Name: single cell durotaxis assay for assessing mechanical control of cellular movement and related signaling events
Uploaded: 2019-08-27T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events at JoVE.com

Ни один.

1. Изготовление деформируемых гидрогелей полиакриламида со встроенными флуоресцентными микросферами
ПРИМЕЧАНИЕ: Направления описывают полимеризацию гидрогеля 25 кПа диаметром 22 мкм и толщиной около 66 мкм. Каждый или все эти параметры могут быть изменены и напра...

<ol>
	<li>Acerbi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+breast+cancer+invasion+and+aggression+correlates+with+ECM+stiffening+and+immune+cell+infiltration.">Human breast cancer invasion and aggression correlates with ECM stiffening and immune cell infiltration.</a> Integrative Biology (Camb. 7 (10), 1120-1134 (2015).</li><li>Mekhdjian, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-mediated+traction+force+enhances+paxillin+molecular+associations+and+adhesion+dynamics+that+increase+the+invasiveness+of+tumor+cells+into+a+three-dimensional+extracellular+matrix.">Integrin-mediated traction force enhances paxillin molecular associations and adhesion dynamics that increase the invasiveness of tumor cells into a three-dimensional extracellular matrix.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (11), 1467-1488 (2017).</li><li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype.">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li><li>Lange, J. R., Fabry, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+tissue+mechanics+in+cell+migration.">Cell and tissue mechanics in cell migration.</a> Experimental Cell Research. 319 (16), 2418-2423 (2013).</li><li>Davidson, L. A., Oster, G. F., Keller, R. E., Koehl, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+mechanical+properties+of+the+blastula+wall+reveal+which+hypothesized+mechanisms+of+primary+invagination+are+physically+plausible+in+the+sea+urchin+Strongylocentrotus+purpuratus.">Measurements of mechanical properties of the blastula wall reveal which hypothesized mechanisms of primary invagination are physically plausible in the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus.</a> Developmental Biology. 209 (2), 221-238 (1999).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mechanical+factors+in+fate+decisions+of+stem+cells.">Role of mechanical factors in fate decisions of stem cells.</a> Regenerative Medicine. 6 (2), 229-240 (2011).</li><li>Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+stiffness+dictates+development,+homeostasis,+and+disease+progression.">Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression.</a> Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).</li><li>Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+movement+is+guided+by+the+rigidity+of+the+substrate.">Cell movement is guided by the rigidity of the substrate.</a> Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).</li><li>Kuo, C. H., Xian, J., Brenton, J. D., Franze, K., Sivaniah, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+stiffness+gradient+substrates+for+studying+mechanotactic+cell+migration.">Complex stiffness gradient substrates for studying mechanotactic cell migration.</a> Advanced Materials. 24 (45), 6059-6064 (2012).</li><li>Breckenridge, M. T., Desai, R. A., Yang, M. T., Fu, J., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrates+with+engineered+step+changes+in+rigidity+induce+traction+force+polarity+and+durotaxis.">Substrates with engineered step changes in rigidity induce traction force polarity and durotaxis.</a> Cell and Molecular Bioengineering. 7 (1), 26-34 (2014).</li><li>Goreczny, G. J., Wormer, D. B., Turner, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+System+for+Evaluating+Cell+Mechanosensing+and+Durotaxis+In+Vitro.">A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e52949 (2015).</li><li>Hartman, C. D., Isenberg, B. C., Chua, S. G., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+cell+durotaxis+depends+on+extracellular+matrix+composition.">Vascular smooth muscle cell durotaxis depends on extracellular matrix composition.</a> Proceedings of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 113 (40), 11190-11195 (2016).</li><li>Vincent, L. G., Choi, Y. S., Alonso-Latorre, B., del Alamo, J. C., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+durotaxis+depends+on+substrate+stiffness+gradient+strength.">Mesenchymal stem cell durotaxis depends on substrate stiffness gradient strength.</a> Biotechnology Journal. 8 (4), 472-484 (2013).</li><li>Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+hydrogels+with+steep+stiffness+gradients+for+studying+cell+mechanical+response.">Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response.</a> PLoS One. 7 (10), e46107 (2012).</li><li>Martinez, J. S., Lehaf, A. M., Schlenoff, J. B., Keller, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+durotaxis+on+polyelectrolyte+multilayers+with+photogenerated+gradients+of+modulus.">Cell durotaxis on polyelectrolyte multilayers with photogenerated gradients of modulus.</a> Biomacromolecules. 14 (5), 1311-1320 (2013).</li><li>Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+fluctuations+within+focal+adhesions+mediate+ECM-rigidity+sensing+to+guide+directed+cell+migration.">Force fluctuations within focal adhesions mediate ECM-rigidity sensing to guide directed cell migration.</a> Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).</li><li>McKenzie, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+microenvironment+regulates+ovarian+cancer+cell+morphology,+migration,+and+spheroid+disaggregation.">The mechanical microenvironment regulates ovarian cancer cell morphology, migration, and spheroid disaggregation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7228 (2018).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Grashoff, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mechanical+tension+across+vinculin+reveals+regulation+of+focal+adhesion+dynamics.">Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics.</a> Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).</li><li>McKenzie, A. J., Campbell, S. L., Howe, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+A+activity+and+anchoring+are+required+for+ovarian+cancer+cell+migration+and+invasion.">Protein kinase A activity and anchoring are required for ovarian cancer cell migration and invasion.</a> PLoS One. 6 (10), e26552 (2011).</li><li>Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyacrylamide+hydrogels+for+cell+mechanics:+steps+toward+optimization+and+alternative+uses.">Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses.</a> Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).</li><li>Plotnikov, S. V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+traction+force+microscopy.">High-resolution traction force microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 123, 367-394 (2014).</li><li>Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+localizing+reporter+fluorescent+beads+near+the+cell+culture+surface+for+traction+force+microscopy.">A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), 51873 (2014).</li></ol>

Здесь демонстрируется повторяемый одноклеточный durotaxis тест, который позволяет оценить способность клетки изменять свое миграционное поведение в ответ на острые механические сигналы. Этот метод также может быть использован в сочетании с флуоресценционной микроскопией и соответствую...

За последние несколько десятилетий, важность механических свойств среды клетки получила все большее признание в клеточной биологии. Различные ткани и внеклеточные матрицы имеют различные относительные скованности и, как клетки мигрируют по всему телу, они перемещаются эти изменения, используя эти механические свойства, чтобы направлять их1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7. Клетки используют жесткость данной ткани, чтобы сообщить их подвижное поведение во время процессов, таких как развитие, заживление ран, и метастазы рака. Тем не менее, молекулярные механизмы, которые позволяют ощущение и ответ на эти механические входы остаются в значительной степени неизвестны1,2,3,4,5, 6 , 7.
Для того, чтобы изучить механизмы, с помощью которых клетки реагируют на физические экологические сигналы, жесткость или жесткость подстилающих клеток адепта должны быть манипулированы. В 2000 году Чун-Мин Ло, Yu-Li Wang и его коллеги разработали асссс8, в соответствии с которым мотовый ответ отдельных клеток на изменение механических сигналов может быть непосредственно протестирован путем растяжения деформируемой внеклеточной матрицы (ECM) с покрытием полиакриламид гидрогели, на которых были покрыты клетки. Клетки демонстрируют значительное предпочтение для миграции в сторону более жестких субстратов, явление, которое они окрестили "durotaxis".
После первоначального доклада в 2000 году для изучения дуротаксиса были использованы многие другие методы. Крутые градиенты жесткости были изготовлены путем литья гелей над жесткими функциями, такими как полистирол бусы9 или жесткие полимерные столбы10 или путем полимеризации субстрата по краям стеклянных крышки11 для создания механических ' шаг-границы. Кроме того, гидрогели с более мелкими, но фиксированными градиентами жесткости были изготовлены различными методами, такими как градиенты кросслинкера, созданные микрофлюидными устройствами12,13 или бок о бок каплями гидрогеля различной жесткости8, или гидрогелей с фотореактивным кросслинкером, обработанным с градуированным воздействием УФ-излучения для создания линейного градиента жесткости14,15. Эти методы были использованы для большого эффекта для исследования durotactic клеточного движения в массовом порядке с течением времени. Однако, как правило, эти функции изготавливаются до клеточного покрытия и их свойства остаются последовательными в течение эксперимента, полагаясь на случайное движение клеток для выборки механических градиентов. Ни один из этих методов поддаются наблюдению быстрых изменений в клеточном поведении в ответ на острый механический стимул.
Для того, чтобы наблюдать клеточной реакции на острые изменения в механической среде, одиночные анализы durotaxis ячейки предлагают несколько преимуществ. В этих анализах, отдельные клетки даны острый, механический стимул, потянув основной субстрат от клетки со стеклянной микропипеткой, тем самым вводя направленный градиент клеточной матрицы напряженности. Изменения в поведении подвижного, такие как скорость или направление миграции, затем наблюдаются с помощью контрастной микроскопии фазы живых клеток. Такой подход облегчает прямое наблюдение причинно-следственной связи между механическими стимулами и миграцией клеток, поскольку позволяет быстро, итеративное манипулирование направлением и величиной градиента напряжения и оценку последующего сотовых реакций в режиме реального времени. Кроме того, этот метод может также использоваться для механически стимулирующих клетки, выражающие флуоресцентные белки синтеза или биосенсоры, чтобы визуализировать изменения в количестве, активности или субклеточной локализации белков, подозреваемых в участии в механосенсировании и дюротаксис.
Этот метод был использован группами, которые изучают durotaxis8,16 и описывается здесь, как он был адаптирован лабораторией Хоу для изучения дуротаксического поведения sKOV-3 раковых клеток яичников и молекулярных механизмов, которые под дуротаксис17. Кроме того, описан модифицированный метод изготовления гидрогелей с одним, ровным слоем флуоресцентных микросфер вблизи поверхности клеточной культуры; это облегчает визуализацию и оптимизацию микропайпетов генерируемых градиентов деформации и может позволить оценку сотруднности клеток с помощью микроскопии силы тяги.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylamide 40 %&#160;</td>
			<td>National Diagnostic</td>
			<td>EC-810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP179-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD20A High frequency generator</td>
			<td>Electro Technic Products</td>
			<td>12011A</td>
			<td>115 V -&#160;Handheld Corona Wand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bind Silane (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane) (</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-acrylamide 2%&#160;</td>
			<td>National Diagnostic</td>
			<td>EC-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 2510 Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Bransonic</td>
			<td></td>
			<td>40 kHz frequency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coarse Manipulator</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MC35A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM without phenol red</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Stage Glass Micropipette Puller</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco-aaper</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (Qualified One Shot)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A31606-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>FC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluospheres Carboxylate 0.2 um&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8810, F8807, F8811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene 6</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1815091</td>
			<td>1.5 ug DNA / 6uL fugene 6 per 35mm dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38SI-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Dish</td>
			<td>CellVis</td>
			<td>D60-60-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslip</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72224-01</td>
			<td>22 mm, #1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>9535-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III&#160;Special cleaning concentrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z805939</td>
			<td>Used at 2% in ddH2O for cleaning coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES powder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Make 50mM HEPES buffer, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intelli-Ray 400 Shuttered UV Flood Light</td>
			<td>Uviton International</td>
			<td>UV0338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A417-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MF900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MHW3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanopure Life Science UV/UF System</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>D11931</td>
			<td>ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Bemis Company, Inc</td>
			<td>PM-992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>139 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 28.6 mM Na2HPO4, 1.6 mM KH2PO4, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ref52</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rat embryonic fibroblast cell line; Culture in DMEM + 10% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringer&#39;s Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>134 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2.4 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 5 mM D-Glucose, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKOV-3</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td></td>
			<td>Culture in DMEM + 10% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH&#160;</td>
			<td>Covachem</td>
			<td>&#160;12414-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281-50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell durotaxis assay for assessing mechanical control of cellular movement and related signaling events

Дуротаксис – это процесс, с помощью которого клетки ощущают и реагируют на градиенты напряжения. Для того, чтобы изучить этот процесс in vitro, жесткость субстрата, лежащего в основе клетки, должна быть обработана. В то время как гидрогели с градуированной жесткостью и долгосрочными миграционными анализами оказались полезными в исследованиях durotaxis, немедленные, острые реакции на локальные изменения в напряжении субстрата позволяют целенаправленно изучать отдельные движения клеток и субклеточные сигнальные события. Для повторного тестирования способности клеток чувствовать и реагировать на тонус поддвижного субстрата используется модифицированный метод применения острых градиентов повышенного напряжения к отдельным клеткам, культивируемым на деформируемых гидрогелях, что позволяет в режиме реального времени манипуляции силы и направления жесткости градиентов, привитых на клетки в вопросе. Кроме того, путем тонкой настройки деталей и параметров исследования, таких как форма и размеры микропипетты или относительное положение, размещение и направление прикладного градиента, анализ может быть оптимизирован для изучения любого механически чувствительный тип клеток и система. Эти параметры могут быть изменены, чтобы надежно изменить прикладной стимул и расширить функциональность и универсальность асссе. Этот метод позволяет изучить как долгосрочные дуротаксические движения, а также более непосредственные изменения в клеточной сигнализации и морфологической динамики в ответ на изменение жесткости.

При подготовке микропипетты(Рисунок 1) и нормализации генерации силы тянет (Рисунок 2 и Рисунок3 ), как описано выше, оптимальные durotactic условия были определены для нескольких клеточных линий. Используя этот метод, как указано на рисунке <stron...

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events at JoVE.com

Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events

Механические силы имеют важное значение для контроля миграции ячеек. Этот протокол демонстрирует использование эластичных гидрогелей, которые могут быть деформированы с помощью стеклянного микропипетика и микроманипулятора, чтобы стимулировать клетки с локальным градиентом жесткости, чтобы вызвать изменения в структуре клеток и миграции.

Одноклеточная durotaxis Анализ для оценки механического контроля клеточного движения и связанных с ними сигнальных событий

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate ...

Растет понимание влияния механической микроокноронности на сигнализацию клеток и миграцию. Необходимость использования уникальных, экспериментальных подходов для доставки механической стимуляции для отдельных клеток. Этот метод позволяет динамические манипуляции механической микро-среды под ячейкой в режиме реального времени.Разрешение наблюдения механически регулируемых изменений в поведении миграции клеток и событий субклеточной сигнализации. Демонстрация процедуры со мной будет Найла Наим, пост-док и Джонатан Паттерсон, техник из нашей лаборатории. Начните с использования Chorono-1, чтобы активировать стеклянную поверхность каждого нижнего покрытия скольжения в течение 20 секунд, прежде чем сразу же более-укладка 50 микролитров связывания силанов рабочего решения на каждой крышке скольжения.Дайте раствору высохнуть в течение 10 минут, прежде чем полоскать крышку скользит два раза с 95% этанола и два раза с изопропанолом. Затем, дайте крышке скользит в воздух сухой в течение примерно 20 минут. Для флуоресцентного осаждения микро-шарика, сначала sonicate рабочий раствор микро-шарика в течение одного часа.За 15 минут до окончания звуковой обработки поместите активированную крышку вертикально в керамический держатель для скольжения крышки и перенесите держатель в плазменный очиститель столешного верха для обработки плазмы комнатного воздуха в течение трех минут. Далее поместите кусочки парафиновой пленки в 60 миллилитров петри крышки чашки, и поместите крышку скользит на пленках, слегка нажав каждый крышку скольжения, чтобы обеспечить хороший контакт между пленкой и крышкой. Затем добавьте 150 микролитров рабочего шарикового раствора в верхнюю часть каждой крышки и немедленно оспирировать раствор этанола со стороны крышки, оставив бисер на крышке.Чтобы бросить Hydrogels сразу после их подготовки, добавить 25 микролитров капли раствора Гидрогеля в активированной стороне каждого нижнего крышки, и сразу же перевернуть бисером верхней крышки, бисером вниз, на капельку. Разрешить гели полимеризации в течение 30 минут, прежде чем использовать типсы, чтобы аккуратно удалить крышки. Затем, промыть гели с трех, пяти минут моет в свежем 50 miliMoler Hepes за стирку.Чтобы активировать поверхности Hydrogels, инкубировать гели в свежем 50 miliMoler Hepes, дополненный 0,4 милиМолар Сульфо Санпа, и сразу же подвергать гели ультрафиолетовой лампы арки в закрытой области в течение 90 секунд. В конце активации, мыть гели с тремя, пять минут моет в свежем Hepes, и лечить активированных гидрогели с 20 микрограммов на миллилитр фибронектина в течение одного часа при 37 градусов по Цельсию. В конце инкубации, аспирировать избыток фибронектина раствор, и мыть гели три раза в PBS в течение пяти минут за стирку.После последней стирки поместите гидрогели в небольшой объем PBS и стерилизовать гели в течение 15 минут под ультрафиолетовым светом в капюшоне культуры ткани. Затем, мыть гели один раз в свежем PBS. Для покрытия клеток, семя 2,1 раза 10 четыре из клеток, представляющих интерес в трех миллилитров среднего на гидрогеля и позволяют клеткам придерживаться при 37 градусов по Цельсию в течение четырех до 18 часов.В то время как клетки уравновешены, используйте микро-пипетку шкив тянуть тянуть один миллиметр диаметром на 100 миллиметров длиной borosilicate стекла микро-пипетки, чтобы получить конус более двух миллиметров, что уменьшается примерно до 50 микрометров в диаметре в первый миллиметр, и простирается до длинной, параллельной 10 микрометровой трубки диаметром в последний миллиметр. Затем загрузите пипетку в микрофоток и сформировой пипетки, чтобы иметь 15-метровый притупленный наконечник, который заключен в самом конце 250-метровой секции, согнутой при примерно 35-градусном ангеле от остальной части пипетки. Приблизительный диаметр на изгибе должен быть около 30 микрометров, чтобы придать прочность кончику.Затем поместите гидрогель на сцену перевернутого микроскопа. Обложка среды с минеральным маслом и выбрать 10x цели. Стерилизовать подготовленную микро-пипетут с 70%-ым алкоголем.Затем вставьте в держатель микро-пипетки с крючком указал на блюдо, и использовать курс манипулятора, чтобы опустить пипетку, пока крючок просто касается поверхности жидкости. Сосредоточьте микроскоп на клетках, прилипающихся к верхней части геля, и заботясь о том, чтобы цель не была в опасности попадания образца или стадии, привнесите фокус над гелем, чтобы найти кончик микро-пипетки. Поверните пипетку до тех пор, пока кончик перпендикулярно фокусной плоскости, так что тупой кончик микро-пипетки указывает вниз, и переориентировать на кончике пипетки по мере необходимости.Сосредоточьтесь на клеточном слое, чтобы оценить, как далеко пипетка от поверхности геля, и сфокусироваться обратно до плоскости, которая находится на части пути между гелем и кончиком пипетки. Затем медленно опустите пипетку, чтобы достичь промежуточной фокусной плоскости, и увеличьте увеличение до того, что будет использовано в эксперименте, прежде чем опустить пипетку, пока она не зависет чуть выше поверхности Гидрогеля. Для калибровки микро-манипулятора, изображение области, лишенной клеток, области с бисером, но без манипуляций, с пипеткой привлечения гель, и с участием пипетки потянув гель.Затем используйте изображение J, чтобы сравнить поля без бисера с полями бисера без участия, поля бисера с гелем, и вытащил гель для расчета относительных перемещений шарика и силы, применяемой к гелям. Для проведения анализа durotaxis, контролировать группу клеток в течение 30 минут, чтобы определить клетки, которые движутся в направленной манере. Выберите ячейку, которая постоянно движется в одном направлении, и следите за ячейками желаемой частоты кадров в течение еще 30 минут.Далее, положение пипетки около 50 микрометров перед ближайшей стороне передней кромки выбранной ячейки, и переместить микро-манипулятор таким образом, что гель деформируется ортогонально в направлении клетки путешествия. Затем наблюдайте за клеткой с течением времени, когда она реагирует на острый, местный градиент жесткости Гидрогеля. Используя этот метод, как попродемонстрировано, крысы эмбриональных фибробластов двигаться в направлении повышенной жесткости в градиентах, применяемых стекло микро-пипетки.Крысиные эмбриональные фибробластые клетки, преходяще выражаюющие датчик давления винкулина на 125 килопаскальных полиакриламидных гелях, также демонстрируют образование очаговых спаек в направлениях растяжения в течение 40 минут. Форстер Резонанс передачи энергии анализ показывает, что винкулин локализованных для фокусных спаек испытывает немедленное изменение напряжения, когда представлены с острой дуротатической стимуляции. Расширение полезности этого анализа для наблюдения за субклеточной сигнализации событий, в ответ на дуротаксическую стимуляцию.Если вы делаете несколько попыток растянуть клетку, или если микроигла скользит во время анализа, начать все сначала с новой клеткой, чтобы избежать передачи нескольких, переменных, механических стимулов. Помимо своей полезности для анализа durotaxis, этот метод может быть объединен с генетическими подходами, такими как биосенсоры, РНКИ, или редактирование генов, чтобы помочь разграничить молекулярные механизмы, участвующие в механотрансдукции.

Research

JoVE Journal

Biology

Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay

Сотовая Токсичность Nanogenomedicine в MCF-7, клеточная линия: МТТ анализа

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Изображений G-белком рецептор (GPCR)-опосредованной сигнализации События, управления хемотаксис Dictyostelium Discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

FRET микроскопии для мониторинга в реальном времени сигнальных событий в живых клетках Использование Мономолекулярные Биосенсоры

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

Эксплантов анализа для оценки сотовой поведение черепно Мезенхима

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Механическое раздражение индуцированных кальция Распространение волн в монослоев клеток: Пример бычьего эндотелиальных клеток роговицы

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Одноклеточный Микроинъекция для анализа сотовой связи

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

Упрощенная система для оценки клеточной Mechanosensing и Durotaxis<em&gt; In Vitro</em

The composition and mechanical properties of the extracellular matrix are highly variable between tissue types. This connective tissue stroma diversity ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Пространственно-временная Анализ Cytokinetic События в делящихся дрожжей

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Анализ одной ячейки Microfluidic Сенная палочка

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers ...