Name: single cell durotaxis assay for assessing mechanical control of cellular movement and related signaling events
Uploaded: 2019-08-27T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events at JoVE.com

1. fabrikasjon av deformerbare polyakrylamid Hydrogeler med embedded fluorescerende mikrosfærer
Merk: Veibeskrivelse beskriver polymerisering av en 25 kPa-hydrogel som er 22 μm i diameter og omtrent 66 μm tykk. Hver eller alle disse parametrene kan endres og veibeskrivelse til å gjøre det kan finnes i tabell 1 og i notene17.
<ol><li>Aktivering av glass-bunn retter eller coverslips
	<ol>
<li>Forbered bind silan ar...

<ol>
	<li>Acerbi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+breast+cancer+invasion+and+aggression+correlates+with+ECM+stiffening+and+immune+cell+infiltration.">Human breast cancer invasion and aggression correlates with ECM stiffening and immune cell infiltration.</a> Integrative Biology (Camb. 7 (10), 1120-1134 (2015).</li><li>Mekhdjian, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-mediated+traction+force+enhances+paxillin+molecular+associations+and+adhesion+dynamics+that+increase+the+invasiveness+of+tumor+cells+into+a+three-dimensional+extracellular+matrix.">Integrin-mediated traction force enhances paxillin molecular associations and adhesion dynamics that increase the invasiveness of tumor cells into a three-dimensional extracellular matrix.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (11), 1467-1488 (2017).</li><li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype.">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li><li>Lange, J. R., Fabry, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+tissue+mechanics+in+cell+migration.">Cell and tissue mechanics in cell migration.</a> Experimental Cell Research. 319 (16), 2418-2423 (2013).</li><li>Davidson, L. A., Oster, G. F., Keller, R. E., Koehl, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+mechanical+properties+of+the+blastula+wall+reveal+which+hypothesized+mechanisms+of+primary+invagination+are+physically+plausible+in+the+sea+urchin+Strongylocentrotus+purpuratus.">Measurements of mechanical properties of the blastula wall reveal which hypothesized mechanisms of primary invagination are physically plausible in the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus.</a> Developmental Biology. 209 (2), 221-238 (1999).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mechanical+factors+in+fate+decisions+of+stem+cells.">Role of mechanical factors in fate decisions of stem cells.</a> Regenerative Medicine. 6 (2), 229-240 (2011).</li><li>Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+stiffness+dictates+development,+homeostasis,+and+disease+progression.">Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression.</a> Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).</li><li>Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+movement+is+guided+by+the+rigidity+of+the+substrate.">Cell movement is guided by the rigidity of the substrate.</a> Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).</li><li>Kuo, C. H., Xian, J., Brenton, J. D., Franze, K., Sivaniah, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+stiffness+gradient+substrates+for+studying+mechanotactic+cell+migration.">Complex stiffness gradient substrates for studying mechanotactic cell migration.</a> Advanced Materials. 24 (45), 6059-6064 (2012).</li><li>Breckenridge, M. T., Desai, R. A., Yang, M. T., Fu, J., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrates+with+engineered+step+changes+in+rigidity+induce+traction+force+polarity+and+durotaxis.">Substrates with engineered step changes in rigidity induce traction force polarity and durotaxis.</a> Cell and Molecular Bioengineering. 7 (1), 26-34 (2014).</li><li>Goreczny, G. J., Wormer, D. B., Turner, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+System+for+Evaluating+Cell+Mechanosensing+and+Durotaxis+In+Vitro.">A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e52949 (2015).</li><li>Hartman, C. D., Isenberg, B. C., Chua, S. G., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+cell+durotaxis+depends+on+extracellular+matrix+composition.">Vascular smooth muscle cell durotaxis depends on extracellular matrix composition.</a> Proceedings of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 113 (40), 11190-11195 (2016).</li><li>Vincent, L. G., Choi, Y. S., Alonso-Latorre, B., del Alamo, J. C., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+durotaxis+depends+on+substrate+stiffness+gradient+strength.">Mesenchymal stem cell durotaxis depends on substrate stiffness gradient strength.</a> Biotechnology Journal. 8 (4), 472-484 (2013).</li><li>Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+hydrogels+with+steep+stiffness+gradients+for+studying+cell+mechanical+response.">Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response.</a> PLoS One. 7 (10), e46107 (2012).</li><li>Martinez, J. S., Lehaf, A. M., Schlenoff, J. B., Keller, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+durotaxis+on+polyelectrolyte+multilayers+with+photogenerated+gradients+of+modulus.">Cell durotaxis on polyelectrolyte multilayers with photogenerated gradients of modulus.</a> Biomacromolecules. 14 (5), 1311-1320 (2013).</li><li>Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+fluctuations+within+focal+adhesions+mediate+ECM-rigidity+sensing+to+guide+directed+cell+migration.">Force fluctuations within focal adhesions mediate ECM-rigidity sensing to guide directed cell migration.</a> Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).</li><li>McKenzie, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+microenvironment+regulates+ovarian+cancer+cell+morphology,+migration,+and+spheroid+disaggregation.">The mechanical microenvironment regulates ovarian cancer cell morphology, migration, and spheroid disaggregation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7228 (2018).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Grashoff, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mechanical+tension+across+vinculin+reveals+regulation+of+focal+adhesion+dynamics.">Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics.</a> Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).</li><li>McKenzie, A. J., Campbell, S. L., Howe, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+A+activity+and+anchoring+are+required+for+ovarian+cancer+cell+migration+and+invasion.">Protein kinase A activity and anchoring are required for ovarian cancer cell migration and invasion.</a> PLoS One. 6 (10), e26552 (2011).</li><li>Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyacrylamide+hydrogels+for+cell+mechanics:+steps+toward+optimization+and+alternative+uses.">Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses.</a> Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).</li><li>Plotnikov, S. V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+traction+force+microscopy.">High-resolution traction force microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 123, 367-394 (2014).</li><li>Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+localizing+reporter+fluorescent+beads+near+the+cell+culture+surface+for+traction+force+microscopy.">A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), 51873 (2014).</li></ol>

Demonstrert her er en repeterbar, Single-Cell durotaxis analysen som tillater vurdering av en celle evne til å endre sin migrasjon atferd som svar på akutte mekaniske signaler. Denne teknikken kan også brukes i kombinasjon med fluorescens mikroskopi og passende Fusion proteiner eller biosensors for å undersøke subcellulære signalering og cytoskjelettkomponenter hendelser i løpet av sekunder av mekanisk stimulering eller over en lengre tidsskala under durotactic bevegelse. Forstå en celle forhold til sine omgivels...

I løpet av de siste ti årene har betydningen av de mekaniske egenskapene til en celle miljø fått økende anerkjennelse i cellebiologi. Ulike vev og ekstracellulære matriser har ulike relative stiffnesses og, som cellene migrere i hele kroppen, navigerer de disse endringene, ved hjelp av disse mekaniske egenskaper for å veilede dem1,2,3 , 4 andre priser , 5 andre priser , 6 andre priser , 7. Cells bruke stivhet av en gitt vev for å informere sine aktive atferd under prosesser som utvikling, sår healing, og kreft metastasering. Men den molekylære mekanismer som tillater følelse av og respons på disse mekaniske innganger fortsatt i stor grad ukjent1,2,3,4,5, 6 andre priser , 7i.
For å studere mekanismene gjennom hvilke celler reagerer på fysiske miljømessige signaler, må stivhet eller stivhet av underlaget underliggende tilhenger celler manipuleres. I 2000, Chun-min lo, Yu-Li Wang og kolleger utviklet en analyse8 der en individuell celle aktive respons på skiftende mekaniske signaler kan være direkte testet ved å strekke deformerbare ekstracellulære MATRISE (ECM)-belagt polyakrylamid hydrogeler som cellene var belagt. Celler viser en betydelig preferanse for å migrere mot stivere underlag, et fenomen de kalte "durotaxis."
Siden den opprinnelige rapporten i 2000, har mange andre teknikker vært ansatt for studiet av durotaxis. Bratt stivhet graderinger har vært fabrikkert ved støping gels over stive funksjoner som polystyren perler9 eller stiv polymer innlegg10 eller ved lysherde underlaget rundt kantene av et glass coverslips11 for å lage mekaniske ' trinn-grenser '. Alternativt, hydrogeler med grunnere men fast stivhet graderinger har vært fabrikkert ved en rekke metoder som graderinger av tverrbinder opprettet av mikrovæskebasert enheter12,13 eller side-ved-side hydrogel løsning dråper av ulik stivhet8, eller hydrogeler med photoreactive tverrbinder behandlet med gradert UV-lys eksponering for å skape en lineær stivhet gradient14,15. Disse teknikkene har blitt brukt til stor effekt for å undersøke durotactic Cellular bevegelse en masse over tid. Men vanligvis disse funksjonene er fabrikkert i forkant av celle plating og deres egenskaper forblir konsistent i løpet av eksperimentet, avhengig av tilfeldig celle bevegelse for prøvetaking av mekaniske graderinger. Ingen av disse teknikkene er mottagelig for observasjon av raske endringer i cellulære atferd som svar på akutt mekanisk stimulans.
For å observere cellulære svar på akutte endringer i mekanisk miljø, én celle durotaxis analyser tilbyr flere fordeler. I disse analysene, er individuelle celler gitt en akutt, mekanisk stimulans ved å trekke den underliggende underlaget bort fra cellen med et glass micropipette, og dermed innføre en retningsbestemt gradient av celle-matrise spenning. Endringer i aktive atferd, for eksempel hastighet eller retning av migrasjon, blir deretter observert av Live-celle fase kontrast mikroskopi. Denne tilnærmingen forenkler direkte observasjon av årsak og virkning relasjoner mellom mekaniske stimuli og celle migrasjon, som det gir rask, repeterende manipulasjon av retningen og omfanget av spenningen gradient og vurdering av påfølgende cellulære responser i sanntid. Videre kan denne metoden også brukes til å mekanisk stimulere celler uttrykker fluorescerende Fusion proteiner eller biosensors å visualisere endringer i mengden, aktivitet, eller subcellulære lokalisering av proteiner mistenkt for å være involvert i mechanosensing og durotaxis.
Denne teknikken har vært ansatt av grupper somstuderer durotaxis og er beskrevet her som det har blitt tilpasset av den Howe laboratoriet for å studere durotactic Behavior of SKOV-3 eggstokkene kreftceller og den molekylære mekanismer som underliggende durotaxis17. I tillegg er en modifisert metode beskrevet for fabrikasjon av hydrogeler med en enkelt, selv lag av fluorescerende mikrosfærer nær cellen kulturen overflaten; Dette forenkler visualisering og optimalisering av micropipette-genererte strekk graderinger og kan tillate vurdering av celle contractility av traction Force mikroskopi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylamide 40 %&#160;</td>
			<td>National Diagnostic</td>
			<td>EC-810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP179-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD20A High frequency generator</td>
			<td>Electro Technic Products</td>
			<td>12011A</td>
			<td>115 V -&#160;Handheld Corona Wand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bind Silane (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane) (</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-acrylamide 2%&#160;</td>
			<td>National Diagnostic</td>
			<td>EC-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 2510 Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Bransonic</td>
			<td></td>
			<td>40 kHz frequency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coarse Manipulator</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MC35A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM without phenol red</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Stage Glass Micropipette Puller</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco-aaper</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (Qualified One Shot)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A31606-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>FC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluospheres Carboxylate 0.2 um&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8810, F8807, F8811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene 6</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1815091</td>
			<td>1.5 ug DNA / 6uL fugene 6 per 35mm dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38SI-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Dish</td>
			<td>CellVis</td>
			<td>D60-60-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslip</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72224-01</td>
			<td>22 mm, #1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>9535-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III&#160;Special cleaning concentrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z805939</td>
			<td>Used at 2% in ddH2O for cleaning coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES powder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Make 50mM HEPES buffer, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intelli-Ray 400 Shuttered UV Flood Light</td>
			<td>Uviton International</td>
			<td>UV0338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A417-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MF900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MHW3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanopure Life Science UV/UF System</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>D11931</td>
			<td>ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Bemis Company, Inc</td>
			<td>PM-992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>139 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 28.6 mM Na2HPO4, 1.6 mM KH2PO4, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ref52</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rat embryonic fibroblast cell line; Culture in DMEM + 10% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringer&#39;s Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>134 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2.4 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 5 mM D-Glucose, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKOV-3</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td></td>
			<td>Culture in DMEM + 10% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH&#160;</td>
			<td>Covachem</td>
			<td>&#160;12414-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281-50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell durotaxis assay for assessing mechanical control of cellular movement and related signaling events

Durotaxis er prosessen der cellene forstand og reagere på graderinger av spenning. For å studere denne prosessen in vitro, stivhet av underlaget underliggende en celle må manipuleres. Mens hydrogeler med gradert stivhet og langsiktige migrasjon analyser har vist seg nyttig i durotaxis studier, umiddelbare, akutte reaksjoner på lokale endringer i underlaget spenning tillate fokusert studie av individuelle celle bevegelser og subcellulære signalering hendelser. For å repeatably teste evnen til cellene til å oppfatte og reagere på den underliggende underlaget stivhet, en modifisert metode for anvendelse av akutte graderinger av økt spenning til individuelle celler kultivert på deformerbare hydrogeler brukes som tillater for sanntids manipulering av styrke og retning av stivhet gradienter formidles på celler i spørsmålet. I tillegg, ved å finjustere detaljene og parametrene av analysen, slik som form og dimensjoner av micropipette eller den relative posisjon, plassering, og retning av anvendt gradient, kan analysen optimaliseres for studiet av mekanisk sensitiv celle type og system. Disse parametrene kan endres for å pålitelig endre anvendt stimulans og utvide funksjonaliteten og allsidigheten til analysen. Denne metoden tillater undersøkelse av både langsiktig durotactic bevegelse samt mer umiddelbare endringer i mobilnettet signalering og morfologiske dynamikk som svar på skiftende stivhet.

Ved å forberede Mikropipetter (figur 1) og normalisere kraft generering av trekker (figur 2 og Figur 3) som beskrevet ovenfor, har optimale durotactic forhold blitt identifisert for flere cellelinjer. Ved hjelp av denne teknikken, som beskrevet i Figur 4, både SKOV-3 eggstokkene kreftceller17 og Ref52 rotte embryonale fibroblaster (figur 5) bevege ...

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events at JoVE.com

Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events

Mekaniske krefter er viktig for å kontrollere celle migrering. Denne protokollen demonstrerer bruken av elastiske hydrogeler som kan deformeres ved hjelp av et glass micropipette og en micromanipulator for å stimulere celler med en lokal stivhet gradient å lokke fram endringer i cellestruktur og migrasjon.

Single Cell Durotaxis analysen for vurdering mekanisk kontroll av Cellular Movement og relaterte signalering Events

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate ...

Det er økende forståelse for virkningen av det mekaniske mikromiljøet på cellesignalering og migrasjon. Nødvendiggjør bruk av unike, eksperimentelle tilnærminger for å levere mekanisk stimulering til individuelle celler. Denne teknikken tillater dynamisk manipulering av det mekaniske mikromiljøet under en celle i sanntid.Tillater observasjon av mekanisk regulerte endringer i cellemigrasjon atferd, og sub-cellulære signalhendelser. Å demonstrere prosedyren med meg vil være Nyla Naim, en post-doc og Johnathan Patterson, en tekniker fra laboratoriet vårt. Begynn med å bruke en Chorono-1 til å aktivere glassoverflaten på hvert bunndekselslipp i 20 sekunder, før du umiddelbart legger 50 mikroliter bind silan arbeidsløsning på hver dekkslipp.La oppløsningen tørke i 10 minutter før du skyller dekselet glir to ganger med 95% etanol og to ganger med isopropanol. La deretter dekselet sklier lufttørke i ca. 20 minutter. For fluorescerende mikroperle deponering, først sonikere den fungerende mikroperleløsningen i en time.15 minutter før sonikeringens slutt, plasser det aktiverte dekselet vertikalt i en keramisk dekselslippholder og overfør holderen til en bord-top plasmarenser for plasmabehandling i romluft i tre minutter. Deretter plasserer du biter av parafinfilm i 60 milliliter Petriskållokk, og legger dekselet på filmene, og trykker lett på hver coverslip for å sikre en god kontakt mellom filmen og dekkslippen. Deretter legger du til 150 mikroliter av den arbeidende perleløsningen til toppen av hver dekkslipp, og aspirer umiddelbart etanoloppløsningen fra siden av dekkslipsene, og la perlene på dekkslippen.For å kaste Hydrogels umiddelbart etter forberedelsen, legg til en 25 mikroliterdråpe Hydrogel-løsning på den aktiverte siden av hver bunndekslerlips, og vend umiddelbart beaded top coverslips, perle-side ned, på dråpet. La gelene polymerisere i 30 minutter før du bruker tang til å forsiktig fjerne dekkslips. Skyll deretter gelene med tre, fem minutters vasker i friske 50 miliMoler Hepes per vask.For å aktivere Hydrogels overflater, inkubere gelene i friske 50 miliMoler Hepes, supplert med 0,4 miliMolar Sulfo Sanpah, og umiddelbart utsette gelene til en ultrafiolett bue lampe i et lukket område i 90 sekunder. På slutten av aktiveringen vasker du gelene med tre, fem minutters vasker i friske Hepes, og behandler de aktiverte Hydrogels med 20 mikrogram per milliliter fibronectin i en time ved 37 grader Celsius. På slutten av inkubasjonen, aspirer overflødig fibronectin løsning, og vask gelene tre ganger i PBS i fem minutter per vask.Etter siste vask, legg hydrogelene i et lite volum PBS og steriliser gelene i 15 minutter under ultrafiolett lys i en vevskulturhette. Vask deretter gelene en gang i fersk PBS. For celleplating, frø 2,1 ganger 10 de fire av cellene av interesse i tre milliliter av middels per Hydrogel og la cellene til å holde seg ved 37 grader Celsius i fire til 18 timer.Mens cellene er likelibrating, bruk en mikropipette avtrekker til å trekke en millimeter diameter med 100 millimeter lang borosilikatglassmikropipette, for å oppnå en taper på over to millimeter som reduserer til ca. 50 mikrometer i diameter i den første millimeteren, og strekker seg til et langt, parallelt 10 mikrometer diameter rør i den siste millimeteren. Deretter laster du pipetten inn i en mikroforge og former pipetten for å ha en 15 mikrometers stumpet tupp som er omsluttet helt på slutten av en 250 mikrometerseksjon, bøyd på ca. 35 graders engel fra resten av pipetten. Den omtrentlige diameteren ved svingen bør være rundt 30 mikrometer for å gi styrke til spissen.Deretter plasserer du en Hydrogel på scenen av et omvendt mikroskop. Dekk mediet med mineralolje og velg 10x målet. Steriliser den tilberedte mikropipetten med 70% alkohol.Sett deretter inn i mikropipetteholderen med kroken pekende mot parabolen, og bruk kursmanipulatoren til å senke pipetten til kroken bare berører overflaten av væsken. Fokuser mikroskopet på cellene som følger toppen av gelen, og ta vare på at målet ikke er i fare for å treffe prøven eller scenen, ta fokus over gelen for å finne spissen av mikropipetten. Roter pipetten til spissen er vinkelrett på fokalplanet, slik at den sløve spissen på mikropipetten peker ned, og refokuserer på tuppen av pipetten etter behov.Fokuser tilbake ned til cellelaget for å måle hvor langt pipetten er fra geloverflaten, og fokuser tilbake til et plan som er delvis mellom gelen og tuppen av pipetten. Senk deretter pipetten langsomt for å nå mellomfokusplanet, og øk forstørrelsen til det som skal brukes i forsøket, før pipetten senkes til den svever like over hydrogelens overflate. For mikromanipulatorkalibrering, bilde et område blottet for celler, et område med perler, men ingen manipulasjon, med pipetten engasjerende gelen, og med den engasjerte pipetten trekke gelen.Deretter bruker du bildet J til å sammenligne ingen perlefelt med perlefeltene uten engasjement, perlefeltene med gelen engasjert, og den trukket gelen for å beregne de relative perleforskyvningene og kraften som påføres gelene. For å gjennomføre en durotaxis analyse, overvåke en gruppe celler i 30 minutter for å identifisere celler som beveger seg på en rettet måte. Merk en celle som beveger seg jevnt i én retning, og overvåk cellene i ønsket bildefrekvens i ytterligere 30 minutter.Deretter plasserer du pipetten ca. 50 mikrometer foran den nære siden av forkanten av den valgte cellen, og flytter mikromanipulatoren slik at gelen deformeres ortogonalt til cellens reiseretning. Deretter observerer du cellen over tid når den reagerer på den akutte, lokale gradienten av Hydrogel-stivhet. Ved hjelp av denne teknikken som demonstrert, beveger rotte embryonale fibroblaster seg mot økt stivhet i gradienter påført av en mikropipette i glass.Rotte embryonale fibroblastceller, forbigående uttrykker vinculin spenningssensor på 125 kilopascal polyakrylamid geler viser også dannelsen av fokale adhesjoner i retning av strekningen over en periode på 40 minutter. Forster Resonance Energy Transfer analyse avslører at vinculin lokalisert til fokal adhesjoner opplever en umiddelbar endring i spenning, når presentert med en akutt durotaktisk stimulering. Utvide nytten av denne analysen til observasjon av sub-cellulære signalhendelser, som svar på durotaktisk stimulering.Hvis du gjør flere forsøk på å strekke en celle, eller hvis mikroneedle glir under analysen, start på nytt med en ny celle for å unngå å formidle flere, variable, mekaniske stimuli. Utover verktøyet for å analysere durotaxis, kan denne teknikken kombineres med genetiske tilnærminger, for eksempel biosensorer, RNAI eller genredigering for å bidra til å avgrense molekylære mekanismer som er involvert i mekanotransduksjon.

Research

JoVE Journal

Biology

Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

FRET Mikroskopi for sanntids overvåking av signalanlegg hendelser i levende celler Bruke Unimolecular biosensorer

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

En Eksplantasjon Assay for å vurdere Cellular Behavior av Cranial mesenchyme

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Mekanisk stimulering-indusert Kalsium wave forplantning i cellemonolagene: The Eksempel på storfe Hornhinnen endotelceller

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Encellede Mikroinjeksjon for Cell Communication analyse

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

En forenklet system for evaluering Cell Mechanosensing og Durotaxis<em&gt; In Vitro</em

The composition and mechanical properties of the extracellular matrix are highly variable between tissue types. This connective tissue stroma diversity ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Spatiotemporal Analyse av Cytokinetic Hendelser i Fisjon Gjær

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Encellede Microfluidic analyse av Bacillus subtilis

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers ...