuten trocknen, bevor sie die Abdeckung zweimal mit 95% Ethanol und zweimal mit Isopropanol ausrutscht. Lassen Sie dann die Abdeckungsrutschen für ca. 20 Minuten trocknen. Für fluoreszierende Mikroperlenabscheidung die arbeitende Mikroperlenlösung zunächst für eine Stunde beschallen.15 Minuten vor dem Ende der Beschallung die aktivierten Deckelschlupfs vertikal in einen keramischen Deckel-Slip-Halter legen und den Halter für die Raum-Luft-Plasmabehandlung für drei Minuten in einen Tischplasmareiniger geben. Als nächstes legen Sie Paraffinfolien in 60 Milliliter Petrischalendeckel und legen Sie die Deckelschlüpfer auf die Folien, wobei Sie leicht auf jeden Deckelzettel tippen, um einen guten Kontakt zwischen dem Film und dem Coverslip zu gewährleisten. Dann fügen Sie 150 Mikroliter der Arbeitsperlenlösung an die Oberseite jedes Deckellips, und sofort die Ethanol-Lösung von der Seite der Abdeckungslipse aspirieren, so dass die Perlen auf dem Deckelschlupf.Um die Hydrogele unmittelbar nach ihrer Zubereitung zu gießen, fügen Sie ein 25-Mikroliter-Tröpfchen Hydrogel-Lösung auf die aktivierte Seite jedes unteren Deckels und sofort die Perlen-Top-Abdeckungen, Perlenseite nach unten, auf das Tröpfchen kippen. Lassen Sie die Gele 30 Minuten lang polymerisieren, bevor Sie Zangen verwenden, um die Abdeckungen vorsichtig zu entfernen. Dann spülen Sie die Gele mit drei, fünf Minuten Wäscht in frischen 50 MiliMoler Hepes pro Wäsche.Um die Hydrogels-Oberflächen zu aktivieren, bebrüten Sie die Gele in frischen 50-MiliMoler-Hepes, ergänzt durch 0,4-MiliMolar Sulfo Sanpah, und setzen Die Gele sofort einer uvvioletten Bogenlampe in einem geschlossenen Bereich für 90 Sekunden aus. Am Ende der Aktivierung die Gele mit drei, fünf Minuten Wäscht in frischen Hepes waschen und die aktivierten Hydrogele mit 20 Mikrogramm pro Milliliter Fibronectin für eine Stunde bei 37 Grad Celsius behandeln. Am Ende der Inkubation die überschüssige Fibronectin-Lösung ansaugen und die Gele dreimal in PBS für fünf Minuten pro Wäsche waschen.Nach der letzten Wäsche die Hydrogele in ein kleines PBS-Volumen geben und die Gele 15 Minuten unter ultraviolettem Licht in einer Gewebekulturhaube sterilisieren. Dann waschen Sie die Gele einmal in frischem PBS. Für die Zellbeschichtung, Samen 2,1 mal 10 die vier Zellen von Interesse in drei Milliliter Medium pro Hydrogel und lassen Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für vier bis 18 Stunden haften.Während die Zellen ausgeglichen sind, verwenden Sie einen Mikropipettenzieher, um einen einen Millimeter Durchmesser von 100 Millimetern länge Borosilikatglas-Mikropipette zu ziehen, um eine Verjüngung von über zwei Millimetern zu erhalten, die im ersten Millimeter einen Durchmesser von etwa 50 Mikrometern reduziert und sich bis zu einem langen, parallelen Rohr mit einem Durchmesser von 10 Mikrometern im letzten Millimeter erstreckt. Als nächstes laden Sie die Pipette in eine Mikroschmiede und formen Sie die Pipette so, dass sie eine 15 Mikrometer stumpfe Spitze hat, die ganz am Ende eines 250-Mikrometer-Abschnitts eingeschlossen ist und etwa 35 Grad vom Rest der Pipette gebogen wird. Der ungefähre Durchmesser an der Biegung sollte etwa 30 Mikrometer betragen, um der Spitze Festigkeit zu verleihen.Als nächstes legen Sie einen Hydrogel auf die Bühne eines invertierten Mikroskops. Bedecken Sie das Medium mit Mineralöl und wählen Sie das 10-fache Objektiv. Sterilisieren Sie die vorbereitete Mikropipette mit dem 70%-Alkohol.Dann setzen Sie in die Mikro-Pipettenhalter mit dem Haken in Richtung der Schale, und verwenden Sie den Kurs Manipulator, um die Pipette zu senken, bis der Haken nur die Oberfläche der Flüssigkeit berührt. Konzentrieren Sie das Mikroskop auf die Zellen, die an der Oberseite des Gels haften, und achten Sie darauf, dass das Objektiv nicht gefahr ist, die Probe oder das Stadium zu treffen, bringen Sie den Fokus über das Gel, um die Spitze der Mikropipette zu finden. Drehen Sie die Pipette so lange, bis die Spitze senkrecht zur Brennebene ist, so dass die abgestumpfte Spitze der Mikropipette nach unten zeigt, und konzentrieren Sie sich bei Bedarf wieder auf die Spitze der Pipette.Konzentrieren Sie sich zurück zur Zellschicht, um zu messen, wie weit die Pipette von der Geloberfläche entfernt ist, und fokussieren Sie sich wieder auf eine Ebene, die teilweise zwischen dem Gel und der Pipettespitze liegt. Dann senken Sie langsam die Pipette, um die mittlere Fokalebene zu erreichen, und erhöhen Sie die Vergrößerung zu der, die im Experiment verwendet wird, bevor Sie die Pipette senken, bis sie knapp über der Oberfläche des Hydrogels schwebt. Für die Mikromanipulatorkalibrierung, Bild einen Bereich ohne Zellen, ein Bereich mit Perlen, aber keine Manipulation, mit der Pipette das Gel zu engagieren, und mit der engagierten Pipette ziehen das Gel.Verwenden Sie dann Bild J, um die Keine-Perlen-Felder mit den Perlenfeldern ohne Eingriff, die Perlenfelder mit dem eingelegten Gel und das gezogene Gel zu vergleichen, um die relativen Perlenverschiebungen und die Auftriebskraft auf die Gele zu berechnen. Um einen Durotaxis-Assay durchzuführen, überwachen Sie eine Gruppe von Zellen für 30 Minuten, um Zellen zu identifizieren, die sich in einer gerichteten Weise bewegen. Wählen Sie eine Zelle aus, die sich ständig in eine Richtung bewegt, und überwachen Sie die Zellen der gewünschten Bildrate für weitere 30 Minuten.Als nächstes positionieren Sie die Pipette etwa 50 Mikrometer vor der nahen Seite der Vorderkante der ausgewählten Zelle, und bewegen Sie den Mikromanipulator so, dass das Gel orthogonal in die Fahrtrichtung der Zelle verformt wird. Beobachten Sie dann die Zelle im Laufe der Zeit, während sie auf den akuten, lokalen Gradienten der Hydrogel-Steifigkeit reagiert. Mit dieser Technik, wie gezeigt, bewegen sich die embryonalen Fibroblasten der Ratte in Richtung der erhöhten Steifigkeit in Gradienten, die von einer Glas-Mikropipette aufgebracht werden.Ratter-embryonale Fibroblastenzellen, die auf 125 Kilopascal-Polyacrylamid-Gelen vorübergehend Vinkulin-Spannungssensor exprimieren, zeigen auch die Bildung von Fokaladesionen in den Richtungen der Dehnung über einen Zeitraum von 40 Minuten. Die Forster Resonance Energy Transfer Analyse zeigt, dass Vinculin lokalisiert zu fokalen Adhäsionen eine sofortige Veränderung der Spannung erlebt, wenn sie mit einer akuten durotaktischen Stimulation präsentiert wird. Erweiterung des Nutzens dieses Assays auf die Beobachtung subzellulärer Signalereignisse als Reaktion auf die durotaktische Stimulation.Wenn Sie mehrere Versuche unternehmen, eine Zelle zu dehnen, oder wenn die Mikronadel während des Testes rutscht, beginnen Sie mit einer neuen Zelle, um zu vermeiden, dass mehrere, variable, mechanische Reize übertragen werden. Abgesehen von ihrem Nutzen für die Assaying-Durotaxis kann diese Technik mit genetischen Ansätzen wie Biosensoren, RNAI oder Genbearbeitung kombiniert werden, um die molekularen Mechanismen der Mechanotransduktion abzugrenzen.

Research

JoVE Journal

Biology

Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay

Zelluläre Toxizität von Nanogenomedicine in MCF-7 Zelllinie: MTT-Assay

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based ...

Forschung

Biologie

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Imaging G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR)-vermittelten Signaltransduktion, die Steuerung der Chemotaxis Dictyostelium discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

FRET-Mikroskopie zur Echtzeit-Überwachung der Signalisierung Events in lebenden Zellen mit unimolekularen Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

Eine Explantation Assay zur Beurteilung Cellular Verhalten des Cranial Mesenchym

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Mechanische Stimulation induzierte Calcium Wellenausbreitung in Zellmonoschichten: Das Beispiel Bovine Endothelzellen

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Einzellige Mikroinjektions für Zellkommunikationsanalyse

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

Ein vereinfachtes System zur Bewertung der Zell Mechanosensing und Durotaxis<em&gt; In-vitro-</em

The composition and mechanical properties of the extracellular matrix are highly variable between tissue types. This connective tissue stroma diversity ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Räumlich-zeitliche Analyse von zytokinetischen Events in Spalthefe

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Einzellige mikrofluidischen Analyse von Bacillus subtilis

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers ...