Name: single cell durotaxis assay for assessing mechanical control of cellular movement and related signaling events
Uploaded: 2019-08-27T14:45:00
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1. Fabricación de hidrogeles de poliacrilamida desformables con microesferas fluorescentes integradas
NOTA: Las instrucciones describen la polimerización de un hidrogel de 25 kPa de 22 m de diámetro y de aproximadamente 66 m de espesor. Todos o cada uno de estos parámetros se pueden modificar y las direcciones para hacerlo se pueden encontrar en el Cuadro 1 y en las notas17.
<ol><li>Activación de platos con fondo de vidri...

<ol>
	<li>Acerbi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+breast+cancer+invasion+and+aggression+correlates+with+ECM+stiffening+and+immune+cell+infiltration.">Human breast cancer invasion and aggression correlates with ECM stiffening and immune cell infiltration.</a> Integrative Biology (Camb. 7 (10), 1120-1134 (2015).</li><li>Mekhdjian, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-mediated+traction+force+enhances+paxillin+molecular+associations+and+adhesion+dynamics+that+increase+the+invasiveness+of+tumor+cells+into+a+three-dimensional+extracellular+matrix.">Integrin-mediated traction force enhances paxillin molecular associations and adhesion dynamics that increase the invasiveness of tumor cells into a three-dimensional extracellular matrix.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (11), 1467-1488 (2017).</li><li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype.">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li><li>Lange, J. R., Fabry, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+tissue+mechanics+in+cell+migration.">Cell and tissue mechanics in cell migration.</a> Experimental Cell Research. 319 (16), 2418-2423 (2013).</li><li>Davidson, L. A., Oster, G. F., Keller, R. E., Koehl, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+mechanical+properties+of+the+blastula+wall+reveal+which+hypothesized+mechanisms+of+primary+invagination+are+physically+plausible+in+the+sea+urchin+Strongylocentrotus+purpuratus.">Measurements of mechanical properties of the blastula wall reveal which hypothesized mechanisms of primary invagination are physically plausible in the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus.</a> Developmental Biology. 209 (2), 221-238 (1999).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mechanical+factors+in+fate+decisions+of+stem+cells.">Role of mechanical factors in fate decisions of stem cells.</a> Regenerative Medicine. 6 (2), 229-240 (2011).</li><li>Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+stiffness+dictates+development,+homeostasis,+and+disease+progression.">Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression.</a> Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).</li><li>Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+movement+is+guided+by+the+rigidity+of+the+substrate.">Cell movement is guided by the rigidity of the substrate.</a> Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).</li><li>Kuo, C. H., Xian, J., Brenton, J. D., Franze, K., Sivaniah, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+stiffness+gradient+substrates+for+studying+mechanotactic+cell+migration.">Complex stiffness gradient substrates for studying mechanotactic cell migration.</a> Advanced Materials. 24 (45), 6059-6064 (2012).</li><li>Breckenridge, M. T., Desai, R. A., Yang, M. T., Fu, J., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrates+with+engineered+step+changes+in+rigidity+induce+traction+force+polarity+and+durotaxis.">Substrates with engineered step changes in rigidity induce traction force polarity and durotaxis.</a> Cell and Molecular Bioengineering. 7 (1), 26-34 (2014).</li><li>Goreczny, G. J., Wormer, D. B., Turner, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+System+for+Evaluating+Cell+Mechanosensing+and+Durotaxis+In+Vitro.">A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e52949 (2015).</li><li>Hartman, C. D., Isenberg, B. C., Chua, S. G., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+cell+durotaxis+depends+on+extracellular+matrix+composition.">Vascular smooth muscle cell durotaxis depends on extracellular matrix composition.</a> Proceedings of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 113 (40), 11190-11195 (2016).</li><li>Vincent, L. G., Choi, Y. S., Alonso-Latorre, B., del Alamo, J. C., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+durotaxis+depends+on+substrate+stiffness+gradient+strength.">Mesenchymal stem cell durotaxis depends on substrate stiffness gradient strength.</a> Biotechnology Journal. 8 (4), 472-484 (2013).</li><li>Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+hydrogels+with+steep+stiffness+gradients+for+studying+cell+mechanical+response.">Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response.</a> PLoS One. 7 (10), e46107 (2012).</li><li>Martinez, J. S., Lehaf, A. M., Schlenoff, J. B., Keller, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+durotaxis+on+polyelectrolyte+multilayers+with+photogenerated+gradients+of+modulus.">Cell durotaxis on polyelectrolyte multilayers with photogenerated gradients of modulus.</a> Biomacromolecules. 14 (5), 1311-1320 (2013).</li><li>Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+fluctuations+within+focal+adhesions+mediate+ECM-rigidity+sensing+to+guide+directed+cell+migration.">Force fluctuations within focal adhesions mediate ECM-rigidity sensing to guide directed cell migration.</a> Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).</li><li>McKenzie, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+microenvironment+regulates+ovarian+cancer+cell+morphology,+migration,+and+spheroid+disaggregation.">The mechanical microenvironment regulates ovarian cancer cell morphology, migration, and spheroid disaggregation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7228 (2018).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Grashoff, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mechanical+tension+across+vinculin+reveals+regulation+of+focal+adhesion+dynamics.">Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics.</a> Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).</li><li>McKenzie, A. J., Campbell, S. L., Howe, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+A+activity+and+anchoring+are+required+for+ovarian+cancer+cell+migration+and+invasion.">Protein kinase A activity and anchoring are required for ovarian cancer cell migration and invasion.</a> PLoS One. 6 (10), e26552 (2011).</li><li>Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyacrylamide+hydrogels+for+cell+mechanics:+steps+toward+optimization+and+alternative+uses.">Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses.</a> Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).</li><li>Plotnikov, S. V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+traction+force+microscopy.">High-resolution traction force microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 123, 367-394 (2014).</li><li>Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+localizing+reporter+fluorescent+beads+near+the+cell+culture+surface+for+traction+force+microscopy.">A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), 51873 (2014).</li></ol>

Aquí se muestra un ensayo repetible de durataxis de una sola célula que permite evaluar la capacidad de una célula para alterar su comportamiento de migración en respuesta a señales mecánicas agudas. Esta técnica también se puede utilizar en combinación con microscopía de fluorescencia y proteínas de fusión o biosensores apropiados para examinar la señalización subcelular y los eventos citoqueléticos en cuestión de segundos de estimulación mecánica o en un plazo más largo durante movimiento durotáctic...

En las últimas décadas, la importancia de las propiedades mecánicas del entorno de una célula ha ganado un reconocimiento creciente en la biología celular. Diferentes tejidos y matrices extracelulares tienen diferentes rigidezes relativas y, a medida que las células migran por todo el cuerpo, navegan por estos cambios, utilizando estas propiedades mecánicas para guiarlos1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7. Las células utilizan la rigidez de un tejido dado para informar su comportamiento móvil durante procesos como el desarrollo, la cicatrización de heridas y la metástasis del cáncer. Sin embargo, los mecanismos moleculares que permiten la sensación y respuesta a estas entradas mecánicas siguen siendo en gran medida desconocidos1,2,3,4,5, 6 , 7.
Para estudiar los mecanismos a través de los cuales las células responden a las señales ambientales físicas, se debe manipular la rigidez o rigidez de las células adherentes subyacentes del sustrato. En 2000, Chun-Min Lo, Yu-Li Wang y sus colegas desarrollaron un ensayo8 por el cual la respuesta móvil de una célula individual a las señales mecánicas cambiantes podría ser probada directamente mediante el estiramiento de la matriz extracelular deformable (ECM) recubierto de poliacrilamida hidrogeles en los que se dolaron las células. Las células exhiben una preferencia significativa por migrar hacia sustratos más rígidos, un fenómeno que llamaron "durotaxis".
Desde el informe original en 2000, se han empleado muchas otras técnicas para el estudio de durotaxis. Los gradientes de rigidez escarpados se han fabricado mediante la fundición de geles sobre características rígidas como cuentas de poliestireno9 o postes de polímero rígido10 o polimerizando el sustrato alrededor de los bordes de una cubierta devidrio1 para crear mecánica ' escales». Alternativamente, los hidrogeles con gradientes de rigidez más superficiales pero fijos han sido fabricados por una variedad de métodos como gradientes de reticulador creados por dispositivos microfluídicos12,13 o gotas de solución de hidrogel lado a lado de rigidezdiferente 8, o hidrogeles con retitulador fotoreactivo tratado con exposición a la luz UV calificada para crear un gradiente de rigidez lineal14,15. Estas técnicas se han utilizado con gran efecto para investigar el movimiento celular durotáctico en masa con el tiempo. Sin embargo, normalmente estas características se fabrican antes del revestimiento de celdas y sus propiedades permanecen consistentes en el transcurso del experimento, confiando en el movimiento aleatorio de las celdas para el muestreo de gradientes mecánicos. Ninguna de estas técnicas es susceptible a la observación de cambios rápidos en el comportamiento celular en respuesta a estímulos mecánicos agudos.
Con el fin de observar las respuestas celulares a los cambios agudos en el entorno mecánico, los ensayos de durataxis de una sola célula ofrecen varias ventajas. En estos ensayos, las células individuales reciben un estímulo mecánico agudo al alejar el sustrato subyacente de la célula con una micropipeta de vidrio, introduciendo así un gradiente direccional de tensión de matriz celular. A continuación, se observan cambios en el comportamiento móvil, como la velocidad o la dirección de la migración, mediante microscopía de contraste de fase de células vivas. Este enfoque facilita la observación directa de las relaciones de causa y efecto entre los estímulos mecánicos y la migración celular, ya que permite una manipulación rápida e iterativa de la dirección y magnitud del gradiente de tensión y la evaluación de los consiguientes respuestas celulares en tiempo real. Además, este método también se puede utilizar para estimular mecánicamente las células que expresan proteínas de fusión fluorescentes o biosensores para visualizar los cambios en la cantidad, actividad o localización subcelular de proteínas sospechosas de estar involucradas en la mechanosensing y durotaxis.
Esta técnica ha sido empleada por grupos que estudian durotaxis8,16 y se describe aquí ya que ha sido adaptada por el Laboratorio Howe para estudiar el comportamiento durotáctico de las células cancerosas de ovario SKOV-3 y los mecanismos moleculares que subyacente durotaxis17. Además, se describe un método modificado para la fabricación de hidrogeles con una sola capa uniforme de microesferas fluorescentes cerca de la superficie de cultivo celular; esto facilita la visualización y optimización de gradientes de tensión generados por micropipette y puede permitir la evaluación de la contractilidad celular mediante microscopía de fuerza de tracción.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylamide 40 %&#160;</td>
			<td>National Diagnostic</td>
			<td>EC-810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP179-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD20A High frequency generator</td>
			<td>Electro Technic Products</td>
			<td>12011A</td>
			<td>115 V -&#160;Handheld Corona Wand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bind Silane (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane) (</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-acrylamide 2%&#160;</td>
			<td>National Diagnostic</td>
			<td>EC-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 2510 Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Bransonic</td>
			<td></td>
			<td>40 kHz frequency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coarse Manipulator</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MC35A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM without phenol red</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Stage Glass Micropipette Puller</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco-aaper</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (Qualified One Shot)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A31606-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>FC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluospheres Carboxylate 0.2 um&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8810, F8807, F8811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene 6</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1815091</td>
			<td>1.5 ug DNA / 6uL fugene 6 per 35mm dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38SI-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Dish</td>
			<td>CellVis</td>
			<td>D60-60-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslip</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72224-01</td>
			<td>22 mm, #1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>9535-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III&#160;Special cleaning concentrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z805939</td>
			<td>Used at 2% in ddH2O for cleaning coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES powder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Make 50mM HEPES buffer, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intelli-Ray 400 Shuttered UV Flood Light</td>
			<td>Uviton International</td>
			<td>UV0338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A417-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MF900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MHW3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanopure Life Science UV/UF System</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>D11931</td>
			<td>ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Bemis Company, Inc</td>
			<td>PM-992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>139 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 28.6 mM Na2HPO4, 1.6 mM KH2PO4, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ref52</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rat embryonic fibroblast cell line; Culture in DMEM + 10% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringer&#39;s Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>134 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2.4 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 5 mM D-Glucose, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKOV-3</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td></td>
			<td>Culture in DMEM + 10% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH&#160;</td>
			<td>Covachem</td>
			<td>&#160;12414-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281-50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell durotaxis assay for assessing mechanical control of cellular movement and related signaling events

Durotaxis es el proceso por el cual las células detectan y responden a gradientes de tensión. Para estudiar este proceso in vitro, se debe manipular la rigidez del sustrato subyacente a una célula. Mientras que los hidrogeles con rigidez calificada y ensayos de migración a largo plazo han demostrado ser útiles en estudios de durotaxis, las respuestas inmediatas y agudas a los cambios locales en la tensión del sustrato permiten el estudio centrado de los movimientos celulares individuales y los eventos de señalización subcelular. Para probar repetidamente la capacidad de las células para detectar y responder a la rigidez del sustrato subyacente, se utiliza un método modificado para la aplicación de gradientes agudos de mayor tensión a las células individuales cultivadas en hidrogeles deformables que permite tiempo real la resistencia y la dirección de los gradientes de rigidez impartidos sobre las células en cuestión. Además, al afinar los detalles y parámetros del ensayo, como la forma y las dimensiones del micropipeta o la posición relativa, la colocación y la dirección del degradado aplicado, el ensayo se puede optimizar para el estudio de cualquier tipo de celda sensible y sistema. Estos parámetros se pueden modificar para cambiar de forma fiable el estímulo aplicado y ampliar la funcionalidad y versatilidad del ensayo. Este método permite el examen tanto del movimiento durotáctico a largo plazo como de cambios más inmediatos en la señalización celular y la dinámica morfológica en respuesta a la rigidez cambiante.

Mediante la preparación de micropipetas (Figura 1) y la normalización de la generación de fuerza de los tiradores (Figura2 y Figura 3) como se ha descrito anteriormente, se han identificado condiciones durasóptimas óptimas para varias líneas celulares. Utilizando esta técnica, como se describe en la Figura4, las células cancerosas de ovario SKOV-317 y los fibroblastos emb...

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Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events

Las fuerzas mecánicas son importantes para controlar la migración celular. Este protocolo demuestra el uso de hidrogeles elásticos que se pueden deformar utilizando una micropipeta de vidrio y un micromanipulador para estimular las células con un gradiente de rigidez local para provocar cambios en la estructura celular y la migración.

Ensayo Desafiador durotaxis de una sola célula para evaluar el control mecánico del movimiento celular y los eventos de señalización relacionados

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate ...

Hay una creciente apreciación por el impacto del microambiente mecánico en la señalización celular y la migración. Necesidad del uso de enfoques únicos y experimentales para proporcionar estimulación mecánica a células individuales. Esta técnica permite la manipulación dinámica del microambiente mecánico debajo de una célula en tiempo real.Permitir la observación de cambios regulados mecánicamente en el comportamiento de migración celular y eventos de señalización subcelular. Demostrando el procedimiento conmigo estarán Nyla Naim, una post-doc y Johnathan Patterson, una técnica de nuestro laboratorio. Comience usando un Chorono-1 para activar la superficie de vidrio de cada resbalón de cubierta inferior durante 20 segundos, antes de colocar inmediatamente 50 microlitros de solución de trabajo de silano de unión en cada resbalón de cubierta.Dejar secar la solución durante 10 minutos antes de enjuagar los resbalones de la cubierta dos veces con 95%etanol y dos veces con isopropanol. Luego, deje que los resbalones de la cubierta se sequen al aire durante aproximadamente 20 minutos. Para la deposición fluorescente de micro-perlas, primero sonicar la solución de micro-perlas de trabajo durante una hora.15 minutos antes del final de la sonicación, coloque los resbalones de la cubierta activada verticalmente en un soporte antideslizante de cubierta de cerámica y transfiera el soporte a un limpiador de plasma de mesa para el tratamiento de plasma de habitación-aire durante tres minutos. A continuación, coloque piezas de película de parafina en tapas de 60 mililitros Petri, y coloque los resbalones de la cubierta en las películas, tocando ligeramente cada resbalón de cubierta para asegurar un buen contacto entre la película y el cubreobjetos. A continuación, añadir 150 microlitros de la solución de perlas de trabajo a la parte superior de cada tapa, y aspirar inmediatamente la solución de etanol desde el lado de los cubreobjetos, dejando las perlas en el cubreobjetos.Para lanzar los Hidrogeles inmediatamente después de su preparación, agregue una gota de 25 microlitros de solución de Hydrogel al lado activado de cada cubreobjetos inferior, e inmediatamente voltee los cubreobjetos superiores con cuentas, del lado del cordón hacia abajo, en la gota. Deje que los geles se polimericen durante 30 minutos antes de usar fórceps para retirar suavemente los cubreobjetos. A continuación, enjuague los geles con lavados de tres, cinco minutos en hepes frescos de 50 miliMoler por lavado.Para activar las superficies de Hydrogels, incubar los geles en hepes frescos de 50 miliMoler, complementados con 0,4 miliMolar Sulfo Sanpah, e inmediatamente exponer los geles a una lámpara de arco ultravioleta en un área cerrada durante 90 segundos. Al final de la activación, lavar los geles con tres, cinco minutos lavados en Hepes frescos, y tratar los Hidrogeles activados con 20 microgramos por mililitro de fibronectina durante una hora a 37 grados Celsius. Al final de la incubación, aspirar el exceso de solución de fibronectina y lavar los geles tres veces en PBS durante cinco minutos por lavado.Después del último lavado, coloque los Hidrogeles en un pequeño volumen de PBS y esterilizar los geles durante 15 minutos bajo luz ultravioleta en una capucha de cultivo de tejido. Luego, lave los geles una vez en PBS fresco. Para el revestimiento celular, siembra 2.1 por 10 las cuatro células de interés en tres mililitros de medio por Hidrogel y permite que las células se adhieran a 37 grados Celsius durante cuatro a 18 horas.Mientras las células se equilibran, utilice un tirador de microtu pipetas para tirar de un diámetro de un milímetro por microtubo de vidrio borosilicato de 100 milímetros de largo, para obtener un cónico de más de dos milímetros que se reduce a aproximadamente 50 micrómetros de diámetro en el primer milímetro, y se extiende a un tubo largo y paralelo de 10 micrómetros de diámetro en el último milímetro. A continuación, cargue la pipeta en un microforge y dé forma a la pipeta para tener una punta contundente de 15 micrómetros que se encierra al final de una sección de 250 micrómetros, doblada a aproximadamente 35 grados de ángel del resto de la pipeta. El diámetro aproximado en la curva debe ser de alrededor de 30 micrómetros para prestar fuerza a la punta.A continuación, coloque un Hidrogel en la etapa de un microscopio invertido. Cubra el medio con aceite mineral y seleccione el objetivo 10x. Esterilice la microtu pipeta preparada con el 70% de alcohol.A continuación, inserte en el soporte de la microtumeta con el gancho apuntando hacia el plato, y utilice el manipulador del curso para bajar la pipeta hasta que el gancho toque la superficie del líquido. Enfoque el microscopio en las células adheridas a la parte superior del gel, y teniendo cuidado de que el objetivo no esté en peligro de golpear la muestra o etapa, lleve el foco por encima del gel para encontrar la punta de la micro-pipeta. Gire la pipeta hasta que la punta sea perpendicular al plano focal, de modo que la punta contundente de la microtumeta apunte hacia abajo, y vuelva a enfocar en la punta de la pipeta según sea necesario.Concéntrese hacia abajo hasta la capa celular para medir qué tan lejos está la pipeta de la superficie del gel, y enfóquelse de nuevo hasta un plano que esté a parte entre el gel y la punta de la pipeta. A continuación, baje lentamente la pipeta para llegar al plano focal intermedio, y aumente el aumento a lo que se utilizará en el experimento, antes de bajar la pipeta hasta que se cierne justo por encima de la superficie del Hidrogel. Para la calibración del micromanipulador, imagine un área desprovista de células, un área con cuentas, pero sin manipulación, con la pipeta enganchando el gel, y con la pipeta comprometida tirando del gel.A continuación, utilice la imagen J para comparar los campos sin cordón con los campos de cuentas sin compromiso, los campos de cuentas con el gel activado y el gel tirado para calcular los desplazamientos relativos del cordón y la fuerza aplicada a los geles. Para llevar a cabo un ensayo de durotaxis, monitoree un grupo de células durante 30 minutos para identificar las células que se mueven de manera dirigida. Seleccione una celda que se esté moviendo constantemente en una dirección y supervise las celdas de la velocidad de fotogramas deseada durante 30 minutos adicionales.A continuación, coloque la pipeta unos 50 micrómetros delante del lado cercano del borde delantero de la celda seleccionada y mueva el micromantelidor de manera que el gel se deforme ortogonalmente a la dirección de desplazamiento de la célula. Luego, observe la célula con el tiempo mientras responde al gradiente local agudo de rigidez de Hidrogel. Usando esta técnica como se ha demostrado, los fibroblastos embrionarios de rata se mueven hacia el aumento de la rigidez en los gradientes aplicados por una microtu pipeta de vidrio.Las células fibroblastas embrionarias de rata, que expresan transitoriamente el sensor de tensión de vinculina en geles de poliacrilamida kilopascale de 125 kilopascales, también demuestran la formación de adherencias focales en las direcciones del estiramiento durante un período de 40 minutos. El análisis de la transferencia de energía de resonancia de Forster revela que la vinculina localizada en las adhesiones focales experimenta un cambio inmediato en la tensión, cuando se presenta con una estimulación durtáctica aguda. Ampliar la utilidad de este ensayo a la observación de eventos de señalización subcelular, en respuesta a la estimulación durtáctica.Si realiza varios intentos de estirar una celda, o si la microapropiela se desliza durante el ensayo, comience de nuevo con una nueva célula para evitar impartir múltiples estímulos mecánicos variables. Más allá de su utilidad para el ensayo de durataxis, esta técnica se puede combinar con enfoques genéticos, como biosensores, RNAI, o edición de genes para ayudar a delinear los mecanismos moleculares involucrados en la mecanotransducción.

Research

JoVE Journal

Biology

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Investigación

Biología

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