Name: single cell durotaxis assay for assessing mechanical control of cellular movement and related signaling events
Uploaded: 2019-08-27T14:45:00
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1. 임베디드 형광 미소구가있는 변형 성 폴리 아크릴아미드 하이드로 겔 제조
참고: 지침은 직경 22 μm이고 두께가 약 66 μm인 25 kPa 하이드로겔의 중합을 설명합니다. 이러한 매개 변수의 각각 또는 전부를 수정할 수 있으며 그렇게 하는 방향은 표 1 및 노트17에서찾을 수 있습니다.
<ol><li>유리 바닥 접시 또는 커버 슬립의 활성?...

<ol>
	<li>Acerbi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+breast+cancer+invasion+and+aggression+correlates+with+ECM+stiffening+and+immune+cell+infiltration.">Human breast cancer invasion and aggression correlates with ECM stiffening and immune cell infiltration.</a> Integrative Biology (Camb. 7 (10), 1120-1134 (2015).</li><li>Mekhdjian, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-mediated+traction+force+enhances+paxillin+molecular+associations+and+adhesion+dynamics+that+increase+the+invasiveness+of+tumor+cells+into+a+three-dimensional+extracellular+matrix.">Integrin-mediated traction force enhances paxillin molecular associations and adhesion dynamics that increase the invasiveness of tumor cells into a three-dimensional extracellular matrix.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (11), 1467-1488 (2017).</li><li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype.">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li><li>Lange, J. R., Fabry, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+tissue+mechanics+in+cell+migration.">Cell and tissue mechanics in cell migration.</a> Experimental Cell Research. 319 (16), 2418-2423 (2013).</li><li>Davidson, L. A., Oster, G. F., Keller, R. E., Koehl, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+mechanical+properties+of+the+blastula+wall+reveal+which+hypothesized+mechanisms+of+primary+invagination+are+physically+plausible+in+the+sea+urchin+Strongylocentrotus+purpuratus.">Measurements of mechanical properties of the blastula wall reveal which hypothesized mechanisms of primary invagination are physically plausible in the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus.</a> Developmental Biology. 209 (2), 221-238 (1999).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mechanical+factors+in+fate+decisions+of+stem+cells.">Role of mechanical factors in fate decisions of stem cells.</a> Regenerative Medicine. 6 (2), 229-240 (2011).</li><li>Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+stiffness+dictates+development,+homeostasis,+and+disease+progression.">Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression.</a> Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).</li><li>Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+movement+is+guided+by+the+rigidity+of+the+substrate.">Cell movement is guided by the rigidity of the substrate.</a> Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).</li><li>Kuo, C. H., Xian, J., Brenton, J. D., Franze, K., Sivaniah, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+stiffness+gradient+substrates+for+studying+mechanotactic+cell+migration.">Complex stiffness gradient substrates for studying mechanotactic cell migration.</a> Advanced Materials. 24 (45), 6059-6064 (2012).</li><li>Breckenridge, M. T., Desai, R. A., Yang, M. T., Fu, J., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrates+with+engineered+step+changes+in+rigidity+induce+traction+force+polarity+and+durotaxis.">Substrates with engineered step changes in rigidity induce traction force polarity and durotaxis.</a> Cell and Molecular Bioengineering. 7 (1), 26-34 (2014).</li><li>Goreczny, G. J., Wormer, D. B., Turner, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+System+for+Evaluating+Cell+Mechanosensing+and+Durotaxis+In+Vitro.">A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e52949 (2015).</li><li>Hartman, C. D., Isenberg, B. C., Chua, S. G., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+cell+durotaxis+depends+on+extracellular+matrix+composition.">Vascular smooth muscle cell durotaxis depends on extracellular matrix composition.</a> Proceedings of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 113 (40), 11190-11195 (2016).</li><li>Vincent, L. G., Choi, Y. S., Alonso-Latorre, B., del Alamo, J. C., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+durotaxis+depends+on+substrate+stiffness+gradient+strength.">Mesenchymal stem cell durotaxis depends on substrate stiffness gradient strength.</a> Biotechnology Journal. 8 (4), 472-484 (2013).</li><li>Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+hydrogels+with+steep+stiffness+gradients+for+studying+cell+mechanical+response.">Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response.</a> PLoS One. 7 (10), e46107 (2012).</li><li>Martinez, J. S., Lehaf, A. M., Schlenoff, J. B., Keller, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+durotaxis+on+polyelectrolyte+multilayers+with+photogenerated+gradients+of+modulus.">Cell durotaxis on polyelectrolyte multilayers with photogenerated gradients of modulus.</a> Biomacromolecules. 14 (5), 1311-1320 (2013).</li><li>Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+fluctuations+within+focal+adhesions+mediate+ECM-rigidity+sensing+to+guide+directed+cell+migration.">Force fluctuations within focal adhesions mediate ECM-rigidity sensing to guide directed cell migration.</a> Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).</li><li>McKenzie, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+microenvironment+regulates+ovarian+cancer+cell+morphology,+migration,+and+spheroid+disaggregation.">The mechanical microenvironment regulates ovarian cancer cell morphology, migration, and spheroid disaggregation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7228 (2018).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Grashoff, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mechanical+tension+across+vinculin+reveals+regulation+of+focal+adhesion+dynamics.">Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics.</a> Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).</li><li>McKenzie, A. J., Campbell, S. L., Howe, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+A+activity+and+anchoring+are+required+for+ovarian+cancer+cell+migration+and+invasion.">Protein kinase A activity and anchoring are required for ovarian cancer cell migration and invasion.</a> PLoS One. 6 (10), e26552 (2011).</li><li>Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyacrylamide+hydrogels+for+cell+mechanics:+steps+toward+optimization+and+alternative+uses.">Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses.</a> Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).</li><li>Plotnikov, S. V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+traction+force+microscopy.">High-resolution traction force microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 123, 367-394 (2014).</li><li>Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+localizing+reporter+fluorescent+beads+near+the+cell+culture+surface+for+traction+force+microscopy.">A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), 51873 (2014).</li></ol>

여기에서 입증된 것은 급성 기계적인 단서에 응하여 그것의 이동 행동을 변경하는 세포의 기능의 평가를 허용하는 반복가능한, 단세포 durotaxis 분석입니다. 이 기술은 또한 형광 현미경 검사법 및 적절한 융합 단백질 또는 바이오 센서와 함께 기계적 자극의 초 이내에 또는 더 긴 기간 동안 세포 간 신호 및 세포 골격 이벤트를 검사하는 데 사용할 수 있습니다. 듀로틱 운동. 세포와 세포의 환경 관?...

지난 수십 년 동안, 세포 환경의 기계적 특성의 중요성은 세포 생물학에서 점점 더 인정을 얻고있다. 다른 조직과 세포 외 행렬은 다른 상대 강성을 가지고 있으며, 세포가 몸 전체에 마이그레이션할 때,그들은 그들을 안내하기 위해 이러한 기계적 특성을 사용하여 이러한 변화를 탐색 1,2,3 , 4개 , 5개 , 6개 , 7. 세포는 발달, 상처 치유 및 암 전이와 같은 과정에서 운동성 행동을 알리기 위해 주어진 조직의 뻣뻣함을 사용합니다. 그러나, 이러한 기계적 입력의 감각과 반응을 허용하는 분자 메커니즘은 크게 알 수없는 남아1,2,3,4,5, 6개 , 7.
세포가 물리적 환경 단서에 반응하는 메커니즘을 연구하기 위해서는 기질의 강성 또는 강성을 조작해야 합니다. 2000년, 전민로, 유리왕과 동료들은 분석8을 개발하여 변형 가능한 세포외 매트릭스(ECM) 코팅 폴리아크릴아미드를 스트레칭하여 기계큐를 변화시키는 개별 세포의 운동성 반응을 직접 테스트할 수 있었습니다. 세포가 도금된 하이드로겔. 세포는 더 단단한 기판으로 이동하는 것에 대한 상당한 선호를 나타내며, 이는 "듀로탁시스"라고 불리는 현상입니다.
2000년 최초의 보고서 이후, 듀로탁시스 연구에 다른 많은 기술이 사용되었습니다. 가파른 강성 그라데이션은 폴리스티렌 비드9 또는 뻣뻣한 폴리머포스트(10)와 같은 단단한 특징에 겔을 주조하여 제조되었거나 유리 커버슬립(11)의 가장자리 주위에 기판을 중합하여 기계적 을 만들어 ' 스텝 경계'. 양자택일로, 얕지만 고정된 강성 그라데이션을 가진 하이드로겔은 미세 유체 장치12,13 또는 나란히 하이드로겔 용액 방울에 의해 생성된 가교의 그라데이션과 같은 다양한 방법에 의해 제조되었습니다. 다른 강성8,또는 선형 강성 그라데이션14,15를만들기 위해 등급UV 광 노출로 처리 광 반응성 크로스 링커하이드로겔. 이러한 기술은 시간이 지남에 따라 한꺼번에 durotactic 세포 운동을 조사하는 큰 효과에 사용되어왔다. 그러나, 전형적으로 이러한 특징은 세포 도금 의 앞에 제조되고 그 특성은 기계적인 그라데이션의 샘플링을 위한 무작위 세포 운동에 의존하여 실험의 과정을 통해 일관되게 유지됩니다. 이러한 기술 중 어느 것도 급성 기계적 자극에 반응하여 세포 행동의 급격한 변화를 관찰 할 수 없습니다.
기계적인 환경에 있는 급격한 변경에 세포 반응을 관찰하기 위하여는, 단세포 durotaxis 반응은 몇몇 이점을 제안합니다. 이러한 세포에서, 개별 세포는 유리 마이크로파이펫으로 세포로부터 근본적인 기판을 당겨서 급성, 기계적 자극을 부여하여, 세포 매트릭스 장력의 방향구배를 도입한다. 이동 속도 또는 이동 방향과 같은 운동성 거동에 대한 변화는 살아있는 세포 상 대비 현미경 검사법에 의해 관찰됩니다. 이 접근법은 기계적 자극과 세포 이동 사이의 원인과 효과 관계를 직접 관찰할 수 있게 해주며, 이로 인해 장력 구배의 방향과 크기를 신속하고 반복적으로 조작할 수 있습니다. 실시간으로 셀룰러 응답. 또한, 이 방법은 또한 형광 융합 단백질 또는 바이오센서를 발현하는 세포를 기계적으로 자극하여 메카노센싱에 관여하는 것으로 의심되는 단백질의 양, 활성 또는 세포외 국소화의 변화를 시각화하는 데 사용될 수 있으며, 듀로탁시스.
이 기술은 durotaxis8,16을 공부하는 단에 의해 채택되고 SKOV-3 난소 암 세포의 durotactic 행동을 공부하고 분자 기계장치를 공부하기 위하여 하우 실험실에 의해 적응된 것과 같이 여기에서 기술됩니다 언더리 듀로탁시스17. 부가적으로, 변형된 방법은 세포 배양 표면 근처의 단일, 짝수 층의 형광 미소구층을 가진 하이드로겔의 제조를 위해 기술되고; 이것은 마이크로파이펫 생성 된 변형 구이의 시각화 및 최적화를 용이하게하고 견인력 현미경 검사법에 의한 세포 수축도의 평가를 허용할 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylamide 40 %&#160;</td>
			<td>National Diagnostic</td>
			<td>EC-810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP179-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD20A High frequency generator</td>
			<td>Electro Technic Products</td>
			<td>12011A</td>
			<td>115 V -&#160;Handheld Corona Wand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bind Silane (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane) (</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-acrylamide 2%&#160;</td>
			<td>National Diagnostic</td>
			<td>EC-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 2510 Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Bransonic</td>
			<td></td>
			<td>40 kHz frequency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coarse Manipulator</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MC35A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM without phenol red</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Stage Glass Micropipette Puller</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco-aaper</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (Qualified One Shot)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A31606-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>FC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluospheres Carboxylate 0.2 um&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8810, F8807, F8811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene 6</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1815091</td>
			<td>1.5 ug DNA / 6uL fugene 6 per 35mm dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38SI-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Dish</td>
			<td>CellVis</td>
			<td>D60-60-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslip</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72224-01</td>
			<td>22 mm, #1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>9535-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III&#160;Special cleaning concentrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z805939</td>
			<td>Used at 2% in ddH2O for cleaning coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES powder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Make 50mM HEPES buffer, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intelli-Ray 400 Shuttered UV Flood Light</td>
			<td>Uviton International</td>
			<td>UV0338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A417-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MF900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MHW3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanopure Life Science UV/UF System</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>D11931</td>
			<td>ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Bemis Company, Inc</td>
			<td>PM-992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>139 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 28.6 mM Na2HPO4, 1.6 mM KH2PO4, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ref52</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rat embryonic fibroblast cell line; Culture in DMEM + 10% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringer&#39;s Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>134 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2.4 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 5 mM D-Glucose, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKOV-3</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td></td>
			<td>Culture in DMEM + 10% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH&#160;</td>
			<td>Covachem</td>
			<td>&#160;12414-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281-50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell durotaxis assay for assessing mechanical control of cellular movement and related signaling events

Durotaxis는 세포가 긴장의 그라데이션을 감지하고 반응하는 과정입니다. 시험관에서 이 과정을 연구하기 위하여는, 세포의 근본적인 기질의 뻣뻣함은 조작되어야 합니다. 등급이 매겨진 강성과 장기 이동 성 법을 가진 하이드로겔은 durotaxis 연구에서 유용하다는 것이 입증되었지만, 기질 긴장의 국소 변화에 대한 즉각적인 급성 반응은 개별 세포 움직임과 세포 전세포 신호 이벤트에 대한 집중적인 연구를 가능하게 합니다. 기질의 강성을 감지하고 반응하는 세포의 능력을 반복적으로 테스트하기 위해 변형 가능한 하이드로겔에 배양된 개별 세포에 증가된 장력의 급성 구배를 적용하기 위한 수정된 방법이 실시간으로 사용됩니다. 문제의 세포에 부여 된 강성 그라데이션의 강도와 방향의 조작. 또한, 마이크로파이펫의 형상 및 치수 또는 적용된 그라데이션의 상대위치, 배치 및 방향과 같은 분석법의 세부 사항 및 파라미터를 미세 조정함으로써, 분석은 기계적으로 임의의 연구에 최적화될 수 있다. 민감한 세포 유형 및 시스템. 이러한 파라미터는 적용된 자극을 안정적으로 변경하고 분석법의 기능 및 다양성을 확장하도록 변경될 수 있다. 이 방법은 장기 durotactic 운동뿐만 아니라 변화하는 강성에 대한 응답으로 세포 신호 및 형태 역학의 더 즉각적인 변화의 검사를 할 수 있습니다.

상기와 같이 마이크로파이펫(도 1)을 준비하고 당김의 힘 생성을 정상화(도2 및 도3)함으로써, 여러 세포주에 대해 최적의 듀로택트 조건이 확인되었다. 이 기술을 사용하여, 도4에 설명된 바와 같이, SKOV-3 난소암세포(17) 및 Ref52 쥐 배아 섬유아세포(도5)는유리 미세피펫에 의해 적용된 ?...

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Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events

기계적 힘은 세포 이동을 제어하는 데 중요합니다. 이 프로토콜은 유리 마이크로파이펫 및 마이크로매니퓰레이터를 사용하여 변형될 수 있는 탄성 하이드로겔의 사용을 입증하여 세포 구조 및 이동의 변화를 유도하기 위해 국소 강성 구배를 가진 세포를 자극한다.

세포 운동 및 관련 신호 이벤트의 기계적 제어를 평가하기위한 단일 세포 Durotaxis 분석

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate ...

기계적 미세 환경이 세포 신호 및 마이그레이션에 미치는 영향에 대한 인식이 증가하고 있습니다. 개별 셀에 기계적 자극을 전달하기 위해 독특하고 실험적인 접근 방식을 사용해야 합니다. 이 기술은 실시간으로 셀 아래 기계 마이크로 환경의 동적 조작을 할 수 있습니다.세포 이동 거동 및 세포 외 신호 이벤트의 기계적 조절 된 변화를 관찰 할 수 있습니다. 저와 함께 절차를 시연하는 것은 박사 후 의자인 닐라 나임(Nyla Naim)과 실험실의 기술자인 조나단 패터슨이 될 것입니다. 초로노-1을 사용하여 각 하단 커버 슬립의 유리 표면을 20초 동안 활성화한 후, 각 커버 슬립에 바인드 시레인 작업 용액 50마이크로리터를 즉시 과도하게 놓는 것입니다.95%에탄올로 두 번, 이소프로판올로 두 번 덮개를 헹구기 전에 10분 동안 용액을 건조시키십시오. 그런 다음 커버 슬립이 약 20 분 동안 공기 건조되도록하십시오. 형광 마이크로 비드 증착의 경우 먼저 작동 마이크로 비드 솔루션을 1 시간 동안 초음파 처리합니다.초음파 처리가 끝나기 15분 전에 활성화된 커버 슬립을 세라믹 커버 슬립 홀더에 수직으로 놓고 홀더를 테이블 상단 플라즈마 클리너로 옮겨 실내 공기 플라즈마 처리를 3분 동안 처리합니다. 다음으로, 파라핀 필름 조각을 60밀리리터 페트리 접시 뚜껑에 놓고 커버 슬립을 필름에 가볍게 두드려 필름과 커버슬립 사이의 좋은 접촉을 보장합니다. 그런 다음, 각 커버슬립의 상단에 작업 비드 솔루션 의 150 마이크로 리터를 추가하고 즉시 커버슬립의 측면에서 에탄올 용액을 흡인하여 커버슬립에 구슬을 남깁니다.준비 직후 하이드로겔을 캐스팅하려면 하이드로겔 용액 25개 소리터 액수를 각 하단 커버슬립의 활성화된 면에 추가하고 구슬이 있는 상단 커버립, 구슬면을 아래로 아래로 뒤집어 물방울에 즉시 넣습니다. 겔이 포셉을 사용하여 커버립을 부드럽게 제거하기 전에 30 분 동안 중합되도록 하십시오. 그런 다음 젤을 3분, 5분간 세척할 때 신선한 50밀리몰러 헤페스로 씻어낸다.하이드로겔 표면을 활성화하려면 0.4 밀리몰러 설포 산파로 보충된 신선한 50밀리몰러 헤페스로 젤을 배양하고, 밀폐된 지역의 자외선 아치 램프에 즉시 젤을 노출시합니다. 활성화가 끝나면 신선한 헤페스로 3분, 5분 세척하여 젤을 씻고, 활성 하이드로겔을 섭씨 37도에서 1시간 동안 섬유네틴 밀리리터당 20마이크로그램으로 처리합니다. 인큐베이션이 끝나면 과도한 섬유네틴 용액을 흡인시키고, 세척당 5분 동안 PBS에서 젤을 세 번 세척한다.마지막 세척 후, 하이드로겔을 소량의 PBS에 놓고 조직 배양 후드에 울트라 바이올렛 빛 아래에서 15 분 동안 젤을 살균하십시오. 그런 다음, 신선한 PBS에서 젤을 한 번 씻으시다. 세포 도금의 경우, 시드 2.1배 10회는 하이드로겔당 3밀리리터에 관심 있는 세포 4개에 있으며, 세포가 섭씨 37도에서 4~18시간 동안 부착할 수 있도록 한다.세포가 평형화되는 동안 마이크로 파이펫 풀러를 사용하여 1밀리미터 직경을 100mm 길이의 보로실리케이트 유리 마이크로 파이펫으로 끌어당기고, 첫 밀리미터에서 직경약 50마이크로미터로 감소하고 마지막 밀리미터에서 길고 평행한 10 마이크로미터 직경의 튜브로 확장되는 2밀리미터 이상의 테이퍼를 얻습니다. 다음으로, 파이펫을 마이크로포지에 넣고 파이펫의 나머지 부분에서 약 35도 천사로 구부러진 250 마이크로미터 섹션의 맨 끝에 동봉된 15 마이크로미터 무딘 팁을 갖도록 파이펫을 형성한다. 굴곡의 대략적인 직경은 팁에 강도를 빌려주기 위해 약 30 마이크로미터여야합니다.다음으로, 하이드로겔을 반전 된 현미경의 무대에 놓습니다. 미네랄 오일로 매체를 덮고 10배 목표를 선택합니다. 70%의 알코올로 준비된 마이크로 파이펫을 살균합니다.그런 다음, 후크가 접시를 가리키는 마이크로 파이펫 홀더에 삽입하고, 후크가 액체의 표면에 닿을 때까지 피펫을 낮추기 위해 코스 조작기를 사용합니다. 현미경을 젤 의 상단에 부착 된 세포에 초점을 맞추고, 목적이 샘플이나 단계를 타격의 위험이 없다는 것을 주의, 마이크로 파이펫의 끝을 찾기 위해 젤 위의 초점을 가지고. 팁이 초점 평면에 수직이 될 때까지 파이펫을 회전하여 마이크로 파이펫의 무딘 끝이 아래로 가리키도록하고 필요에 따라 파이펫 끝에 다시 초점을 맞춥니다.피펫이 젤 표면에서 얼마나 멀리 떨어져 있는지 측정하고 젤과 파이펫 끝 사이의 부분적인 평면에 다시 초점을 맞추려면 셀 레이어에 다시 초점을 맞춥니다. 그런 다음, 파이펫을 천천히 낮추고, 실험에 사용될 배율을 증가시킨 후, 하이드로겔의 표면 바로 위에 마우스를 내밀 때까지 파이펫을 낮추게 한다. 마이크로 조작기 교정의 경우, 세포가 없는 영역, 구슬이 있는 영역을 이미지하지만 조작이 없으며, 파이펫이 젤을 교반하고, 젤을 당기는 약혼한 파이펫을 이미지화한다.이어서, 이미지 J를 사용하여 비드 필드를 결합하지 않고 비드 필드, 젤이 결합된 비드 필드 및 당겨진 젤을 비교하여 젤에 적용된 상대적 비드 변위와 힘을 계산한다. 두루택시 분석법을 수행하려면 30분 동안 세포 그룹을 모니터링하여 지시된 방식으로 움직이는 세포를 식별합니다. 한 방향으로 꾸준히 이동하는 셀을 선택하고 원하는 프레임 속도의 셀을 추가로 30분 동안 모니터링합니다.다음으로, 피펫을 선택한 셀의 앞면 에 약 50 마이크로미터를 배치하고, 겔이 세포의 이동 방향에 직교로 변형되는 마이크로 조작기를 이동한다. 그런 다음 하이드로겔 강성의 급성 국부적 그라데이션에 반응할 때 시간이 지남에 따라 세포를 관찰한다. 입증 된 바와 같이이 기술을 사용하여, 쥐 배아 섬유 아세포는 유리 마이크로 파이펫에 의해 적용 그라데이션에서 증가 강성을 향해 이동합니다.쥐 배아 섬유아세포 세포는 125킬로파스칼 폴리아크라이알라미드 젤에 빈쿨린 장력 센서를 일시적으로 발현하는 것으로, 40분 동안 스트레치 방향으로 초점 접착의 형성을 입증한다. 포스터 공명 에너지 전송 분석은 초점 접착에 국한 된 vinculin 급성 듀로 전술 자극으로 제시 될 때 긴장의 즉각적인 변화를 경험 하는 것으로 나타났습니다. 이 분석의 유용성을 구체 자극에 대한 응답으로 셀룰러 신호 이벤트의 관찰로 확장합니다.셀을 스트레칭하려고 여러 번 시도하거나 분석 중에 마이크로 니들이 미끄러지는 경우 새 셀로 다시 시작하여 여러 가지, 가변, 기계적 자극을 부여하지 않도록 하십시오. durotaxis를 말하는 그것의 유틸리티를 넘어, 이 기술은 메카노 트랜스듀션에 관련되었던 분자 기계장치를 묘사하는 것을 돕기 위하여 bio sensors, RNAI, 또는 유전자 편집과 같은 유전 접근과 결합될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay

MCF - 7 세포주에서 세포 독성 Nanogenomedicine의 : MTT 분석

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based ...

연구

생물학

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

이미징 G - 단백질 결합 수용체 (GPCR) - 중재 신호 행사 그 제어 Chemotaxis Dictyostelium Discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

Unimolecular 바이오 센서를 사용하여 라이브 세포에서 이벤트를 신호의 실시간 모니터링을위한 현미경을 안달

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

두개골 Mesenchyme의 셀룰러 행동을 평가하기위한 Explant 분석

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

세포 단일 층의 기계적 자극에 의​​한 칼슘 웨이브 전파 : 소 각막 내피 세포의 예

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

휴대 통신 분석을위한 단일 세포 미세 주입

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

평가 셀 Mechanosensing 및 Durotaxis에 대한 단순화 된 시스템<em&gt; 체외</em

The composition and mechanical properties of the extracellular matrix are highly variable between tissue types. This connective tissue stroma diversity ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

분열 효모의 Cytokinetic 이벤트의 시공간 분석

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

새 균의 subtilis 의 단일 셀 미세 분석

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers ...