Name: single cell durotaxis assay for assessing mechanical control of cellular movement and related signaling events
Uploaded: 2019-08-27T14:45:00
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1. fabricação de hidrogéis deformable de polyacrylamide com as microesferas fluorescentes encaixadas
Nota: As direções descrevem a polimerização de um hidrogel de 25 kPa com 22 μm de diâmetro e aproximadamente 66 μm de espessura. Cada um ou todos estes parâmetros podem ser modificados e direções para fazê-lo podem ser encontrados na tabela 1 e nas notas17.
<ol><li>Ativação de pratos de fundo de vidro ou cobertu...

<ol>
	<li>Acerbi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+breast+cancer+invasion+and+aggression+correlates+with+ECM+stiffening+and+immune+cell+infiltration.">Human breast cancer invasion and aggression correlates with ECM stiffening and immune cell infiltration.</a> Integrative Biology (Camb. 7 (10), 1120-1134 (2015).</li><li>Mekhdjian, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-mediated+traction+force+enhances+paxillin+molecular+associations+and+adhesion+dynamics+that+increase+the+invasiveness+of+tumor+cells+into+a+three-dimensional+extracellular+matrix.">Integrin-mediated traction force enhances paxillin molecular associations and adhesion dynamics that increase the invasiveness of tumor cells into a three-dimensional extracellular matrix.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (11), 1467-1488 (2017).</li><li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype.">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li><li>Lange, J. R., Fabry, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+tissue+mechanics+in+cell+migration.">Cell and tissue mechanics in cell migration.</a> Experimental Cell Research. 319 (16), 2418-2423 (2013).</li><li>Davidson, L. A., Oster, G. F., Keller, R. E., Koehl, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+mechanical+properties+of+the+blastula+wall+reveal+which+hypothesized+mechanisms+of+primary+invagination+are+physically+plausible+in+the+sea+urchin+Strongylocentrotus+purpuratus.">Measurements of mechanical properties of the blastula wall reveal which hypothesized mechanisms of primary invagination are physically plausible in the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus.</a> Developmental Biology. 209 (2), 221-238 (1999).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mechanical+factors+in+fate+decisions+of+stem+cells.">Role of mechanical factors in fate decisions of stem cells.</a> Regenerative Medicine. 6 (2), 229-240 (2011).</li><li>Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+stiffness+dictates+development,+homeostasis,+and+disease+progression.">Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression.</a> Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).</li><li>Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+movement+is+guided+by+the+rigidity+of+the+substrate.">Cell movement is guided by the rigidity of the substrate.</a> Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).</li><li>Kuo, C. H., Xian, J., Brenton, J. D., Franze, K., Sivaniah, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+stiffness+gradient+substrates+for+studying+mechanotactic+cell+migration.">Complex stiffness gradient substrates for studying mechanotactic cell migration.</a> Advanced Materials. 24 (45), 6059-6064 (2012).</li><li>Breckenridge, M. T., Desai, R. A., Yang, M. T., Fu, J., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrates+with+engineered+step+changes+in+rigidity+induce+traction+force+polarity+and+durotaxis.">Substrates with engineered step changes in rigidity induce traction force polarity and durotaxis.</a> Cell and Molecular Bioengineering. 7 (1), 26-34 (2014).</li><li>Goreczny, G. J., Wormer, D. B., Turner, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+System+for+Evaluating+Cell+Mechanosensing+and+Durotaxis+In+Vitro.">A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e52949 (2015).</li><li>Hartman, C. D., Isenberg, B. C., Chua, S. G., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+cell+durotaxis+depends+on+extracellular+matrix+composition.">Vascular smooth muscle cell durotaxis depends on extracellular matrix composition.</a> Proceedings of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 113 (40), 11190-11195 (2016).</li><li>Vincent, L. G., Choi, Y. S., Alonso-Latorre, B., del Alamo, J. C., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+durotaxis+depends+on+substrate+stiffness+gradient+strength.">Mesenchymal stem cell durotaxis depends on substrate stiffness gradient strength.</a> Biotechnology Journal. 8 (4), 472-484 (2013).</li><li>Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+hydrogels+with+steep+stiffness+gradients+for+studying+cell+mechanical+response.">Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response.</a> PLoS One. 7 (10), e46107 (2012).</li><li>Martinez, J. S., Lehaf, A. M., Schlenoff, J. B., Keller, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+durotaxis+on+polyelectrolyte+multilayers+with+photogenerated+gradients+of+modulus.">Cell durotaxis on polyelectrolyte multilayers with photogenerated gradients of modulus.</a> Biomacromolecules. 14 (5), 1311-1320 (2013).</li><li>Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+fluctuations+within+focal+adhesions+mediate+ECM-rigidity+sensing+to+guide+directed+cell+migration.">Force fluctuations within focal adhesions mediate ECM-rigidity sensing to guide directed cell migration.</a> Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).</li><li>McKenzie, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+microenvironment+regulates+ovarian+cancer+cell+morphology,+migration,+and+spheroid+disaggregation.">The mechanical microenvironment regulates ovarian cancer cell morphology, migration, and spheroid disaggregation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7228 (2018).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Grashoff, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mechanical+tension+across+vinculin+reveals+regulation+of+focal+adhesion+dynamics.">Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics.</a> Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).</li><li>McKenzie, A. J., Campbell, S. L., Howe, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+A+activity+and+anchoring+are+required+for+ovarian+cancer+cell+migration+and+invasion.">Protein kinase A activity and anchoring are required for ovarian cancer cell migration and invasion.</a> PLoS One. 6 (10), e26552 (2011).</li><li>Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyacrylamide+hydrogels+for+cell+mechanics:+steps+toward+optimization+and+alternative+uses.">Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses.</a> Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).</li><li>Plotnikov, S. V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+traction+force+microscopy.">High-resolution traction force microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 123, 367-394 (2014).</li><li>Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+localizing+reporter+fluorescent+beads+near+the+cell+culture+surface+for+traction+force+microscopy.">A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), 51873 (2014).</li></ol>

Demonstrado aqui é um ensaio de durotaxis repetível, de célula única que permite a avaliação da capacidade de uma célula de alterar seu comportamento de migração em resposta a pistas mecânicas agudas. Esta técnica pode igualmente ser usada em combinação com a microscopia de fluorescência e as proteínas ou os biossensors apropriados da fusão para examinar a sinalização subcellular e os eventos cytoesqueléticos dentro dos segundos da estimulação mecânica ou sobre um temporal mais longo durante movimen...

Ao longo das últimas décadas, a importância das propriedades mecânicas do ambiente de uma célula tem aumentado o reconhecimento na biologia celular. Diferentes tecidos e matrizes extracelulares têm diferentes rigidez relativa e, à medida que as células migram por todo o corpo, elas navegam nessas mudanças, utilizando essas propriedades mecânicas para orientá-las1,2,3 , 4. º , 5. º , 6 anos de , 7. Cells use a rigidez de um determinado tecido para informar seu comportamento motile durante processos tais como o desenvolvimento, a cura da ferida, e a metástase do cancro. No entanto, os mecanismos moleculares que permitem a sensação e a resposta a essas entradas mecânicas permanecem em grande parte desconhecidos1,2,3,4,5, 6 anos de , o 7.
A fim de estudar os mecanismos através dos quais as células respondem às pistas ambientais físicas, a rigidez ou rigidez do substrato subjacente às células aderentes deve ser manipulada. Em 2000, Chun-min lo, Yu-li Wang e os colegas desenvolveram um ensaio8 pelo qual a resposta motile de uma célula individual à mudança de pistas mecânicas poderia ser testada diretamente pelo alongamento da matriz extracelular deformável (ECM)-revestido de poliacrilamida hidrogéis em que as células foram chapeadas. As células exibem uma preferência significativa pela migração para substratos mais rígidos, um fenômeno que eles apelidaram de "durotaxis".
Desde o relatório original em 2000, muitas outras técnicas foram empregadas para o estudo do durotaxis. Gradientes de rigidez íngreme foram fabricados por géis de fundição sobre características rígidas, tais como grânulos de poliestireno9 ou postes de polímero rígido10 ou por polimerizar o substrato em torno das bordas de uma lamínulas de vidro11 para criar mecânica ' limites dos passos». Alternativamente, os hidrogéis com gradientes de rigidez mais rasos, mas fixos, foram fabricados por uma variedade de métodos, como gradientes de chapéu cabeado criados por dispositivos microfluílicos12,13 ou gotas de solução hidrogel lado a lado de diferentes rigidez8, ou hidrogéis com chapéu cabeado fotorativo tratados com exposição à luz UV graduada para criar um gradiente de rigidez linear14,15. Estas técnicas têm sido usadas com grande efeito para investigar o movimento celular durotactic en masse ao longo do tempo. Entretanto, tipicamente estas características são fabricadas adiantado do chapeamento de pilha e suas propriedades permanecem consistentes sobre o curso da experimentação, confiando no movimento aleatório da pilha para a amostragem de Gradients mecânicos. Nenhuma dessas técnicas é capaz de observar mudanças rápidas no comportamento celular em resposta ao estímulo mecânico agudo.
A fim observar respostas celulares às mudanças agudas no ambiente mecânico, os ensaios da única pilha durotaxis oferecem diversas vantagens. Nestes ensaios, as células individuais recebem um estímulo agudo e mecânico, puxando o substrato subjacente para longe da célula com uma micropipeta de vidro, introduzindo assim um gradiente direcional da tensão da célula-matriz. As mudanças no comportamento do motile, tais como a velocidade ou a direção da migração, são observadas então pela microscopia de contraste da fase da vivo-pilha. Essa abordagem facilita a observação direta das relações de causa e efeito entre estímulos mecânicos e migração celular, pois permite a manipulação rápida e iterativa da direção e magnitude do gradiente de tensão e da avaliação da conseqüente respostas celulares em tempo real. Além disso, este método também pode ser usado para estimular mecanicamente as células que expressam proteínas de fusão fluorescente ou biossensores para visualizar alterações na quantidade, atividade ou localização subcelular de proteínas suspeitas de estarem envolvidas em mecanosensoriamento e durotaxis.
Esta técnica tem sido empregada por grupos que estudam durotaxis8,16 e é descrito aqui como foi adaptado pelo laboratório de Howe para estudar o comportamento durotáctico de SKOV-3 células cancerosas ovarianas e os mecanismos moleculares que Underly durotaxis17. Adicionalmente, um método modificado é descrito para a fabricação de hidrogéis com uma única, mesmo camada de microesferas fluorescentes perto da superfície da cultura da pilha; Isso facilita a visualização e otimização de gradientes de deformação gerados por micropipeta e pode permitir a avaliação da contratilidade celular por microscopia de força de tração.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylamide 40 %&#160;</td>
			<td>National Diagnostic</td>
			<td>EC-810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP179-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD20A High frequency generator</td>
			<td>Electro Technic Products</td>
			<td>12011A</td>
			<td>115 V -&#160;Handheld Corona Wand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bind Silane (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane) (</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-acrylamide 2%&#160;</td>
			<td>National Diagnostic</td>
			<td>EC-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 2510 Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Bransonic</td>
			<td></td>
			<td>40 kHz frequency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coarse Manipulator</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MC35A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM without phenol red</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Stage Glass Micropipette Puller</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco-aaper</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (Qualified One Shot)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A31606-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>FC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluospheres Carboxylate 0.2 um&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8810, F8807, F8811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene 6</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1815091</td>
			<td>1.5 ug DNA / 6uL fugene 6 per 35mm dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38SI-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Dish</td>
			<td>CellVis</td>
			<td>D60-60-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslip</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72224-01</td>
			<td>22 mm, #1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>9535-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III&#160;Special cleaning concentrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z805939</td>
			<td>Used at 2% in ddH2O for cleaning coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES powder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Make 50mM HEPES buffer, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intelli-Ray 400 Shuttered UV Flood Light</td>
			<td>Uviton International</td>
			<td>UV0338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A417-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MF900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MHW3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanopure Life Science UV/UF System</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>D11931</td>
			<td>ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Bemis Company, Inc</td>
			<td>PM-992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>139 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 28.6 mM Na2HPO4, 1.6 mM KH2PO4, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ref52</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rat embryonic fibroblast cell line; Culture in DMEM + 10% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringer&#39;s Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>134 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2.4 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 5 mM D-Glucose, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKOV-3</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td></td>
			<td>Culture in DMEM + 10% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH&#160;</td>
			<td>Covachem</td>
			<td>&#160;12414-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281-50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell durotaxis assay for assessing mechanical control of cellular movement and related signaling events

Durotaxis é o processo pelo qual as células sentem e respondem a gradientes de tensão. A fim de estudar este processo in vitro, a rigidez do substrato subjacente a uma célula deve ser manipulada. Quando os hidrogéis com rigidez graduada e os ensaios a longo prazo da migração provaram útil em estudos do durotaxis, as respostas imediatas, agudas às mudanças locais na tensão da carcaça permitem o estudo focalizado de movimentos individuais da pilha e de eventos de sinalização subcellular. Para testar repetivelmente a capacidade das células de sentir e responder à rigidez subjacente do substrato, um método modificado para aplicação de gradientes agudos de tensão aumentada para células individuais cultivadas em hidrogéis deformáveis é usado, o que permite o tempo real manipulação da força e direção dos gradientes de rigidez transmitidos sobre as células em questão. Adicionalmente, ajustando os detalhes e os parâmetros do ensaio, tais como a forma e as dimensões da micropipeta ou a posição relativa, a colocação, e a direção do gradiente aplicado, o ensaio pode ser otimizado para o estudo de qualquer tipo e sistema de células sensíveis. Esses parâmetros podem ser alterados para alterar de forma confiável o estímulo aplicado e ampliar a funcionalidade e a versatilidade do ensaio. Este método permite a examinação do movimento durotactic a longo prazo assim como umas mudanças mais imediatas na sinalização celular e na dinâmica morfológica em resposta à rigidez de mudança.

Ao preparar micropipetas (Figura 1) e normalizando a geração de força das trações (Figura 2 e Figura 3), conforme descrito acima, foram identificadas condições durotáticas ideais para múltiplas linhagens celulares. Usando essa técnica, conforme descrito na Figura 4, ambas as células de câncer de ovário de SKOV-317 e Ref52 de ratos embrionários (...

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Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events

As forças mecânicas são importantes para controlar a migração celular. Este protocolo demonstra o uso de hidrogéis elásticos que podem ser deformados usando uma micropipeta de vidro e um micromanipulador para estimular as células com um gradiente de rigidez local para provocar mudanças na estrutura celular e migração.

Ensaio de Durotaxis de célula única para avaliar o controle mecânico do movimento celular e eventos de sinalização relacionados

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate ...

Há uma crescente apreciação pelo impacto do microambiente mecânico na sinalização celular e migração. Necessitando do uso de abordagens experimentais únicas para fornecer estimulação mecânica às células individuais. Esta técnica permite a manipulação dinâmica do microambi ambiente mecânico sob uma célula em tempo real.Permitindo a observação de alterações mecanicamente reguladas no comportamento de migração celular e eventos de sinalização subcelular. Demonstrando o procedimento comigo estarão Nyla Naim, uma pós-doutora e Johnathan Patterson, um técnico do nosso laboratório. Comece usando um Chorono-1 para ativar a superfície de vidro de cada deslizamento de cobertura inferior por 20 segundos, antes de imediatamente sobre-colocar 50 microliters de solução de trabalho de silano de ligação em cada deslizamento de cobertura.Deixe a solução secar por 10 minutos antes de enxaguar os deslizamentos de cobertura duas vezes com 95% de etanol e duas vezes com isopropanol. Em seguida, deixe os deslizamentos de cobertura secarem por aproximadamente 20 minutos. Para deposição de micro-contas fluorescente, primeiro sonicar a solução de micro-contas de trabalho por uma hora.15 minutos antes do fim da sônica, coloque a tampa ativada deslize verticalmente em um suporte de deslizamento de cobertura cerâmica e transfira o suporte para um limpador de plasma de mesa para tratamento de plasma de ar quarto por três minutos. Em seguida, coloque peças de filme de parafina em tampas de placa de Petri de 60 mililitros, e coloque a capa deslizando sobre os filmes, tocando levemente cada deslizamento de capa para garantir um bom contato entre o filme e o deslizamento de capa. Em seguida, adicione 150 microliters da solução de contas de trabalho ao topo de cada tampa, e aspire imediatamente a solução de etanol a partir do lado das tampas, deixando as contas na tampa.Para lançar os Hidrogels imediatamente após sua preparação, adicione uma gotícula de 25 microliter da solução Hydrogel ao lado ativado de cada deslizamento inferior, e imediatamente gire as tampas superiores, lado de contas para baixo, para baixo, sobre a gotícula. Deixe os géis polimerizarem por 30 minutos antes de usar fórceps para remover suavemente as tampas. Em seguida, enxágue os géis com três, cinco minutos de lavagem em hepes frescos de 50 miliMoler por lavagem.Para ativar as superfícies hidrogel, incubar os géis em hepes frescos de 50 miliMoler, complementados com 0,4 miliMolar Sulfo Sanpah, e imediatamente expor os géis a uma lâmpada de arco ultravioleta em uma área fechada por 90 segundos. No final da ativação, lave os géis com três, cinco minutos de lavagem em Hepes frescos, e trate os hidrogéis ativados com 20 microgramas por mililitro de fibronectina por uma hora a 37 graus Celsius. Ao final da incubação, aspire a solução de fibronectina em excesso e lave os géis três vezes em PBS por cinco minutos por lavagem.Após a última lavagem, coloque os Hidrogels em um pequeno volume de PBS e esterilize os géis por 15 minutos sob luz ultravioleta em uma capa de cultura tecidual. Em seguida, lave os géis uma vez em PBS fresco. Para o revestimento celular, semente 2,1 vezes 10 as quatro células de interesse em três mililitros de médio por hidrogel e permitem que as células aderam a 37 graus Celsius por quatro a 18 horas.Enquanto as células estão se equilibrando, use um puxador de micro-pipeta para puxar um milímetro de diâmetro por 100 milímetros de comprimento borossilicata de vidro micro-pipeta, para obter um afunilador de mais de dois milímetros que reduza para aproximadamente 50 micrômetros de diâmetro no primeiro milímetro, e estende-se a um tubo longo, paralelo de 10 micrômetros no último milímetro. Em seguida, carregue a pipeta em um microforge e modele a pipeta para ter uma ponta de 15 micrômetros que está fechada no final de uma seção de 250 micrômetros, dobrada a aproximadamente 35 graus anjo do resto da pipeta. O diâmetro aproximado na curva deve ser de cerca de 30 micrômetros para dar força à ponta.Em seguida, coloque um Hidrogel no palco de um microscópio invertido. Cubra o meio com óleo mineral e selecione o objetivo de 10x. Esterilize a micro-pipeta preparada com o álcool de 70%.Em seguida, insira no suporte de micro-pipeta com o gancho apontado para o prato, e use o manipulador de curso para baixar a pipeta até que o gancho apenas toque a superfície do líquido. Concentre o microscópio nas células aderidas ao topo do gel, e tomando cuidado que o objetivo não esteja em perigo de atingir a amostra ou o estágio, traga o foco acima do gel para encontrar a ponta da micro-pipeta. Gire a pipeta até que a ponta esteja perpendicular ao plano focal, de modo que a ponta emarçada da micro-pipeta esteja apontando para baixo, e refoque na ponta da pipeta conforme necessário.Concentre-se de volta na camada celular para medir o quão longe a pipeta está da superfície do gel, e concentre-se de volta para um plano que é parcialmente entre o gel e a ponta da pipeta. Em seguida, abaixe lentamente a pipeta para alcançar o plano focal intermediário, e aumente a ampliação para o que será usado no experimento, antes de baixar a pipeta até que ela paire logo acima da superfície do Hidrogel. Para calibração micromumátrica, imagem uma área desprovida de células, uma área com contas, mas sem manipulação, com a pipeta envolvendo o gel, e com a pipeta engajada puxando o gel.Em seguida, use a imagem J para comparar os campos sem contas com os campos de contas sem engajamento, os campos de contas com o gel engajado, e o gel puxado para calcular os deslocamentos relativos de contas e força aplicada aos géis. Para realizar um ensaio durotaxis, monitore um grupo de células por 30 minutos para identificar células que estão se movendo de forma direcionada. Selecione uma célula que está se movendo constantemente em uma direção e monitore as células da taxa de quadros desejada por mais 30 minutos.Em seguida, posicione a pipeta cerca de 50 micrômetros na frente do lado próximo da borda principal da célula selecionada, e mova o micro-manipulador de tal forma que o gel seja deformado ortogonalmente para a direção de viagem da célula. Em seguida, observe a célula ao longo do tempo enquanto ela responde ao gradiente local agudo da rigidez hidrogel. Usando esta técnica como demonstrado, os fibroblastos embrionários de ratos movem-se em direção ao aumento da rigidez em gradientes aplicados por uma micro-pipeta de vidro.As células fibroblastos embrionárias de ratos, expressando transitoriamente o sensor de tensão vinculina em 125 géis de poliacrilamida quilopascal também demonstram a formação de aderências focais nas direções do trecho durante um período de 40 minutos. A análise da Transferência de Energia de Ressonância Forster revela que a vinculina localizada às aderências focais experimenta uma mudança imediata na tensão, quando apresentada com uma estimulação duratática aguda. Ampliando a utilidade deste ensaio para a observação de eventos de sinalização subcelular, em resposta à estimulação duratática.Se você fizer várias tentativas de esticar uma célula, ou se o microatado escorregar durante o ensaio, comece de novo com uma nova célula para evitar a partida de múltiplos, variáveis, estímulos mecânicos. Além de sua utilidade para o ensaio de durotaxis, essa técnica pode ser combinada com abordagens genéticas, como biosensores, RNAI ou edição de genes para ajudar a delinear os mecanismos moleculares envolvidos na mecanotransdução.

Research

JoVE Journal

Biology

Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay

Toxicidade celular de Nanogenomedicine em MCF-7 Linhagem Celular: MTT

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based ...

Biologia

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

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Receptor de imagem proteína G-Coupled (GPCR) mediada por eventos de sinalização que Quimiotaxia de Controle de Dictyostelium discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

FRET Microscopia para Monitoramento em Tempo Real de eventos de sinalização em células vivas utilizando biossensores unimolecular

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

Um ensaio de explante para avaliar o comportamento celular do mesênquima craniana

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A estimulação mecânica induzida por cálcio Propagação de Ondas em monocamadas de células: O Exemplo de Bovinos endotélio corneano

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