Name: single cell durotaxis assay for assessing mechanical control of cellular movement and related signaling events
Uploaded: 2019-08-27T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events at JoVE.com

1. tillverkning av deformerbara Polyakrylamidhydrogels med inbäddade fluorescerande mikrosfärer
Anmärkning: Riktningar beskriver polymerisation av en 25 kPa hydrogel som är 22 μm i diameter och cirka 66 μm tjockt. Varje eller alla dessa parametrar kan ändras och riktningar för att göra det kan hittas i tabell 1 och i noterna17.
<ol><li>Aktivering av glasbotten rätter eller täckband
	<ol>
<li>Förbered bind ...

<ol>
	<li>Acerbi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+breast+cancer+invasion+and+aggression+correlates+with+ECM+stiffening+and+immune+cell+infiltration.">Human breast cancer invasion and aggression correlates with ECM stiffening and immune cell infiltration.</a> Integrative Biology (Camb. 7 (10), 1120-1134 (2015).</li><li>Mekhdjian, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-mediated+traction+force+enhances+paxillin+molecular+associations+and+adhesion+dynamics+that+increase+the+invasiveness+of+tumor+cells+into+a+three-dimensional+extracellular+matrix.">Integrin-mediated traction force enhances paxillin molecular associations and adhesion dynamics that increase the invasiveness of tumor cells into a three-dimensional extracellular matrix.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (11), 1467-1488 (2017).</li><li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype.">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li><li>Lange, J. R., Fabry, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+tissue+mechanics+in+cell+migration.">Cell and tissue mechanics in cell migration.</a> Experimental Cell Research. 319 (16), 2418-2423 (2013).</li><li>Davidson, L. A., Oster, G. F., Keller, R. E., Koehl, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+mechanical+properties+of+the+blastula+wall+reveal+which+hypothesized+mechanisms+of+primary+invagination+are+physically+plausible+in+the+sea+urchin+Strongylocentrotus+purpuratus.">Measurements of mechanical properties of the blastula wall reveal which hypothesized mechanisms of primary invagination are physically plausible in the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus.</a> Developmental Biology. 209 (2), 221-238 (1999).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mechanical+factors+in+fate+decisions+of+stem+cells.">Role of mechanical factors in fate decisions of stem cells.</a> Regenerative Medicine. 6 (2), 229-240 (2011).</li><li>Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+stiffness+dictates+development,+homeostasis,+and+disease+progression.">Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression.</a> Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).</li><li>Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+movement+is+guided+by+the+rigidity+of+the+substrate.">Cell movement is guided by the rigidity of the substrate.</a> Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).</li><li>Kuo, C. H., Xian, J., Brenton, J. D., Franze, K., Sivaniah, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+stiffness+gradient+substrates+for+studying+mechanotactic+cell+migration.">Complex stiffness gradient substrates for studying mechanotactic cell migration.</a> Advanced Materials. 24 (45), 6059-6064 (2012).</li><li>Breckenridge, M. T., Desai, R. A., Yang, M. T., Fu, J., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrates+with+engineered+step+changes+in+rigidity+induce+traction+force+polarity+and+durotaxis.">Substrates with engineered step changes in rigidity induce traction force polarity and durotaxis.</a> Cell and Molecular Bioengineering. 7 (1), 26-34 (2014).</li><li>Goreczny, G. J., Wormer, D. B., Turner, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+System+for+Evaluating+Cell+Mechanosensing+and+Durotaxis+In+Vitro.">A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e52949 (2015).</li><li>Hartman, C. D., Isenberg, B. C., Chua, S. G., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+cell+durotaxis+depends+on+extracellular+matrix+composition.">Vascular smooth muscle cell durotaxis depends on extracellular matrix composition.</a> Proceedings of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 113 (40), 11190-11195 (2016).</li><li>Vincent, L. G., Choi, Y. S., Alonso-Latorre, B., del Alamo, J. C., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+durotaxis+depends+on+substrate+stiffness+gradient+strength.">Mesenchymal stem cell durotaxis depends on substrate stiffness gradient strength.</a> Biotechnology Journal. 8 (4), 472-484 (2013).</li><li>Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+hydrogels+with+steep+stiffness+gradients+for+studying+cell+mechanical+response.">Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response.</a> PLoS One. 7 (10), e46107 (2012).</li><li>Martinez, J. S., Lehaf, A. M., Schlenoff, J. B., Keller, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+durotaxis+on+polyelectrolyte+multilayers+with+photogenerated+gradients+of+modulus.">Cell durotaxis on polyelectrolyte multilayers with photogenerated gradients of modulus.</a> Biomacromolecules. 14 (5), 1311-1320 (2013).</li><li>Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+fluctuations+within+focal+adhesions+mediate+ECM-rigidity+sensing+to+guide+directed+cell+migration.">Force fluctuations within focal adhesions mediate ECM-rigidity sensing to guide directed cell migration.</a> Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).</li><li>McKenzie, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+microenvironment+regulates+ovarian+cancer+cell+morphology,+migration,+and+spheroid+disaggregation.">The mechanical microenvironment regulates ovarian cancer cell morphology, migration, and spheroid disaggregation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7228 (2018).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Grashoff, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mechanical+tension+across+vinculin+reveals+regulation+of+focal+adhesion+dynamics.">Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics.</a> Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).</li><li>McKenzie, A. J., Campbell, S. L., Howe, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+A+activity+and+anchoring+are+required+for+ovarian+cancer+cell+migration+and+invasion.">Protein kinase A activity and anchoring are required for ovarian cancer cell migration and invasion.</a> PLoS One. 6 (10), e26552 (2011).</li><li>Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyacrylamide+hydrogels+for+cell+mechanics:+steps+toward+optimization+and+alternative+uses.">Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses.</a> Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).</li><li>Plotnikov, S. V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+traction+force+microscopy.">High-resolution traction force microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 123, 367-394 (2014).</li><li>Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+localizing+reporter+fluorescent+beads+near+the+cell+culture+surface+for+traction+force+microscopy.">A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), 51873 (2014).</li></ol>

Demonstreras här är en repeterbar, encelliga durotaxis test som möjliggör bedömning av en cells förmåga att förändra sin migration beteende som svar på akuta mekaniska signaler. Denna teknik kan också användas i kombination med fluorescensmikroskopi och lämpliga fusions proteiner eller biosensorer för att undersöka subcellulär signalering och cytoskeletala händelser inom några sekunder efter mekanisk stimulering eller över en längre tidsskala under durotaktisk rörelse. Förstå en cells relation till...

Under de senaste decennierna har vikten av de mekaniska egenskaperna hos en cells miljö samlat allt större erkännande i cellbiologi. Olika vävnader och extracellulära matriser har olika relativa styvheter och, som celler migrerar i hela kroppen, de navigerar dessa förändringar, med hjälp av dessa mekaniska egenskaper för att vägleda dem1,2,3 , 4 , ,5 , 6 , 7. celler använder styvheten hos en given vävnad för att informera deras motila beteende under processer som utveckling, sårläkning, och cancermetastaser. Men de molekylära mekanismer som gör att känslan av och reaktionen på dessa mekaniska ingångar är i stort sett okänd1,2,3,4,5, 6 , 7.
För att studera de mekanismer genom vilka celler reagerar på fysiska Miljösignaler, måste styvheten eller styvheten hos det substrat som underliggande vidsittande celler manipuleras. I 2000, Chun-min Lo, Yu-Li Wang och kollegor utvecklat ett test8 där en enskild cells motila svar på förändrade mekaniska signaler kan testas direkt genom sträckning deformerbara extracellulära matrix (ECM)-belagda polyakrylamid hydrogeler på vilka cellerna var pläterade. Celler uppvisar en betydande preferens för att migrera mot styvare substrat, ett fenomen som de dubbade "durotaxis."
Sedan den ursprungliga rapporten i 2000, många andra tekniker har varit anställd för studiet av durotaxis. Branta styvhet gradienter har tillverkats av gjutning geler över stela funktioner såsom polystyren pärlor9 eller styv polymer inlägg10 eller genom att polymerisera underlaget runt kanterna på ett glas täckband11 för att skapa mekaniska " steg gränser ". Alternativt, hydrogeler med grundare men fast styvhet gradienter har tillverkats av en mängd olika metoder såsom gradienter av crosslinker skapas av mikroflödessystem enheter12,13 eller sida-vid-sida hydrogel lösning droppar av olika styvhet8, eller hydrogeler med fotoreaktiv crosslinker behandlas med graderad UV-ljus exponering för att skapa en linjär styvhet lutning14,15. Dessa tekniker har använts till stor effekt för att undersöka durotaktisk cellulära rörelse en masse över tiden. Emellertid, typiskt dessa funktioner är fabricerade i förväg av cellplätering och deras egenskaper förblir konsekvent under loppet av experimentet, förlitar sig på slumpmässiga cellförflyttning för provtagning av mekaniska gradienter. Ingen av dessa tekniker är mottagliga för observation av snabba förändringar i cellulära beteende som svar på akut mekanisk stimulans.
För att observera cellulära svar på akuta förändringar i den mekaniska miljön, enda cell durotaxis analyser erbjuder flera fördelar. I dessa analyser, enskilda celler ges en akut, mekanisk stimulans genom att dra det underliggande substratet bort från cellen med en glasmikropipett, därigenom införa en riktad gradient av cell-matris spänning. Förändringar i motila beteende, såsom hastighet eller riktning av migration, observeras sedan av levande cell faskontrast mikroskopi. Denna metod underlättar direkt observation av orsak och verkan samband mellan mekaniska stimuli och cell migration, eftersom det möjliggör snabb, iterativ manipulation av riktningen och omfattningen av spänningen lutning och bedömning av åtföljande cellulära svar i realtid. Vidare kan denna metod också användas för att mekaniskt stimulera celler som uttrycker fluorescerande fusions proteiner eller biosensorer för att visualisera förändringar i mängden, aktiviteten eller den subcellulära lokaliseringen av proteiner som misstänks vara involverade i mechanosensing och durotaxis.
Denna teknik har varit anställd av grupper som studerar durotaxis8,16 och beskrivs här som det har anpassats av Howe laboratorium för att studera det durotaktiska beteendet hos SKOV-3 äggstockscancer celler och de molekylära mekanismer som un durotaxis17. Dessutom beskrivs en modifierad metod för tillverkning av hydrogeler med ett enda, jämnt skikt av fluorescerande mikrosfärer nära cellkultur ytan; Detta underlättar visualisering och optimering av mikropipett-genererade stam gradienter och kan möjliggöra bedömning av cell kontraktilitet genom dragkraft mikroskopi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylamide 40 %&#160;</td>
			<td>National Diagnostic</td>
			<td>EC-810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP179-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD20A High frequency generator</td>
			<td>Electro Technic Products</td>
			<td>12011A</td>
			<td>115 V -&#160;Handheld Corona Wand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bind Silane (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane) (</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-acrylamide 2%&#160;</td>
			<td>National Diagnostic</td>
			<td>EC-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 2510 Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Bransonic</td>
			<td></td>
			<td>40 kHz frequency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coarse Manipulator</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MC35A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM without phenol red</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Stage Glass Micropipette Puller</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco-aaper</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (Qualified One Shot)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A31606-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>FC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluospheres Carboxylate 0.2 um&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8810, F8807, F8811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene 6</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1815091</td>
			<td>1.5 ug DNA / 6uL fugene 6 per 35mm dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38SI-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Dish</td>
			<td>CellVis</td>
			<td>D60-60-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslip</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72224-01</td>
			<td>22 mm, #1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>9535-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III&#160;Special cleaning concentrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z805939</td>
			<td>Used at 2% in ddH2O for cleaning coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES powder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Make 50mM HEPES buffer, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intelli-Ray 400 Shuttered UV Flood Light</td>
			<td>Uviton International</td>
			<td>UV0338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A417-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MF900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MHW3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanopure Life Science UV/UF System</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>D11931</td>
			<td>ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Bemis Company, Inc</td>
			<td>PM-992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>139 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 28.6 mM Na2HPO4, 1.6 mM KH2PO4, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ref52</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rat embryonic fibroblast cell line; Culture in DMEM + 10% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringer&#39;s Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>134 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2.4 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 5 mM D-Glucose, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKOV-3</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td></td>
			<td>Culture in DMEM + 10% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH&#160;</td>
			<td>Covachem</td>
			<td>&#160;12414-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281-50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell durotaxis assay for assessing mechanical control of cellular movement and related signaling events

Durotaxis är den process genom vilken celler mening och reagera på gradienter av spänningar. För att studera denna process in vitro måste styvheten hos underlaget som ligger bakom en cell manipuleras. Medan hydrogeler med graderad styvhet och långsiktig migration analyser har visat sig användbara i durotaxis studier, omedelbara, akuta svar på lokala förändringar i substrat spänning tillåta fokuserad studie av enskilda cell rörelser och subcellulära signalering händelser. För att repeterbart testa cellernas förmåga att känna av och reagera på underliggande substrat stelhet, används en modifierad metod för applicering av akuta gradienter av ökad spänning till enskilda celler som odlas på deformerbara hydrogeler som möjliggör realtids manipulation av styrkan och riktningen av styvhet gradienter förmedlas på celler i fråga. Dessutom, genom att finjustera detaljerna och parametrarna för analysen, såsom form och dimensioner av mikropipett eller den relativa positionen, placering och riktning av den tillämpade gradienten, kan analysen optimeras för studier av alla mekaniskt känslig celltyp och system. Dessa parametrar kan ändras för att tillförlitligt ändra den tillämpade stimulansen och utöka funktionaliteten och mångsidigheten hos analysen. Denna metod möjliggör undersökning av både långsiktig durotaktisk rörelse samt mer omedelbara förändringar i cellulära signalering och morfologisk dynamik som svar på förändrade styvhet.

Genom att förbereda Mikropipetter (figur 1) och normalisera kraft genereringen av handtagen (figur 2 och figur 3) som beskrivits ovan, har optimala durotaktiska förhållanden identifierats för flera cellinjer. Med hjälp av denna teknik, som beskrivs i figur 4, både SKOV-3 äggstockscancer celler17 och Ref52 råtta embryonala fibroblaster (figur 5</strong...

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events at JoVE.com

Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events

Mekaniska krafter är viktiga för att styra cell migration. Detta protokoll visar användningen av elastiska hydrogeler som kan deformeras med hjälp av en glasmikropipett och en micromanipulator för att stimulera celler med en lokal styvhet gradient för att framkalla förändringar i cellstruktur och migration.

Enkel cell Durotaxis analys för bedömning av mekanisk kontroll av cellulära rörelser och relaterade signalering händelser

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate ...

Det finns en växande uppskattning för den mekaniska mikroombyggnadens inverkan på cellsignalering och migration. Nödvändiggör användningen av unika, experimentella metoder för att leverera mekanisk stimulering till enskilda cell. Denna teknik gör det möjligt dynamisk manipulation av den mekaniska mikro-miljö under en cell i realtid.Att tillåta observation av mekaniskt reglerade förändringar i cell migration beteende, och sub-cellulära signalering händelser. Demonstrerar proceduren med mig blir Nyla Naim, en post-doc och Johnathan Patterson, en tekniker från vårt laboratorium. Börja med att använda en Chorono-1 för att aktivera glasytan på varje bottenkåpa glida i 20 sekunder, innan omedelbart över-läggning 50 mikroliter av binda silan arbetslösning på varje täcka slip.Låt lösningen torka i 10 minuter innan du sköljer av locket två gånger med 95%etanol och två gånger med isopropanol. Låt sedan täcklocket lufttorka i cirka 20 minuter. För fluorescerande mikro-pärla nedfall, först sonikera den arbetande mikro-pärla lösning för en timme.15 minuter före slutet av ultraljudsbehandling, placera den aktiverade locket glider vertikalt i en keramisk täcka slip innehavaren och överföra innehavaren i en tabell-top plasma renare för rum-luft plasmabehandling i tre minuter. Placera sedan bitar av paraffinfilm i 60 milliliter Petriskållock och placera locket glider på filmerna, lätt knacka varje omslagsslip för att säkerställa en god kontakt mellan filmen och täcket. Tillsätt sedan 150 mikroliter av den arbetande pärllösningen till toppen av varje coverslip, och omedelbart aspirera etanollösningen från sidan av täcken, vilket lämnar pärlorna på täcket.För att kasta Hydrogels omedelbart efter deras framställning, tillsätt en 25 microliter droppe Hydrogel lösning till den aktiverade sidan av varje botten coverslip, och omedelbart vända pärlstav topp täcken, pärla-sida ner, på droppen. Låt gelerna polymerisera i 30 minuter innan du använder tång för att försiktigt ta bort täcken. Skölj sedan gelerna med tre, fem minuters tvättar i färska 50 miliMoler Hepes per tvätt.För att aktivera Hydrogelsytorna, inkubera gelerna i färsk 50 miliMoler Hepes, kompletterad med 0,4 miliMolar Sulfo Sanpah, och omedelbart exponera gelerna till en ultraviolett båge lampa i ett slutet område i 90 sekunder. I slutet av aktiveringen, tvätta gelerna med tre, fem minuters tvättar i färska Hepes, och behandla de aktiverade Hydrogels med 20 mikrogram per milliliter fibronectin i en timme vid 37 grader Celsius. Vid slutet av inkubationen, aspirera överskottet fibronectin lösning, och tvätta gelerna tre gånger i PBS i fem minuter per tvätt.Efter den sista tvätten, placera Hydrogels i en liten volym PBS och sterilisera gelerna i 15 minuter under ultraviolett ljus i en vävnad kultur huva. Sedan tvätta gelerna en gång i färsk PBS. För cellplätering, utsäde 2,1 gånger 10 de fyra av de celler av intresse i tre milliliter av medium per-Hydrogel och låta cellerna att hålla vid 37 grader Celsius i fyra till 18 timmar.Medan cellerna är equilibrating, använd en mikro-pipetter puller att dra en millimeter diameter med 100 millimeter lång borosilikat glas mikro-pipetten, för att få en kona på över två millimeter som minskar till cirka 50 mikrometer i diameter i första millimetern, och sträcker sig till en lång, parallell 10 mikrometer diameter rör i sista millimetern. Därefter, ladda pipetten i en mikroforge och forma pipetten för att ha en 15 mikrometer avtrubbad spets som är innesluten i själva änden av en 250 mikrometer sektion, böjd i ungefär 35 graders ängel från resten av pipetten. Den ungefärliga diametern vid böjningen bör vara runt 30 mikrometer för att ge styrka till spetsen.Därefter placerar en Hydrogel på scenen av ett inverterat mikroskop. Täck mediet med mineralolja och välj 10x-målsättningen. Sterilisera den förberedda mikropipetten med 70%-alkoholen.Sätt sedan in i mikropipetthållaren med kroken riktad mot skålen och använd kursmanipulatorn för att sänka pipetten tills kroken bara vidrör vätskans yta. Fokusera mikroskopet på cellerna som följs till toppen av gelén, och var försiktig med att målet inte är i fara att träffa provet eller scenen, ta fokus ovanför gelen för att hitta toppen av mikropipetten. Rotera pipetten tills spetsen är vinkelrätt mot fokalplanet, så att mikropipettens avtrubbade spets pekar nedåt, och fokusera om på pipettens spets vid behov.Fokusera tillbaka ner till cellskiktet för att mäta hur långt pipetten är från gelytan, och fokusera tillbaka upp till ett plan som är en bit mellan gelen och spetsen på pipetten. Sänk sedan långsamt pipetten för att nå det mellanliggande fokalplanet, och öka förstoringen till det som kommer att användas i experimentet, innan pipetten sänks tills den svävar strax ovanför Hydrogels yta. För mikro-manipulator kalibrering, bild ett område saknar celler, ett område med pärlor, men ingen manipulation, med pipetten engagerande gelen, och med engagerade pipetten dra gelen.Använd sedan bild J för att jämföra de inga pärlfälten med pärlfälten utan engagemang, pärlfälten med gelen inkopplad och den dragna gelen för att beräkna de relativa pärlförskjutningarna och kraften som appliceras på gelerna. För att genomföra en durotaxis-analys, övervaka en grupp celler i 30 minuter för att identifiera celler som rör sig på ett riktat sätt. Markera en cell som stadigt rör sig i en riktning, och övervaka cellerna i önskad bildfrekvens i ytterligare 30 minuter.Därefter placerar pipetten ca 50 mikrometer framför den nära sidan av framkanten av den valda cellen, och flytta mikro-manipulatorn så att gelen deformeras ortogonalt till cellens färdriktning. Sedan observera cellen över tiden när den svarar på den akuta, lokala gradienten av Hydrogelstyvhet. Med hjälp av denna teknik som visat, råtta embryonala fibroblaster gå mot den ökade stelhet i gradienter tillämpas av ett glas mikro-pipetter.Råtta embryonala fibroblast celler, transiently uttrycker vinculin spänning sensor på 125 kilopascal polyakrylamide geler visar också bildandet av fokala sammanväxningar i riktningar sträckan under en period av 40 minuter. Forster Resonance Energy Transfer analys visar att vinculin lokaliserade till fokala adhesions upplever en omedelbar förändring i spänning, när de presenteras med en akut durotaktisk stimulering. Utöka nyttan av denna analys till observation av sub-cellulära signalering händelser, som svar på durotaktisk stimulering.Om du gör flera försök att sträcka ut en cell, eller om mikrodockan glider under analysen, börja om med en ny cell för att undvika att förmedla flera, variabla, mekaniska stimuli. Utöver dess nytta för assaying durotaxis, denna teknik kan kombineras med genetiska metoder, såsom biosensorer, RNAI, eller genredigering för att hjälpa avgränsa de molekylära mekanismer som deltar i mekanotransduction.

Research

JoVE Journal

Biology

Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay

Cellulär toxicitet av Nanogenomedicine i MCF-7 Cell Line: MTT assay

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Imaging G-proteinkopplade receptor (GPCR)-medierad signalering Händelser som Kontroll chemotaxis av Dictyostelium Discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

FRET mikroskopi för realtidsövervakning av signalering händelser i levande celler Använda unimolekylära Biosensorer

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

Ett explantat analys för bedömning Cellular Beteende för Kranial mesenkym

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Mekanisk stimulering-inducerad Kalcium vågutbredning i cellmonoskikt: exemplet Nötkreatur hornhinnan endotelceller

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Encelliga mikroinjektion för analys Cell Communication

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

Ett förenklat system för utvärdering Cell Mechanosensing och Durotaxis<em&gt; In Vitro</em

The composition and mechanical properties of the extracellular matrix are highly variable between tissue types. This connective tissue stroma diversity ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Spatiotemporal Analys av Cytokinetic händelser i fissionsjäst

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Encelliga mikroflödessystem analys av Bacillus subtilis

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers ...