Name: single cell durotaxis assay for assessing mechanical control of cellular movement and related signaling events
Uploaded: 2019-08-27T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events at JoVE.com

1. Fabbricazione di idrogel di polimembrano deformabile con microsfere fluorescenti incorporate
 NOT:</</c0> Le direzioni descrivono la polimerizzazione di un idrogel di 25 kPa di 22 m di diametro e spesso circa 66 m. Ognuno o tutti questi parametri possono essere modificati e le direzioni per farlo possono essere trovate nella tabella 1 e nelle note17.
<ol><li>Attivazione di piatti o coverlips con fondo in vetro
	<ol...

<ol>
	<li>Acerbi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+breast+cancer+invasion+and+aggression+correlates+with+ECM+stiffening+and+immune+cell+infiltration.">Human breast cancer invasion and aggression correlates with ECM stiffening and immune cell infiltration.</a> Integrative Biology (Camb. 7 (10), 1120-1134 (2015).</li><li>Mekhdjian, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-mediated+traction+force+enhances+paxillin+molecular+associations+and+adhesion+dynamics+that+increase+the+invasiveness+of+tumor+cells+into+a+three-dimensional+extracellular+matrix.">Integrin-mediated traction force enhances paxillin molecular associations and adhesion dynamics that increase the invasiveness of tumor cells into a three-dimensional extracellular matrix.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (11), 1467-1488 (2017).</li><li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype.">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li><li>Lange, J. R., Fabry, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+tissue+mechanics+in+cell+migration.">Cell and tissue mechanics in cell migration.</a> Experimental Cell Research. 319 (16), 2418-2423 (2013).</li><li>Davidson, L. A., Oster, G. F., Keller, R. E., Koehl, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+mechanical+properties+of+the+blastula+wall+reveal+which+hypothesized+mechanisms+of+primary+invagination+are+physically+plausible+in+the+sea+urchin+Strongylocentrotus+purpuratus.">Measurements of mechanical properties of the blastula wall reveal which hypothesized mechanisms of primary invagination are physically plausible in the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus.</a> Developmental Biology. 209 (2), 221-238 (1999).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mechanical+factors+in+fate+decisions+of+stem+cells.">Role of mechanical factors in fate decisions of stem cells.</a> Regenerative Medicine. 6 (2), 229-240 (2011).</li><li>Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+stiffness+dictates+development,+homeostasis,+and+disease+progression.">Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression.</a> Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).</li><li>Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+movement+is+guided+by+the+rigidity+of+the+substrate.">Cell movement is guided by the rigidity of the substrate.</a> Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).</li><li>Kuo, C. H., Xian, J., Brenton, J. D., Franze, K., Sivaniah, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+stiffness+gradient+substrates+for+studying+mechanotactic+cell+migration.">Complex stiffness gradient substrates for studying mechanotactic cell migration.</a> Advanced Materials. 24 (45), 6059-6064 (2012).</li><li>Breckenridge, M. T., Desai, R. A., Yang, M. T., Fu, J., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrates+with+engineered+step+changes+in+rigidity+induce+traction+force+polarity+and+durotaxis.">Substrates with engineered step changes in rigidity induce traction force polarity and durotaxis.</a> Cell and Molecular Bioengineering. 7 (1), 26-34 (2014).</li><li>Goreczny, G. J., Wormer, D. B., Turner, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+System+for+Evaluating+Cell+Mechanosensing+and+Durotaxis+In+Vitro.">A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e52949 (2015).</li><li>Hartman, C. D., Isenberg, B. C., Chua, S. G., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+cell+durotaxis+depends+on+extracellular+matrix+composition.">Vascular smooth muscle cell durotaxis depends on extracellular matrix composition.</a> Proceedings of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 113 (40), 11190-11195 (2016).</li><li>Vincent, L. G., Choi, Y. S., Alonso-Latorre, B., del Alamo, J. C., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+durotaxis+depends+on+substrate+stiffness+gradient+strength.">Mesenchymal stem cell durotaxis depends on substrate stiffness gradient strength.</a> Biotechnology Journal. 8 (4), 472-484 (2013).</li><li>Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+hydrogels+with+steep+stiffness+gradients+for+studying+cell+mechanical+response.">Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response.</a> PLoS One. 7 (10), e46107 (2012).</li><li>Martinez, J. S., Lehaf, A. M., Schlenoff, J. B., Keller, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+durotaxis+on+polyelectrolyte+multilayers+with+photogenerated+gradients+of+modulus.">Cell durotaxis on polyelectrolyte multilayers with photogenerated gradients of modulus.</a> Biomacromolecules. 14 (5), 1311-1320 (2013).</li><li>Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+fluctuations+within+focal+adhesions+mediate+ECM-rigidity+sensing+to+guide+directed+cell+migration.">Force fluctuations within focal adhesions mediate ECM-rigidity sensing to guide directed cell migration.</a> Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).</li><li>McKenzie, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+microenvironment+regulates+ovarian+cancer+cell+morphology,+migration,+and+spheroid+disaggregation.">The mechanical microenvironment regulates ovarian cancer cell morphology, migration, and spheroid disaggregation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7228 (2018).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Grashoff, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mechanical+tension+across+vinculin+reveals+regulation+of+focal+adhesion+dynamics.">Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics.</a> Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).</li><li>McKenzie, A. J., Campbell, S. L., Howe, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+A+activity+and+anchoring+are+required+for+ovarian+cancer+cell+migration+and+invasion.">Protein kinase A activity and anchoring are required for ovarian cancer cell migration and invasion.</a> PLoS One. 6 (10), e26552 (2011).</li><li>Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyacrylamide+hydrogels+for+cell+mechanics:+steps+toward+optimization+and+alternative+uses.">Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses.</a> Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).</li><li>Plotnikov, S. V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+traction+force+microscopy.">High-resolution traction force microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 123, 367-394 (2014).</li><li>Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+localizing+reporter+fluorescent+beads+near+the+cell+culture+surface+for+traction+force+microscopy.">A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), 51873 (2014).</li></ol>

Divenuto qui è un test di durotassire ripetibile e a singola cellula che consente di valutare la capacità di una cellula di alterare il suo comportamento di migrazione in risposta a segnali meccanici acuti. Questa tecnica può essere utilizzata anche in combinazione con la microscopia a fluorescenza e proteine o biosensori di fusione appropriate per esaminare la segnalazione subcellulare e gli eventi citoscheletrici entro secondi di stimolazione meccanica o su una scala cronologica più lunga durante movimento durotatt...

Negli ultimi decenni, l'importanza delle proprietà meccaniche dell'ambiente di una cellula ha ottenuto un crescente riconoscimento nella biologia cellulare. Tessuti diversi e matrici extracellulari hanno diverse rigidità relative e, quando le cellule migrano in tutto il corpo, navigano questi cambiamenti, utilizzando queste proprietà meccaniche per guidarli1,2,3 , 4 DEL psu' , 5 Del numero 3( , 6 È possibile: , 7.Le cellule usano la rigidità di un dato tessuto per informare il loro comportamento motile durante processi come lo sviluppo, la guarigione delle ferite e la metastasi del cancro. Tuttavia, i meccanismi molecolari che permettono la sensazione e la risposta a questi input meccanici rimangono in gran parte sconosciuti1,2,3,4,5, 6 È possibile: , 7.
Per studiare i meccanismi attraverso i quali le cellule rispondono ai segnali ambientali fisici, la rigidità o rigidità delle cellule aderenti sottostanti deve essere manipolata. Nel 2000, Chun-Min Lo, Yu-Li Wang e colleghi hanno sviluppato un saggio8 in base alla quale la risposta motilica di una singola cellula ai cambiamenti di segnali meccanici potrebbe essere testata direttamente allungando la poliacrilammide rivestita egicolofosa ECM idrogel su cui sono state placcate le cellule. Le cellule mostrano una preferenza significativa per migrare verso substrati più rigidi, un fenomeno che hanno soprannominato "durotaxis".
Dalla relazione originale del 2000, molte altre tecniche sono state impiegate per lo studio del durotassi. I gradienti di rigidità ripida sono stati fabbricati mediante la colata di gel su caratteristiche rigide come perline in polistirolo9 o pali polimerici rigidi10 o polimerizzando il substrato intorno ai bordi di un vetro coverlips11 per creare meccanica ' passo-confini'. In alternativa, gli idrogel con gradienti di rigidità più bassi ma fissi sono stati fabbricati con una varietà di metodi come gradienti di crosslinker creati da dispositivi microfluidici12,13 o goccioline di soluzione idrogel side-by-side di diversa rigidità8, o idrogel con crosslinker fotoreattivo trattati con esposizione alla luce UV graduata per creare un gradiente di rigidità lineare14,15. Queste tecniche sono state utilizzate con grande effetto per indagare il movimento cellulare durotattico in massa nel tempo. Tuttavia, in genere queste caratteristiche sono fabbricate in anticipo rispetto alla placcatura cellulare e le loro proprietà rimangono coerenti nel corso dell'esperimento, basandosi sul movimento casuale delle cellule per il campionamento di gradienti meccanici. Nessuna di queste tecniche è suscettibile di osservazione di rapidi cambiamenti nel comportamento cellulare in risposta a stimoli meccanici acuti.
Per osservare le risposte cellulari ai cambiamenti acuti nell'ambiente meccanico, i saggi durotaxis a singola cella offrono diversi vantaggi. In questi saggi, alle singole cellule viene dato uno stimolo acuto e meccanico allontanando il substrato sottostante dalla cellula con una micropipetta di vetro, introducendo così un gradiente direzionale di tensione cell-matrice. I cambiamenti nel comportamento motile, come la velocità o la direzione della migrazione, sono poi osservati dalla microscopia a contrasto di fase delle cellule vive. Questo approccio facilita l'osservazione diretta delle relazioni di causa ed effetto tra gli stimoli meccanici e la migrazione cellulare, in quanto consente una rapida e iterativa manipolazione della direzione e della grandezza del gradiente di tensione e la valutazione della conseguente risposte cellulari in tempo reale. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato anche per stimolare meccanicamente le cellule che esprimono proteine di fusione fluorescente o biosensori per visualizzare i cambiamenti nella quantità, nell'attività o nella localizzazione subcellulare delle proteine che si sospetta siano coinvolte nella meccanosensing e durotaxis.
Questa tecnica è stata utilizzata da gruppi che studiano durotaxis8,16 ed è descritta qui come è stata adattata dal Laboratorio Howe per studiare il comportamento durotattico delle cellule tumorali ovariche SKOV-3 e i meccanismi molecolari che sotto durotaxis17. Inoltre, viene descritto un metodo modificato per la fabbricazione di idrogel con un singolo strato uniforme di microsfere fluorescenti vicino alla superficie di coltura cellulare; ciò facilita la visualizzazione e l'ottimizzazione dei gradienti di deformazione generati da micropipette e può consentire la valutazione della contrattilità cellulare mediante microscopia della forza di trazione.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylamide 40 %&#160;</td>
			<td>National Diagnostic</td>
			<td>EC-810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP179-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD20A High frequency generator</td>
			<td>Electro Technic Products</td>
			<td>12011A</td>
			<td>115 V -&#160;Handheld Corona Wand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bind Silane (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane) (</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-acrylamide 2%&#160;</td>
			<td>National Diagnostic</td>
			<td>EC-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 2510 Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Bransonic</td>
			<td></td>
			<td>40 kHz frequency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coarse Manipulator</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MC35A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM without phenol red</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Stage Glass Micropipette Puller</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco-aaper</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (Qualified One Shot)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A31606-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>FC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluospheres Carboxylate 0.2 um&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8810, F8807, F8811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene 6</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1815091</td>
			<td>1.5 ug DNA / 6uL fugene 6 per 35mm dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38SI-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Dish</td>
			<td>CellVis</td>
			<td>D60-60-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslip</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72224-01</td>
			<td>22 mm, #1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>9535-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III&#160;Special cleaning concentrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z805939</td>
			<td>Used at 2% in ddH2O for cleaning coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES powder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Make 50mM HEPES buffer, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intelli-Ray 400 Shuttered UV Flood Light</td>
			<td>Uviton International</td>
			<td>UV0338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A417-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MF900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MHW3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanopure Life Science UV/UF System</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>D11931</td>
			<td>ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Bemis Company, Inc</td>
			<td>PM-992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>139 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 28.6 mM Na2HPO4, 1.6 mM KH2PO4, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ref52</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rat embryonic fibroblast cell line; Culture in DMEM + 10% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringer&#39;s Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>134 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2.4 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 5 mM D-Glucose, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKOV-3</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td></td>
			<td>Culture in DMEM + 10% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH&#160;</td>
			<td>Covachem</td>
			<td>&#160;12414-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281-50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell durotaxis assay for assessing mechanical control of cellular movement and related signaling events

Durotaxis è il processo attraverso il quale le cellule percepiscono e rispondono a gradienti di tensione. Per studiare questo processo in vitro, la rigidità del substrato sottostante una cellula deve essere manipolata. Mentre gli idrogel con rigidità graduata e saggi di migrazione a lungo termine si sono dimostrati utili negli studi di durotassi, le risposte immediate e acute ai cambiamenti locali nella tensione del substrato consentono uno studio mirato dei movimenti delle singole cellule e degli eventi di segnalazione subcellulare. Per testare ripetutamente la capacità delle cellule di rilevare e rispondere alla rigidità del substrato sottostante, viene utilizzato un metodo modificato per l'applicazione di gradienti acuti di maggiore tensione alle singole cellule coltivate su idrogel deformabili che consente in tempo reale manipolazione della forza e della direzione dei gradienti di rigidità impartiti sulle cellule in questione. Inoltre, ottimizzando i dettagli e i parametri dell'analisi, come la forma e le dimensioni della micropipetta o la posizione relativa, il posizionamento e la direzione del gradiente applicato, il saggio può essere ottimizzato per lo studio di qualsiasi tipo di cella e sistema sensibili. Questi parametri possono essere modificati per modificare in modo affidabile lo stimolo applicato ed espandere la funzionalità e la versatilità del saggio. Questo metodo consente l'esame sia del movimento durotattico a lungo termine che dei cambiamenti più immediati nella segnalazione cellulare e nella dinamica morfologica in risposta al cambiamento di rigidità.

Preparando le micropipette (Figura 1) e normalizzando la generazione della forza dei pull (Figura 2 e Figura 3) come descritto in precedenza, sono state identificate condizioni di durotassiche ottimali per più linee cellulari. Utilizzando questa tecnica, come descritto nella Figura 4, entrambe le cellule tumorali ovariche SKOV-317 e i fibroblasti embrionali di ratto Ref52 (<stro...

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events at JoVE.com

Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events

Le forze meccaniche sono importanti per controllare la migrazione cellulare. Questo protocollo dimostra l'uso di idrogel elastici che possono essere deformati utilizzando una micropipetta di vetro e un micromanipolatore per stimolare le cellule con un gradiente di rigidità locale per suscitare cambiamenti nella struttura cellulare e nella migrazione.

Analisi A singola cella Durotaxis per valutare il controllo meccanico del movimento cellulare e gli eventi di segnalazione correlati

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate ...

C'è un crescente apprezzamento per l'impatto del microambiente meccanico sulla segnalazione cellulare e sulla migrazione. Richiede l'uso di approcci unici e sperimentali per fornire stimolazione meccanica alle singole cellule. Questa tecnica consente la manipolazione dinamica del micro-ambiente meccanico sotto una cella in tempo reale.Consentire l'osservazione di cambiamenti regolati meccanicamente nel comportamento di migrazione cellulare e di eventi di segnalazione subcellulare. A dimostrare la procedura con me ci saranno Nyla Naim, un post-doc e Johnathan Patterson, un tecnico del nostro laboratorio. Iniziare utilizzando un Chorono-1 per attivare la superficie di vetro di ogni coperchio inferiore scivolare per 20 secondi, prima di sovrasporare immediatamente 50 microlitri di legare la soluzione di lavoro del silane su ogni slittamento del coperchio.Lasciare asciugare la soluzione per 10 minuti prima di risciacquare il coperchio scivola due volte con il 95% di etanolo e due volte con isopropanolo. Quindi, lasciare che il coperchio scivoli ad asciugare all'aria per circa 20 minuti. Per la deposizione fluorescente di micro-perline, sonicare prima la soluzione di micro-perline funzionante per un'ora.15 minuti prima della fine della sonicazione, posizionare il coperchio attivato scivola verticalmente in un portascivolo di copertura in ceramica e trasferire il supporto in un detergente al plasma da tavolo per il trattamento al plasma dell'aria ambiente per tre minuti. Successivamente, posizionare pezzi di pellicola di paraffina in coperchi per piatti petri da 60 millilitri e posizionare la copertura scivola sulle pellicole, toccando leggermente ogni slitta di copertura per garantire un buon contatto tra il film e il copripazzo. Quindi, aggiungere 150 microlitri della soluzione di perline di lavoro nella parte superiore di ogni coverlip e aspirare immediatamente la soluzione di etanolo dal lato dei copricapo, lasciando le perline sul coperchio.Per lanciare gli idrogel subito dopo la loro preparazione, aggiungere una goccia da 25 microliter di soluzione Hydrogel sul lato attivato di ogni copriletto inferiore e capovolgere immediatamente i copripacchi superiore perline, lato perline verso il basso, sulla goccia. Lasciare polimerizzare i gel per 30 minuti prima di utilizzare le forcep per rimuovere delicatamente le coverlips. Quindi, sciacquare i gel con lavaggi di tre, cinque minuti in 50 miliMoler Hepes per lavaggio.Per attivare le superfici hydrogels, incubare i gel in 50 miliMoler Hepes freschi, integrati con 0,4 miliMolar Sulfo Sanpah, ed esporre immediatamente i gel a una lampada ad arco ultravioletto in un'area chiusa per 90 secondi. Al termine dell'attivazione, lavare i gel con lavaggi di tre, cinque minuti in Hepes fresco e trattare gli idrogel attivati con 20 microgrammi per millilitro di fibronectina per un'ora a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, aspirare la soluzione di fibronectina in eccesso e lavare i gel tre volte in PBS per cinque minuti per lavaggio.Dopo l'ultimo lavaggio, posizionare gli Idrogel in un piccolo volume di PBS e sterilizzare i gel per 15 minuti sotto la luce ultravioletta in un cappuccio di coltura tissutale. Quindi, lavare i gel una volta in PBS fresco. Per la placcatura cellulare, seme 2.1 per 10 le quattro delle cellule di interesse in tre millilitri di mezzo per idrogel e consentire alle cellule di aderire a 37 gradi Celsius per quattro-18 ore.Mentre le cellule sono equilibbranti, utilizzare un estrattore di micro-pipetta per tirare un diametro di un millimetro per micro-pipetta di vetro borosilicato lungo 100 millimetri, per ottenere un cono di oltre due millimetri che si riduce a circa 50 micrometri di diametro nel primo millimetro e si estende a un lungo tubo parallelo di 10 micrometri di diametro nell'ultimo millimetro. Quindi, caricare la pipetta in una microforgia e modellare la pipetta per avere una punta smussata di 15 micrometri che è racchiusa all'estremità di una sezione di 250 micrometri, piegata a circa 35 gradi angelo dal resto della pipetta. Il diametro approssimativo alla curva dovrebbe essere di circa 30 micrometri per dare resistenza alla punta.Quindi, posizionare un Hydrogel sul palco di un microscopio invertito. Coprire il mezzo con olio minerale e selezionare l'obiettivo 10x. Sterilizzare la micro-pipetta preparata con il 70% di alcol.Quindi, inserire nel supporto della micro-pipetta con il gancio puntato verso il piatto e utilizzare il manipolatore del corso per abbassare la pipetta fino a quando il gancio tocca solo la superficie del liquido. Focalizzare il microscopio sulle cellule aderenti alla parte superiore del gel e fare attenzione che l'obiettivo non sia in pericolo di colpire il campione o lo stadio, portare la messa a fuoco sopra il gel per trovare la punta della micro-pipetta. Ruotare la pipetta fino a quando la punta non è perpendicolare al piano focale, in modo che la punta smussata della micro-pipetta sia rivolta verso il basso e rifocalizzare sulla punta della pipetta, se necessario.Tornate a fuoco verso il basso fino allo strato di cella per misurare quanto è lontana la pipetta dalla superficie del gel e tornate a fuoco fino a un piano che è a metà strada tra il gel e la punta della pipetta. Quindi, abbassare lentamente la pipetta per raggiungere il piano focale intermedio e aumentare l'ingrandimento a quello che verrà utilizzato nell'esperimento, prima di abbassare la pipetta fino a quando non si libra appena sopra la superficie dell'Idrogel. Per la calibrazione del micro manipolatore, immagini un'area priva di cellule, un'area con perline, ma nessuna manipolazione, con la pipetta che coinvolge il gel e con la pipetta impegnata che tira il gel.Quindi, usa l'immagine J per confrontare i campi senza perline con i campi di perline senza impegno, i campi di perline con il gel inserito e il gel tirato per calcolare i relativi spostamenti delle perline e la forza applicata ai gel. Per condurre un test durotaxis, monitorare un gruppo di cellule per 30 minuti per identificare le cellule che si muovono in modo diretto. Selezionare una cella che si muove costantemente in una direzione e monitorare le celle della frequenza fotogrammi desiderata per altri 30 minuti.Quindi, posizionare la pipetta di circa 50 micrometri davanti al lato vicino del bordo anteriore della cella selezionata e spostare il micro manipolatore in modo che il gel sia deformato ortogonalmente nella direzione di marcia della cella. Quindi, osservare la cellula nel tempo in quanto risponde al gradiente acuto e locale della rigidità dell'idrogel. Utilizzando questa tecnica come dimostrato, i fibroblasti embrionali di ratto si muovono verso l'aumento della rigidità nei gradienti applicati da una micro-pipetta di vetro.Le cellule fibroblatrici embrionali del ratto, che esprimono transitoriamente il sensore di tensione della vinculina su gel di poliacrilammide di 125 kilopascal, dimostrano anche la formazione di aderenze focali nelle direzioni del tratto per un periodo di 40 minuti. L'analisi del trasferimento di energia a risonanza forstere rivela che la vinculina localizzata alle aderenze focali sperimenta un cambiamento immediato della tensione, quando viene presentata con una stimolazione durotattica acuta. Espandere l'utilità di questo saggio all'osservazione di eventi di segnalazione subcellulare, in risposta alla stimolazione durotattica.Se si tentano più tentativi di allungare una cella o se la microrischia scivola durante il saggio, ricominciare con una nuova cella per evitare di impartire stimoli meccanici multipli, variabili. Oltre alla sua utilità per il dosaggio della durotassi, questa tecnica può essere combinata con approcci genetici, come biosensori, RNAI o editing genico per aiutare a delineare i meccanismi molecolari coinvolti nella meccanotraduzione.

Research

JoVE Journal

Biology

Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay

Tossicità cellulare di Nanogenomedicine in MCF-7 Linea Cell: saggio MTT

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based ...

Ricerca

Biologia

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Receptor Imaging proteina G accoppiata (GPCR)-mediata eventi di segnalazione che chemiotassi di controllo di Dictyostelium discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

FRET Microscopia per Monitoraggio in tempo reale di segnalazione di eventi in cellule vive Uso Biosensori unimolecolare

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

Un test per la valutazione dei comportamenti Espianto cellulare del Mesenchima cranio

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

La stimolazione meccanica indotta calcio Wave Propagation in monostrati cellulari: l&#39;esempio di bovini cellule endoteliali corneali

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Microiniezione cella singola per l&#39;analisi cellulare comunicazione

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

Un sistema semplificato per la valutazione delle cellule Mechanosensing e Durotaxis<em&gt; In Vitro</em

The composition and mechanical properties of the extracellular matrix are highly variable between tissue types. This connective tissue stroma diversity ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Analisi spazio-temporale di Cytokinetic Eventi in lievito di fissione

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Analisi Microfluidic unicellulare del Bacillus subtilis

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers ...