Name: single cell durotaxis assay for assessing mechanical control of cellular movement and related signaling events
Uploaded: 2019-08-27T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events at JoVE.com

1. ייצור פוליאקרילאמיד הידרולים עם מיקרוספירות פלורסנט מוטבעות
הערה: כיוונים מתארים פולימריזציה של 25 kPa הידרוג'ל כי הוא 22 יקרומטר קוטר ו כ 66 יקרומטר עבה. כל אחד או כל הפרמטרים האלה יכול להיות שונה והוראות לעשות זאת ניתן למצוא בטבלה 1 ובהערות17.
<...

<ol>
	<li>Acerbi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+breast+cancer+invasion+and+aggression+correlates+with+ECM+stiffening+and+immune+cell+infiltration.">Human breast cancer invasion and aggression correlates with ECM stiffening and immune cell infiltration.</a> Integrative Biology (Camb. 7 (10), 1120-1134 (2015).</li><li>Mekhdjian, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-mediated+traction+force+enhances+paxillin+molecular+associations+and+adhesion+dynamics+that+increase+the+invasiveness+of+tumor+cells+into+a+three-dimensional+extracellular+matrix.">Integrin-mediated traction force enhances paxillin molecular associations and adhesion dynamics that increase the invasiveness of tumor cells into a three-dimensional extracellular matrix.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (11), 1467-1488 (2017).</li><li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype.">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li><li>Lange, J. R., Fabry, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+tissue+mechanics+in+cell+migration.">Cell and tissue mechanics in cell migration.</a> Experimental Cell Research. 319 (16), 2418-2423 (2013).</li><li>Davidson, L. A., Oster, G. F., Keller, R. E., Koehl, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+mechanical+properties+of+the+blastula+wall+reveal+which+hypothesized+mechanisms+of+primary+invagination+are+physically+plausible+in+the+sea+urchin+Strongylocentrotus+purpuratus.">Measurements of mechanical properties of the blastula wall reveal which hypothesized mechanisms of primary invagination are physically plausible in the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus.</a> Developmental Biology. 209 (2), 221-238 (1999).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mechanical+factors+in+fate+decisions+of+stem+cells.">Role of mechanical factors in fate decisions of stem cells.</a> Regenerative Medicine. 6 (2), 229-240 (2011).</li><li>Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+stiffness+dictates+development,+homeostasis,+and+disease+progression.">Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression.</a> Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).</li><li>Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+movement+is+guided+by+the+rigidity+of+the+substrate.">Cell movement is guided by the rigidity of the substrate.</a> Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).</li><li>Kuo, C. H., Xian, J., Brenton, J. D., Franze, K., Sivaniah, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+stiffness+gradient+substrates+for+studying+mechanotactic+cell+migration.">Complex stiffness gradient substrates for studying mechanotactic cell migration.</a> Advanced Materials. 24 (45), 6059-6064 (2012).</li><li>Breckenridge, M. T., Desai, R. A., Yang, M. T., Fu, J., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrates+with+engineered+step+changes+in+rigidity+induce+traction+force+polarity+and+durotaxis.">Substrates with engineered step changes in rigidity induce traction force polarity and durotaxis.</a> Cell and Molecular Bioengineering. 7 (1), 26-34 (2014).</li><li>Goreczny, G. J., Wormer, D. B., Turner, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+System+for+Evaluating+Cell+Mechanosensing+and+Durotaxis+In+Vitro.">A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e52949 (2015).</li><li>Hartman, C. D., Isenberg, B. C., Chua, S. G., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+cell+durotaxis+depends+on+extracellular+matrix+composition.">Vascular smooth muscle cell durotaxis depends on extracellular matrix composition.</a> Proceedings of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 113 (40), 11190-11195 (2016).</li><li>Vincent, L. G., Choi, Y. S., Alonso-Latorre, B., del Alamo, J. C., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+durotaxis+depends+on+substrate+stiffness+gradient+strength.">Mesenchymal stem cell durotaxis depends on substrate stiffness gradient strength.</a> Biotechnology Journal. 8 (4), 472-484 (2013).</li><li>Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+hydrogels+with+steep+stiffness+gradients+for+studying+cell+mechanical+response.">Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response.</a> PLoS One. 7 (10), e46107 (2012).</li><li>Martinez, J. S., Lehaf, A. M., Schlenoff, J. B., Keller, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+durotaxis+on+polyelectrolyte+multilayers+with+photogenerated+gradients+of+modulus.">Cell durotaxis on polyelectrolyte multilayers with photogenerated gradients of modulus.</a> Biomacromolecules. 14 (5), 1311-1320 (2013).</li><li>Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+fluctuations+within+focal+adhesions+mediate+ECM-rigidity+sensing+to+guide+directed+cell+migration.">Force fluctuations within focal adhesions mediate ECM-rigidity sensing to guide directed cell migration.</a> Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).</li><li>McKenzie, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+microenvironment+regulates+ovarian+cancer+cell+morphology,+migration,+and+spheroid+disaggregation.">The mechanical microenvironment regulates ovarian cancer cell morphology, migration, and spheroid disaggregation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7228 (2018).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Grashoff, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mechanical+tension+across+vinculin+reveals+regulation+of+focal+adhesion+dynamics.">Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics.</a> Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).</li><li>McKenzie, A. J., Campbell, S. L., Howe, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+A+activity+and+anchoring+are+required+for+ovarian+cancer+cell+migration+and+invasion.">Protein kinase A activity and anchoring are required for ovarian cancer cell migration and invasion.</a> PLoS One. 6 (10), e26552 (2011).</li><li>Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyacrylamide+hydrogels+for+cell+mechanics:+steps+toward+optimization+and+alternative+uses.">Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses.</a> Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).</li><li>Plotnikov, S. V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+traction+force+microscopy.">High-resolution traction force microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 123, 367-394 (2014).</li><li>Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+localizing+reporter+fluorescent+beads+near+the+cell+culture+surface+for+traction+force+microscopy.">A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), 51873 (2014).</li></ol>

הפגינו כאן היא מערכת הניתן לשחזור, תא בודד שיטת הפעולה המאפשרת הערכה של היכולת של התא לשנות את התנהגותו הגירה בתגובה רמזים מכניים חריפה. טכניקה זו יכולה לשמש גם בשילוב עם מיקרוסקופ פלואורסצנטית וחלבונים היתוך המתאים או אנלייזרים לבחון את האותות הסלולריים והשלד האירועים בתוך שניות של גיר?...

במהלך העשורים האחרונים, חשיבותו של התכונות המכאניות של סביבת התא צברה הכרה גוברת בביולוגיה של התא. רקמות שונות מטריצות מסחטות יש מאפיינים שונים היחסיים, כמו תאים להעביר ברחבי הגוף, הם מנווטים שינויים אלה, באמצעות תכונות מכניות אלה כדי להנחות אותם1,2,3 , ד , מיכל 5 , מיכל בן 6 , 7. תאים להשתמש הנוקשות של רקמה נתונה כדי להודיע על התנהגות נעים שלהם במהלך תהליכים כגון פיתוח, פצע ריפוי, סרטן גרורות. עם זאת, המנגנונים המולקולריים המאפשרים תחושת ותגובה לתשומות המכאניות הללו נותרו בעיקר בלתי ידועים1,2,3,4,5, מיכל בן 6 , 7. לאחר מכן
על מנת ללמוד את המנגנונים שדרכם תאים להגיב לרמזים סביבתיים פיזיים, קשיחות או נוקשות של המצע התאים המשמשים לטיפול בתאי מטופל חייב להיות מניפולציות. בשנת 2000, Chun-Min Lo, יו-לי וואנג ועמיתיו פיתחו שיטת הפעולה8 לפיה התגובה של תא בודד מורצפת לשינוי רמזים מכניים יכול להיבדק ישירות על ידי מתיחת מטריצה deformable המגולוון (ecm) מצופה אלקטרופורזה הידרוג'לים שבהם התאים היו מצופים. התאים מוצגים בהעדפה משמעותית למעבר לכיוון מצעים של סטיפר, תופעה שכונתה "דורוקמוניות".
מאז הדו ח המקורי ב 2000, טכניקות רבות אחרות המועסקים לחקר durotaxis. מעברי הקשיות הקשים מיוצרים על ידי השלכת ג'לים על תכונות נוקשות כגון פוליסטירן חרוזים9 או הודעות פולימר נוקשה10 או על ידי פולימריות המצע סביב הקצוות של שמיכות זכוכית11 כדי ליצור מכני ' צעד-גבולות '. לחילופין, הידרוג'לים עם רדודים אבל מעברי קשיות קבוע כבר מפוברק על ידי מגוון של שיטות כגון מעברי החוצה של crosslinker קשר שנוצר על ידי התקנים microfluidic12,13 או זה לצד-ידי צד הידרוג פתרון טיפות של נוקשות שונים8, או הידרוג ' ו עם פוטוראקטיבית crosslinker קשר מטופלים עם חשיפה אור UV מדורגים ליצור קשיות ליניארי מעבר הצבע14,15. טכניקות אלה שימשו השפעה רבה כדי לחקור את התנועה התאית durotactic en המסה לאורך זמן. עם זאת, בדרך כלל תכונות אלה מפוברק מראש של ציפוי התא המאפיינים שלהם נשארים עקביים במהלך הניסוי, הסתמכות על תנועה אקראית אקראי לדיגום של מעברי צבע מכניים. אף אחת מהשיטות הללו אינה קלה להתבוננות בשינויים מהירים בהתנהגות התאית בתגובה לגירוי מכני חריף.
כדי להתבונן בתגובות הסלולר לשינויים חריפים בסביבה המכנית, היחידה הניידת מציעה מספר יתרונות. בעלי התכונות האלה, תאים בודדים מקבלים גירוי מכני חריף על ידי משיכת המצע הבסיסי הרחק מתא עם מיקרופיפטה זכוכית, ובכך מציג מעבר כווני של מתח תא מטריקס. שינויים בהתנהגות המוליכה, כגון מהירות או כיוון הגירה, נצפו לאחר מכן על-ידי מיקרוסקופ ניגודיות בפאזה חיה. גישה זו מקלה על התבוננות ישירה של הגורם וההשפעה בין גירויים מכניים להעברת תאים, כיוון שהיא מאפשרת מניפולציה מהירה ואיטרטיבית של הכיוון והגודל של המתח הדרגתי והערכת הסוגר תגובות הסלולר בזמן אמת. יתר על כן, שיטה זו יכולה לשמש גם לעירור מכני התאים המבטא היתוך פלורסנט חלבונים או אנלייזרים להמחיש שינויים בכמות, פעילות, או לוקליזציה subcellular של חלבונים החשודים להיות מעורבים בתהליך המכונה ו . מונית מדבר
טכניקה זו הועסק על ידי קבוצות אשר לומדים durotaxis8,16 והוא מתואר כאן כפי שהוא הותאם על ידי המעבדה האו ללמוד את ההתנהגות durotaxis של סקוב-3 תאים סרטניים בשחלות ואת המנגנונים המולקולריים ש מוניות מתחתלגיל 17 בנוסף, שיטה ששונתה מתוארת לייצור הידרוג'לים עם שכבה אחת, אפילו של מיקרוספירות פלורסנט ליד פני השטח של תרבות התא; זה מקל על ויזואליזציה ואופטימיזציה של מיקרופיפטה שנוצר מעברי הלחץ והוא עשוי לאפשר הערכה של הקונקטיקות התא על ידי כוח המתיחה מיקרוסקופ.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylamide 40 %&#160;</td>
			<td>National Diagnostic</td>
			<td>EC-810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP179-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD20A High frequency generator</td>
			<td>Electro Technic Products</td>
			<td>12011A</td>
			<td>115 V -&#160;Handheld Corona Wand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bind Silane (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane) (</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-acrylamide 2%&#160;</td>
			<td>National Diagnostic</td>
			<td>EC-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 2510 Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Bransonic</td>
			<td></td>
			<td>40 kHz frequency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coarse Manipulator</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MC35A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM without phenol red</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Stage Glass Micropipette Puller</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco-aaper</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (Qualified One Shot)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A31606-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>FC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluospheres Carboxylate 0.2 um&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8810, F8807, F8811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene 6</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1815091</td>
			<td>1.5 ug DNA / 6uL fugene 6 per 35mm dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38SI-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Dish</td>
			<td>CellVis</td>
			<td>D60-60-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslip</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72224-01</td>
			<td>22 mm, #1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>9535-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III&#160;Special cleaning concentrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z805939</td>
			<td>Used at 2% in ddH2O for cleaning coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES powder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Make 50mM HEPES buffer, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intelli-Ray 400 Shuttered UV Flood Light</td>
			<td>Uviton International</td>
			<td>UV0338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A417-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MF900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MHW3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanopure Life Science UV/UF System</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>D11931</td>
			<td>ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Bemis Company, Inc</td>
			<td>PM-992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>139 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 28.6 mM Na2HPO4, 1.6 mM KH2PO4, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ref52</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rat embryonic fibroblast cell line; Culture in DMEM + 10% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringer&#39;s Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>134 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2.4 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 5 mM D-Glucose, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKOV-3</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td></td>
			<td>Culture in DMEM + 10% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH&#160;</td>
			<td>Covachem</td>
			<td>&#160;12414-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281-50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell durotaxis assay for assessing mechanical control of cellular movement and related signaling events

Durotaxis היא התהליך שבו התאים חשים ולהגיב מעברי מדרגות של מתח. כדי ללמוד את התהליך הזה בתוך מבחנה, הנוקשות של המצע שבבסיס תא חייב להיות מניפולציות. בעוד הידרוג'לים עם נוקשות מדורגת הגירה ארוכת טווח הוכיחה הוכיחו שימושי במחקרים durotaxis, מיידית, התגובות אקוטי שינויים מקומיים במתח המצע לאפשר מחקר ממוקד של תנועות תאים בודדים ו subcellular האירועים איתות. כדי לבחון באופן מובן מאליו את היכולת של תאים לחוש ולהגיב קשיות המצע הבסיסי, שיטה שונה עבור יישום של מעברי צבע חריפה של מתח מוגבר לתאים בודדים תרבותי על deformable הידרוג'לים משמש אשר מאפשר בזמן אמת מניפולציה של כוח וכיוון של מעברי צבע נוקשות הנחיתעל התאים המדובר. בנוסף, בסדר כוונון הפרטים והפרמטרים של המילוי, כגון הצורה והממדים של המיקרופיפטה או המיקום היחסי, המיקום והכיוון של הדרגתי המוחל, ניתן למטב את האפשרות למחקר של כל מכני סוג תא ומערכת רגישים. פרמטרים אלה ניתנים לשינוי כדי לשנות באופן אמין את הגירוי שהוחל ולהרחיב את הפונקציונליות ואת הרב-תכליתיות של התיקון. שיטה זו מאפשרת בדיקה של תנועת durotactic ארוכת טווח, כמו גם שינויים מיידיים יותר של איתות סלולרי ודינמיקה מורפולוגית בתגובה נוקשות שינוי.

על-ידי הכנת מיקרופיפטות (איור 1) ונרמול דור הכוח של מושך (איור 2 ואיור 3) כפי שמתואר לעיל, זוהו תנאים מיטביים של הדוטקטקטיקה לקווי תאים מרובים. באמצעות טכניקה זו, כפי שמתואר באיור 4, שניהם סקוב-3 בתאי סרטן השחלות17 ו Ref...

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events at JoVE.com

Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events

כוחות מכניים חשובים לשליטה בהעברת תאים. פרוטוקול זה מדגים את השימוש של הידרוג'לים אלסטיים שיכולים להיות מעוותים באמצעות מיקרופיפטה זכוכית מיקרומניפולציה כדי לגרות תאים עם מעבר קשיות מקומי כדי לעורר שינויים במבנה התא והגירה.

מערכת בודדת של תא להערכת בקרה מכנית של התנועה הסלולרית ואירועי איתות קשורים

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate ...

יש הערכה גוברת להשפעה של המיקרו-וירוס המכאני על איתות סלולרי והגירה. מחייב שימוש בגישות ניסיוניות וייחודיות כדי לספק גירוי מכני לתא בודד. טכניקה זו מאפשרת מניפולציה דינמית של סביבת המיקרו המכנית מתחת לתא בזמן אמת.המאפשר התבוננות בשינויים מוסדרים מכנית בהתנהגות נדידת תאים, ואירועי איתות תת-תאיים. הדגימה של ההליך איתי תהיה נילה נעים, פוסט-דוקטורט וג'ונתן פטרסון, טכנאי מהמעבדה שלנו. התחל על ידי שימוש Chorono-1 כדי להפעיל את משטח הזכוכית של כל להחליק כיסוי התחתון במשך 20 שניות, לפני הנחת יתר מיד 50 microliters של פתרון עבודה סילאן לאגד על כל להחליק כיסוי.אפשר לפתרון להתייבש במשך 10 דקות לפני שטיפה הכיסוי מחליק פעמיים עם 95% אתנול פעמיים עם isopropanol. לאחר מכן, לאפשר את החלקות הכיסוי לאוויר יבש במשך כ 20 דקות. עבור תצהיר מיקרו-חרוזים פלואורסצנטי, תחילה sonicate פתרון מיקרו חרוזים עובד במשך שעה אחת.15 דקות לפני תום sonication, מניחים את הכיסוי מופעל מחליק אנכית במחזיק כיסוי קרמיקה להחליק ולהעביר את המחזיק לתוך מנקה פלזמה שולחן העליון לטיפול פלזמה אוויר חדר במשך שלוש דקות. לאחר מכן, מניחים חתיכות של סרט פרפין במכסי צלחת פטרי 60 מיליליטר, וממקמים את כיסוי מחליק על הסרטים, הקשה קלה על כל להחליק כיסוי כדי להבטיח מגע טוב בין הסרט ואת coverlip. לאחר מכן, להוסיף 150 microliters של פתרון חרוזים עובד לראש כל כיסוי, ומיד לשוגם את פתרון אתנול מהצד של coverslips, משאיר את חרוזים על כיסוי.כדי להטיל את Hydrogels מיד לאחר ההכנה שלהם, להוסיף טיפה 25 microliter של פתרון הידרוג'ל לצד הפעיל של כל כיסוי התחתון, ומיד להפוך את כיסויי העליון חרוזים, צד חרוז למטה, על טיפה. אפשר לג'לים לעשות פולימריזציה במשך 30 דקות לפני השימוש במדפים כדי להסיר בעדינות את הכיסויים. לאחר מכן, לשטוף את הג'לים עם שלוש, חמש דקות שוטף טרי 50 miliMoler Hepes לכל לשטוף.כדי להפעיל את משטחי הידרוג'ל, הדגירה את הג'לים טריים 50 miliMoler Hepes, בתוספת 0.4 miliMolar Sulfo Sanpah, ומיד לחשוף את הג'לים למנורת קשת אולטרה סגולה באזור סגור במשך 90 שניות. בסוף ההפעלה, לשטוף את הג'לים עם שלוש, חמש דקות שוטף ב Hepes טרי, ולטפל הידרוג'לים מופעל עם 20 מיקרוגרם למיליליטר של fibronectin במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, שאפו את תוסף הפיברונקטין העודף, ושטפו את הג'לים שלוש פעמים ב- PBS במשך חמש דקות לכביסה.לאחר הכביסה האחרונה, מניחים את Hydrogels בנפח קטן של PBS ולעקר את הג'לים במשך 15 דקות תחת אור אולטרה סגול במכסה המנוע של תרבות הרקמה. לאחר מכן, לשטוף את הג'ל פעם אחת PBS טרי. עבור ציפוי תאים, זרע 2.1 פעמים 10 ארבעת התאים של עניין בשלושה מיליליטר של בינוני לכל הידרוג'ל ולאפשר לתאים לדבוק ב 37 מעלות צלזיוס במשך ארבע עד 18 שעות.בעוד התאים הם שיווי משקל, להשתמש מושך מיקרו פיפטה למשוך קוטר של מילימטר אחד על ידי 100 מילימטר ארוך borosilicate זכוכית מיקרו פיפטה, כדי לקבל מתחדד של מעל שני מילימטרים המפחית כ 50 מיקרומטר קוטר במילימטר הראשון, ומתרחב צינור ארוך, מקביל 10 מיקרומטר קוטר במילימטר האחרון. לאחר מכן, לטעון את פיפטה לתוך microforge ולעצב את פיפטה יש קצה קהה 15 מיקרומטר כי הוא מוקף ממש בסוף קטע 250 מיקרומטר, כפוף בערך 35 מעלות מלאך משאר פיפטה. הקוטר המשוער בעיקול צריך להיות סביב 30 מיקרומטר כדי להשאיל כוח לקצה.לאחר מכן, מניחים הידרוג'ל על הבמה של מיקרוסקופ הפוך. מכסים את המדיום בשמן מינרלי ולבחור את המטרה 10x. יש לעקר את המיקרו-פיפטה המוכנה ב-70% אלכוהול.לאחר מכן, הכנס לתוך מחזיק מיקרו פיפטה עם הוו הצביע לכיוון המנה, ולהשתמש מניפולטור כמובן כדי להוריד את פיפטה עד הקרס רק נוגע על פני השטח של הנוזל. למקד את המיקרוסקופ על התאים דבק בחלק העליון של הג'ל, ולדאוג כי המטרה היא לא בסכנה של להכות את המדגם או השלב, להביא את המיקוד מעל הג'ל כדי למצוא את קצה המיקרו פיפטה. סובבו את הפיפסה עד שהקצה יצב למישור המוקד, כך שהקצה הקהה של המיקרו-פיפטה מצביע כלפי מטה, והתמקדו מחדש בקצה הפיפסה לפי הצורך.התמקדו בחזרה לשכבת התא כדי לאמוד עד כמה רחוקה הפיגט מפני הג'ל, והתמקדו בחזרה למישור שהוא בחלקו בין הג'ל לקצה הפיפיט. לאחר מכן, הורידו לאט את הפיגט כדי להגיע למישור מוקד הביניים, והגדילו את ההגדלה למה שישמש בניסוי, לפני שתנמיך את הפיפיטה עד שתרחף ממש מעל פני השטח של ההידרוגל. עבור כיול מיקרו מניפולטור, תמונה אזור נטול תאים, אזור עם חרוזים, אבל לא מניפולציה, עם פיפטה העוסקים בג'ל, ועם פיפטה עוסקת מושך את הג'ל.לאחר מכן, השתמש בתמונה J כדי להשוות את שדות ללא חרוזים לשדות חרוזים ללא מעורבות, שדות חרוזים עם ג'ל עוסק, ואת הג'ל משך כדי לחשב את תזוזות חרוזים יחסי כוח להחיל על הג'לים. כדי לבצע בדיקה durotaxis, לפקח על קבוצה של תאים במשך 30 דקות כדי לזהות תאים הנעים בצורה מכוונת. בחר תא הנע בהתמדה בכיוון אחד ונטר את התאים בקצב המסגרות הרצוי למשך 30 דקות נוספות.לאחר מכן, מקם את הפיפיטה כ-50 מיקרומטרים לפני הצד הקרוב של הקצה המוביל של התא הנבחר, והזז את המיקרו-מניפולטור כך שהג'ל מעוות אורתוגונלית לכיוון הנסיעה של התא. לאחר מכן, להתבונן בתא לאורך זמן כפי שהוא מגיב חריפה, שיפוע מקומי של נוקשות הידרוג'ל. באמצעות טכניקה זו כפי שהודגם, פיברובלסטים עובריים חולדה לנוע לכיוון הנוקשות המוגברת שיפוע מיושם על ידי מיקרו פיפטה זכוכית.תאים פיברובלסט עובריים חולדה, מבטאים באופן חולף חיישן מתח וינקולין על 125 ג'לים פוליאקרילמיד קילופסקל גם להדגים את היווצרות הידבקויות מוקד בכיוונים של למתוח על פני תקופה של 40 דקות. ניתוח Forster תהודה העברת אנרגיה מגלה כי וינקולין מקומי הידבקויות מוקד חווה שינוי מיידי במתח, כאשר מוצג עם גירוי durotactic חריפה. הרחבת התועלת של תצפית זו לתצפית על אירועי איתות תת-תאיים, בתגובה לגירוי דורודקטי.אם אתה עושה ניסיונות מרובים למתוח תא, או אם המיקרונידל מחליק במהלך ההתקנה, התחל מחדש עם תא חדש כדי למנוע הענקת גירויים מרובים, משתנים ומכאניים. מעבר לתועלת שלה להתבונן durotaxis, טכניקה זו יכולה להיות משולבת עם גישות גנטיות, כגון biosensors, RNAI, או עריכת גנים כדי לעזור לתאר את המנגנונים המולקולריים המעורבים mechanotransduction.

Research

JoVE Journal

Biology

Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay

רעילות נייד של Nanogenomedicine בקו MCF-7 נייד: assay MTT

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

קולטן הדמיה G-חלבון יחד (GPCR) בתיווך אירועים איתות כי הפיקוח של Chemotaxis Discoideum Dictyostelium</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

סריג מיקרוסקופי לניטור בזמן אמת של אירועי איתות בתאים חיים באמצעות Biosensors Unimolecular

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

Assay Explant להערכת התנהגות ניידת של mesenchyme הגולגולת

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

הרבייה מכאנית מושרה גירוי סיד גל בmonolayers הסלולרי: דוגמה לתאי אנדותל קרני שור

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Microinjection מתא בודד לניתוח תקשורת נייד

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

מערכת פשוטה לסלולרי הערכת Mechanosensing וDurotaxis<em&gt; במבחנה</em

The composition and mechanical properties of the extracellular matrix are highly variable between tissue types. This connective tissue stroma diversity ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

ניתוח Spatiotemporal של אירועים Cytokinetic שמרים ביקוע

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

ניתוח Microfluidic תא בודד של Bacillus subtilis

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers ...