Name: single cell durotaxis assay for assessing mechanical control of cellular movement and related signaling events
Uploaded: 2019-08-27T14:45:00
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1. 埋め込み蛍光微小球を用いた変形性ポリアクリルアミドヒドロゲルの製造
注:方向は、直径22μm、厚さ約66μmの25kPaヒドロゲルの重合を表します。これらのパラメータのそれぞれまたはすべてが変更でき、そのための指示は表 1およびノート17にあります。
<ol><li>ガラス底皿またはカバースリップの活性化
	<ol>
<li>?...

<ol>
	<li>Acerbi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+breast+cancer+invasion+and+aggression+correlates+with+ECM+stiffening+and+immune+cell+infiltration.">Human breast cancer invasion and aggression correlates with ECM stiffening and immune cell infiltration.</a> Integrative Biology (Camb. 7 (10), 1120-1134 (2015).</li><li>Mekhdjian, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-mediated+traction+force+enhances+paxillin+molecular+associations+and+adhesion+dynamics+that+increase+the+invasiveness+of+tumor+cells+into+a+three-dimensional+extracellular+matrix.">Integrin-mediated traction force enhances paxillin molecular associations and adhesion dynamics that increase the invasiveness of tumor cells into a three-dimensional extracellular matrix.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (11), 1467-1488 (2017).</li><li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype.">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li><li>Lange, J. R., Fabry, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+tissue+mechanics+in+cell+migration.">Cell and tissue mechanics in cell migration.</a> Experimental Cell Research. 319 (16), 2418-2423 (2013).</li><li>Davidson, L. A., Oster, G. F., Keller, R. E., Koehl, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+mechanical+properties+of+the+blastula+wall+reveal+which+hypothesized+mechanisms+of+primary+invagination+are+physically+plausible+in+the+sea+urchin+Strongylocentrotus+purpuratus.">Measurements of mechanical properties of the blastula wall reveal which hypothesized mechanisms of primary invagination are physically plausible in the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus.</a> Developmental Biology. 209 (2), 221-238 (1999).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mechanical+factors+in+fate+decisions+of+stem+cells.">Role of mechanical factors in fate decisions of stem cells.</a> Regenerative Medicine. 6 (2), 229-240 (2011).</li><li>Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+stiffness+dictates+development,+homeostasis,+and+disease+progression.">Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression.</a> Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).</li><li>Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+movement+is+guided+by+the+rigidity+of+the+substrate.">Cell movement is guided by the rigidity of the substrate.</a> Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).</li><li>Kuo, C. H., Xian, J., Brenton, J. D., Franze, K., Sivaniah, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+stiffness+gradient+substrates+for+studying+mechanotactic+cell+migration.">Complex stiffness gradient substrates for studying mechanotactic cell migration.</a> Advanced Materials. 24 (45), 6059-6064 (2012).</li><li>Breckenridge, M. T., Desai, R. A., Yang, M. T., Fu, J., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrates+with+engineered+step+changes+in+rigidity+induce+traction+force+polarity+and+durotaxis.">Substrates with engineered step changes in rigidity induce traction force polarity and durotaxis.</a> Cell and Molecular Bioengineering. 7 (1), 26-34 (2014).</li><li>Goreczny, G. J., Wormer, D. B., Turner, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+System+for+Evaluating+Cell+Mechanosensing+and+Durotaxis+In+Vitro.">A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e52949 (2015).</li><li>Hartman, C. D., Isenberg, B. C., Chua, S. G., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+cell+durotaxis+depends+on+extracellular+matrix+composition.">Vascular smooth muscle cell durotaxis depends on extracellular matrix composition.</a> Proceedings of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 113 (40), 11190-11195 (2016).</li><li>Vincent, L. G., Choi, Y. S., Alonso-Latorre, B., del Alamo, J. C., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+durotaxis+depends+on+substrate+stiffness+gradient+strength.">Mesenchymal stem cell durotaxis depends on substrate stiffness gradient strength.</a> Biotechnology Journal. 8 (4), 472-484 (2013).</li><li>Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+hydrogels+with+steep+stiffness+gradients+for+studying+cell+mechanical+response.">Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response.</a> PLoS One. 7 (10), e46107 (2012).</li><li>Martinez, J. S., Lehaf, A. M., Schlenoff, J. B., Keller, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+durotaxis+on+polyelectrolyte+multilayers+with+photogenerated+gradients+of+modulus.">Cell durotaxis on polyelectrolyte multilayers with photogenerated gradients of modulus.</a> Biomacromolecules. 14 (5), 1311-1320 (2013).</li><li>Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+fluctuations+within+focal+adhesions+mediate+ECM-rigidity+sensing+to+guide+directed+cell+migration.">Force fluctuations within focal adhesions mediate ECM-rigidity sensing to guide directed cell migration.</a> Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).</li><li>McKenzie, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+microenvironment+regulates+ovarian+cancer+cell+morphology,+migration,+and+spheroid+disaggregation.">The mechanical microenvironment regulates ovarian cancer cell morphology, migration, and spheroid disaggregation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7228 (2018).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Grashoff, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mechanical+tension+across+vinculin+reveals+regulation+of+focal+adhesion+dynamics.">Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics.</a> Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).</li><li>McKenzie, A. J., Campbell, S. L., Howe, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+A+activity+and+anchoring+are+required+for+ovarian+cancer+cell+migration+and+invasion.">Protein kinase A activity and anchoring are required for ovarian cancer cell migration and invasion.</a> PLoS One. 6 (10), e26552 (2011).</li><li>Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyacrylamide+hydrogels+for+cell+mechanics:+steps+toward+optimization+and+alternative+uses.">Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses.</a> Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).</li><li>Plotnikov, S. V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+traction+force+microscopy.">High-resolution traction force microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 123, 367-394 (2014).</li><li>Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+localizing+reporter+fluorescent+beads+near+the+cell+culture+surface+for+traction+force+microscopy.">A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), 51873 (2014).</li></ol>

ここで実証されているのは、急性機械的手がかりに応じて細胞の移動挙動を変化させる能力の評価を可能にする、反復可能な単細胞デュロタシスアッセイです。この技術はまた、蛍光顕微鏡および適切な融合タンパク質またはバイオセンサと組み合わせて、機械的刺激の数秒以内に、またはより長いタイムスケールの間に細胞内シグナル伝達および細胞骨格イベントを調べるために使用する?...

過去数十年にわたり、細胞環境の機械的特性の重要性は、細胞生物学における認知度を高めています。異なる組織と細胞外マトリックスは、異なる相対的な剛性を有し、細胞が体全体に移動するにつれて、これらの変化をナビゲートし、これらの機械的特性を使用して1、2、3を導く,4,5,6,7.細胞は、発達、創傷治癒、癌転移などのプロセス中に、所定の組織の剛性を使用して、その動態を知らせます。しかし、これらの機械的入力に対する感覚および応答を可能にする分子機構は、ほとんど未知のままである1,2,3,4,5,6,7.
細胞が物理的な環境的手がかりに反応するメカニズムを研究するためには、付着細胞の下にある基板の剛性または剛性を操作する必要があります。2000年、Chun-Min Lo、Yu-Li Wangたちは、機械的手掛かりを変化させる個々の細胞の動体応答を、変形可能な細胞外マトリックス(ECM)コーティングされたポリアクリルアミドを伸ばすことによって直接試験することができるアッセイ8を開発した。細胞がめっきされたヒドロゲル。細胞は、より硬い基板に向かって移動するための重要な好みを示す, 彼らは「デュロタキシス」と呼ばれる現象.
2000年の最初の報告以来、デュロタキシスの研究のために他の多くの技術が採用されています。急な剛性勾配は、ポリスチレンビーズ9や剛性ポリマーポスト10などの剛性特徴にゲルを鋳造するか、ガラスカバースリップ11の縁の周りの基板を重合することによって、機械的な'を作成することによって製造されています。ステップ境界'。あるいは、浅いが固定剛性勾配を持つヒドロゲルは、マイクロ流体デバイス12、13または並んでヒドロゲル溶液液滴によって作成された架架カーの勾配などの様々な方法によって製造されている異なる剛性8、または線形剛性勾配14、15を作成するために等級付きUV光露光で処理された光反応性架リンカーを有するヒドロゲル。これらの技術は、時間の経過とともに一斉に二次的に起因するデュロタクティック細胞運動を調査するために大きな効果を使用されてきた。しかし、通常、これらの特徴は細胞めっきの前に製造され、その特性は実験の過程で一貫したままであり、機械的勾配のサンプリングのためにランダムな細胞運動に依存します。これらの技術のいずれも、急性機械的刺激に応答して細胞行動の急速な変化を観察することは好適ではない。
機械的環境の急激な変化に対する細胞応答を観察するために、単細胞デュロタシスアッセイはいくつかの利点を提供する。これらのアッセイでは、個々の細胞は、ガラスマイクロピペットで細胞から基底基板を引き離すことによって急性の機械的刺激を与えられ、それによって細胞マトリックス張力の方向勾配を導入する。その後、移動の速度や方向などの動きの変化は、生細胞位相コントラスト顕微鏡によって観察されます。このアプローチは、機械的刺激と細胞移動との間の原因と効果の関係を直接観察することを容易にし、緊張勾配の方向と大きさの迅速かつ反復的な操作を可能にし、結果的に評価するリアルタイムで細胞応答。また、この方法は、蛍光融合タンパク質またはバイオセンサを発現する細胞を機械的に刺激し、機械化に関与していると疑われるタンパク質の量、活性、または細胞内局在の変化を可視化するためにも用いることができる。デュロタキシス。
この技術は、デュロタシス8、16を研究するグループによって採用されており、SKOV-3卵巣癌細胞の不作法挙動および分子機構を研究するためにハウ研究所によって適応されたとして、ここで説明されています。下デュロタシス17.さらに、細胞培養表面の近くに蛍光微小球の単一の層を有するヒドロゲルの製造のための修飾方法が記載されている。これはマイクロピペットによって発生した株の勾配の視覚化および最適化を促進し、牽引力顕微鏡による細胞収縮性の評価を可能にするかもしれない。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylamide 40 %&#160;</td>
			<td>National Diagnostic</td>
			<td>EC-810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP179-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD20A High frequency generator</td>
			<td>Electro Technic Products</td>
			<td>12011A</td>
			<td>115 V -&#160;Handheld Corona Wand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bind Silane (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane) (</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-acrylamide 2%&#160;</td>
			<td>National Diagnostic</td>
			<td>EC-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 2510 Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Bransonic</td>
			<td></td>
			<td>40 kHz frequency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coarse Manipulator</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MC35A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM without phenol red</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Stage Glass Micropipette Puller</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco-aaper</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (Qualified One Shot)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A31606-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>FC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluospheres Carboxylate 0.2 um&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8810, F8807, F8811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene 6</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1815091</td>
			<td>1.5 ug DNA / 6uL fugene 6 per 35mm dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38SI-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Dish</td>
			<td>CellVis</td>
			<td>D60-60-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslip</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72224-01</td>
			<td>22 mm, #1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>9535-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III&#160;Special cleaning concentrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z805939</td>
			<td>Used at 2% in ddH2O for cleaning coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES powder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Make 50mM HEPES buffer, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intelli-Ray 400 Shuttered UV Flood Light</td>
			<td>Uviton International</td>
			<td>UV0338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A417-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MF900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MHW3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanopure Life Science UV/UF System</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>D11931</td>
			<td>ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Bemis Company, Inc</td>
			<td>PM-992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>139 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 28.6 mM Na2HPO4, 1.6 mM KH2PO4, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ref52</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rat embryonic fibroblast cell line; Culture in DMEM + 10% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringer&#39;s Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>134 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2.4 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 5 mM D-Glucose, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKOV-3</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td></td>
			<td>Culture in DMEM + 10% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH&#160;</td>
			<td>Covachem</td>
			<td>&#160;12414-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281-50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell durotaxis assay for assessing mechanical control of cellular movement and related signaling events

デュロタキシスは、細胞が緊張の勾配を感知し、応答するプロセスです。このプロセスをインビトロで研究するためには、細胞の下にある基板の剛性を操作する必要があります。等級付き剛性と長期移行アッセイを有するヒドロゲルは、デュロタキシス研究に有用であることが証明されているが、基板張力の局所的変化に対する即時かつ急性応答は、個々の細胞運動および細胞内シグナル伝達事象の集中的な研究を可能にする。細胞が基礎となる基板剛性を感知し応答する能力を繰り返しテストするために、変形可能なヒドロゲル上で培養された個々の細胞に対する高い張力の急性勾配を適用するための改変方法が使用され、リアルタイムを可能にする。問題の細胞に付与された剛性勾配の強さと方向の操作。さらに、マイクロピペットの形状や寸法、適用された勾配の相対的な位置、配置、方向など、アッセイの詳細とパラメータを微調整することにより、アッセイを機械的に任意の研究に最適化することができます。敏感な細胞のタイプおよびシステム。これらのパラメータは、適用された刺激を確実に変更し、アッセイの機能性および汎用性を拡張するように変更することができる。この方法は、剛性の変化に応じて、長期的なデュロタクティック運動だけでなく、細胞シグナル伝達と形態学的ダイナミクスのより即時の変化の両方を調べることができる。

マイクロピペット(図1)を調製し、上述したようにプルの力発生を正規化することにより(図2および図3)、複数の細胞株に対して最適なデュロタクティック条件が同定された。この技術を用いて、図4に概説したように、SKOV-3卵巣癌細胞17およびRef52ラット胚線維芽細胞(図5)<...

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Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events

機械的な力は、細胞の移動を制御するために重要です。このプロトコルは、ガラスマイクロピペットとマイクロマニピュレータを使用して変形できる弾性ヒドロゲルの使用を示し、細胞構造および移行の変化を引き起こすために局所的な剛性勾配を持つ細胞を刺激する。

細胞運動と関連するシグナル伝達事象の機械的制御を評価するための単細胞デュロタシスアッセイ

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate ...

機械的な微小環境が細胞シグナル伝達と移動に及ぼす影響に対する評価が高まっています。個々の細胞に機械的刺激を与えるために独特な、実験的なアプローチの使用を必要とする。この技術により、細胞の下にある機械的なマイクロ環境をリアルタイムで動的に操作できます。細胞移動行動の機械的に調節された変化、および細胞下シグナル伝達イベントの観察を可能にする。私と一緒に手順を実証することは、ポストドクターのナイラ・ナイムと、私たちの研究室の技術者であるジョナサン・パターソンです。Chorono-1を使用して各底カバースリップのガラス表面を20秒間活性化し、すぐに各カバースリップに50マイクロリットルのバインドシラン作業溶液をオーバーレイする。蓋を95%エタノールで2回、イソプロパノールで2回すがる前に、溶液を10分間乾燥させます。その後、カバースリップを約20分間空気乾燥させます。蛍光マイクロビーズの堆積物の場合、最初に働くマイクロビーズ溶液を1時間超音波処理します。超音波処理の終了の15分前に、アクティブ化されたカバースリップをセラミックカバースリップホルダーに垂直に入れ、ホルダーをテーブルトッププラズマクリーナーに移して3分間部屋空気プラズマ処理を行います。次に、パラフィンフィルムの破片を60ミリリットルのペトリ皿蓋に入れ、カバースリップをフィルムに置き、各カバースリップを軽くタップしてフィルムとカバースリップの間に良好な接触を確保する。次に、各カバースリップの上部に150マイクロリットルの働くビーズ溶液を加え、すぐにカバースリップの側面からエタノール溶液を吸引し、ビーズをカバースリップに残します。調製直後にヒドロゲルをキャストするには、各底カバースリップの活性化側にハイドロゲル溶液の25マイクロリットルの液滴を加え、ビーズトップカバーリップをビーズ側を下に、ドロップレットに直ちに反転させます。鉗子を使用してカバーリップを静かに取り外す前に、ゲルを30分間重合させます。その後、洗浄ごとに新鮮な50ミリモラーヘップで3、5分の洗浄でゲルを洗います。ヒドロゲル表面を活性化するには、0.4ミリモルスルフォサンパーを補った新鮮な50ミリモラーヘペスでゲルをインキュベートし、すぐに90秒間密閉された領域の紫外線アーチランプにゲルを露出させます。活性化の終わりに、新鮮なヘペスで3、5分の洗浄でゲルを洗浄し、37°Cで1時間フィブロネクチンあたり20マイクログラムで活性化ハイドロゲルを治療します。インキュベーションの終了時に、過剰なフィブロネクチン溶液を吸引し、1回の洗浄につき5分間PBSでゲルを3回洗浄する。最後の洗浄後、少量のPBSにヒドロゲルを入れ、組織培養フードの紫外光の下で15分間ゲルを殺菌します。次いで、新鮮なPBSでゲルを1回洗います。細胞メッキの場合、ヒドロゲル当たりの培地3ミリリットルの対象となる4つの細胞の種子2.1倍10を、細胞が4〜18時間摂氏37度で接着することを可能にする。細胞が平衡している間、マイクロピペットプーラーを使用して直径1ミリメートル×100ミリメートルのホウケイ酸ガラスマイクロピペットを引き、最初のミリメートルで直径約50マイクロメートルに減少し、最後のミリメートルで直径10マイクロメートルの長い平行に伸びる2ミリメートル以上のテーパーを得る。次に、ピペットをマイクロフォージに積み込み、ピペットを250マイクロメートルのセクションの最後に囲まれた15マイクロメートルの鈍い先端を有するようにピペットを形作り、ピペットの残りの部分から約35度の天使に曲がった。ベンドでの近似直径は、先端に強度を与えるために約30マイクロメートルでなければなりません。次に、ヒドロゲルを反転した顕微鏡のステージに置きます。ミネラルオイルで媒体を覆い、10倍の目的を選択します。調製したマイクロピペットを70%アルコールで殺菌します。次に、フックを皿に向けてマイクロピペットホルダーに挿入し、フックが液体の表面に触れるまでピペットを下げるためにコースマニピュレータを使用します。ゲルの上部に付着した細胞に顕微鏡を合わせ、目的がサンプルまたはステージに当たる危険がないことを注意し、ゲルの上に焦点を当ててマイクロピペットの先端を見つける。ピペットを焦点面に垂直に回転させ、マイクロピペットの鈍い先端が下を向くようにし、必要に応じてピペットの先端に再び焦点を合わせます。細胞層に焦点を合わせ、ピペットがゲル表面からどれくらい離れているかを測定し、ゲルとピペットの先端の間の途中にある平面に焦点を合わせます。次に、ピペットをゆっくりと下げて中間焦点面に到達し、実験に使用される倍率を上げてから、ヒドロゲルの表面のすぐ上にホバリングするまでピペットを下げる。マイクロマニピュレーターキャリブレーションの場合、細胞を欠いた領域、ビーズを含む領域、操作なし、ピペットがゲルを引き付け、係合ピペットがゲルを引っ張って画像化します。次に、画像Jを使用して、ノービーズフィールドを関与のないビードフィールドと比較し、ビードフィールドをゲルが関与し、引っ張られたゲルを使用して、ゲルに適用される相対的なビーズの変位と力を計算する。デュロタシスアッセイを行う場合は、細胞群を30分間監視し、方向に向けて移動している細胞を特定します。一方向に安定して動いているセルを選択し、目的のフレームレートのセルをさらに 30 分間監視します。次に、選択したセルの先端の近辺の前に約50マイクロメートルのピペットを配置し、ゲルが細胞の進行方向に直交するようにマイクロマニピュレータを移動します。次に、ヒドロゲルの剛性の急性の局所勾配に反応する細胞を時間をかけて観察します。この手法を用いて、ラット胚性線維芽細胞は、ガラスマイクロピペットによって適用される勾配の増加した剛性に向かって移動する。ラット胚性線維芽細胞は、125キロパスカルポリアクリルアミドゲル上で一過性に発現するビンクリンテンションセンサを、40分間にわたってストレッチの方向に焦点付着の形成を示す。フォースター共鳴エネルギー伝達分析は、焦点接着に局在するビンクリンが、急性の神経刺激を与えると、緊張の即時変化を経験することを明らかにする。このアッセイの有用性を、従属細胞シグナル伝達事象の観察に拡大し、デューロチック刺激に応答する。細胞を伸ばす試みを複数回行う場合、またはマイクロニードルがアッセイ中にスリップした場合は、新しいセルからやり直して、複数の可変的な機械的刺激を与えないようにしてください。デュロタクシスをアッセグする有用性を超えて、この技術は、メカノトランスダクションに関与する分子メカニズムを引き出すために、バイオセンサー、RNAI、または遺伝子編集などの遺伝的アプローチと組み合わせることができます。

Research

JoVE Journal

Biology

Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay

MCF - 7細胞株におけるNanogenomedicineの細胞毒性：MTTアッセイ

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

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イメージングG -タンパク質共役受容体（GPCR）を介するシグナル伝達事象その制御走キイロタマホコリカビ</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

単分子バイオセンサーを用いた生細胞中のシグナル伝達事象をリアルタイムで監視するための顕微鏡のFRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

頭蓋間葉の細胞挙動を評価するための外植片アッセイ

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

細胞単層に機械的刺激によって誘発されるカルシウム波の伝播：ウシ角膜内皮細胞の例

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

セル通信解析のための単一細胞のマイクロインジェクション

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

セルMechanosensingとDurotaxisを評価するための簡略化したシステム<em&gt;インビトロ</em

The composition and mechanical properties of the extracellular matrix are highly variable between tissue types. This connective tissue stroma diversity ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

分裂酵母における細胞質分裂のイベントの時空間解析

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

枯草菌の単一細胞マイクロ流体解析

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers ...