Name: single cell durotaxis assay for assessing mechanical control of cellular movement and related signaling events
Uploaded: 2019-08-27T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events at JoVE.com

1. Gömülü Floresan Mikroküreler ile Deforme Polyakrilamid Hidrojellerin İmalatı
NOT: Yönler, 22 μm çapında ve yaklaşık 66 m kalınlığında 25 kPa hidrojelin polimerizasyonunu tanımlar. Bu parametrelerin her biri veya tümü değiştirilebilir ve bunu yapmak için yol tarifi Tablo 1'de ve17.
<ol><li>Cam dipli tabakların veya kapak kapaklarının aktivasyonu
	<ol>
<li>Bir cam tabanlı görüntüleme çan...

<ol>
	<li>Acerbi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+breast+cancer+invasion+and+aggression+correlates+with+ECM+stiffening+and+immune+cell+infiltration.">Human breast cancer invasion and aggression correlates with ECM stiffening and immune cell infiltration.</a> Integrative Biology (Camb. 7 (10), 1120-1134 (2015).</li><li>Mekhdjian, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-mediated+traction+force+enhances+paxillin+molecular+associations+and+adhesion+dynamics+that+increase+the+invasiveness+of+tumor+cells+into+a+three-dimensional+extracellular+matrix.">Integrin-mediated traction force enhances paxillin molecular associations and adhesion dynamics that increase the invasiveness of tumor cells into a three-dimensional extracellular matrix.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (11), 1467-1488 (2017).</li><li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype.">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li><li>Lange, J. R., Fabry, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+tissue+mechanics+in+cell+migration.">Cell and tissue mechanics in cell migration.</a> Experimental Cell Research. 319 (16), 2418-2423 (2013).</li><li>Davidson, L. A., Oster, G. F., Keller, R. E., Koehl, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+mechanical+properties+of+the+blastula+wall+reveal+which+hypothesized+mechanisms+of+primary+invagination+are+physically+plausible+in+the+sea+urchin+Strongylocentrotus+purpuratus.">Measurements of mechanical properties of the blastula wall reveal which hypothesized mechanisms of primary invagination are physically plausible in the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus.</a> Developmental Biology. 209 (2), 221-238 (1999).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mechanical+factors+in+fate+decisions+of+stem+cells.">Role of mechanical factors in fate decisions of stem cells.</a> Regenerative Medicine. 6 (2), 229-240 (2011).</li><li>Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+stiffness+dictates+development,+homeostasis,+and+disease+progression.">Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression.</a> Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).</li><li>Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+movement+is+guided+by+the+rigidity+of+the+substrate.">Cell movement is guided by the rigidity of the substrate.</a> Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).</li><li>Kuo, C. H., Xian, J., Brenton, J. D., Franze, K., Sivaniah, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+stiffness+gradient+substrates+for+studying+mechanotactic+cell+migration.">Complex stiffness gradient substrates for studying mechanotactic cell migration.</a> Advanced Materials. 24 (45), 6059-6064 (2012).</li><li>Breckenridge, M. T., Desai, R. A., Yang, M. T., Fu, J., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrates+with+engineered+step+changes+in+rigidity+induce+traction+force+polarity+and+durotaxis.">Substrates with engineered step changes in rigidity induce traction force polarity and durotaxis.</a> Cell and Molecular Bioengineering. 7 (1), 26-34 (2014).</li><li>Goreczny, G. J., Wormer, D. B., Turner, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+System+for+Evaluating+Cell+Mechanosensing+and+Durotaxis+In+Vitro.">A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e52949 (2015).</li><li>Hartman, C. D., Isenberg, B. C., Chua, S. G., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+cell+durotaxis+depends+on+extracellular+matrix+composition.">Vascular smooth muscle cell durotaxis depends on extracellular matrix composition.</a> Proceedings of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 113 (40), 11190-11195 (2016).</li><li>Vincent, L. G., Choi, Y. S., Alonso-Latorre, B., del Alamo, J. C., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+durotaxis+depends+on+substrate+stiffness+gradient+strength.">Mesenchymal stem cell durotaxis depends on substrate stiffness gradient strength.</a> Biotechnology Journal. 8 (4), 472-484 (2013).</li><li>Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+hydrogels+with+steep+stiffness+gradients+for+studying+cell+mechanical+response.">Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response.</a> PLoS One. 7 (10), e46107 (2012).</li><li>Martinez, J. S., Lehaf, A. M., Schlenoff, J. B., Keller, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+durotaxis+on+polyelectrolyte+multilayers+with+photogenerated+gradients+of+modulus.">Cell durotaxis on polyelectrolyte multilayers with photogenerated gradients of modulus.</a> Biomacromolecules. 14 (5), 1311-1320 (2013).</li><li>Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+fluctuations+within+focal+adhesions+mediate+ECM-rigidity+sensing+to+guide+directed+cell+migration.">Force fluctuations within focal adhesions mediate ECM-rigidity sensing to guide directed cell migration.</a> Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).</li><li>McKenzie, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+microenvironment+regulates+ovarian+cancer+cell+morphology,+migration,+and+spheroid+disaggregation.">The mechanical microenvironment regulates ovarian cancer cell morphology, migration, and spheroid disaggregation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7228 (2018).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Grashoff, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mechanical+tension+across+vinculin+reveals+regulation+of+focal+adhesion+dynamics.">Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics.</a> Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).</li><li>McKenzie, A. J., Campbell, S. L., Howe, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+A+activity+and+anchoring+are+required+for+ovarian+cancer+cell+migration+and+invasion.">Protein kinase A activity and anchoring are required for ovarian cancer cell migration and invasion.</a> PLoS One. 6 (10), e26552 (2011).</li><li>Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyacrylamide+hydrogels+for+cell+mechanics:+steps+toward+optimization+and+alternative+uses.">Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses.</a> Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).</li><li>Plotnikov, S. V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+traction+force+microscopy.">High-resolution traction force microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 123, 367-394 (2014).</li><li>Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+localizing+reporter+fluorescent+beads+near+the+cell+culture+surface+for+traction+force+microscopy.">A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), 51873 (2014).</li></ol>

Burada gösterildiği tekrarlanabilir, tek hücreli durotaksis titreşme akut mekanik ipuçlarına yanıt olarak bir hücrenin göç davranışını değiştirmek için yeteneğinin değerlendirilmesi sağlar. Bu teknik aynı zamanda floresan mikroskobu ve uygun füzyon proteinleri veya biyosensörler ile birlikte mekanik stimülasyon saniye içinde veya daha uzun bir zaman ölçeği sırasında hücre altı sinyalizasyon ve sitoskeletal olayları incelemek için kullanılabilir durotaktik hareket. Bir hücrenin çevresi...

Son birkaç on yıl içinde, bir hücrenin çevremekanik özelliklerinin önemi hücre biyolojisinde giderek daha fazla tanıma kazanmıştır. Farklı dokular ve hücre dışı matrisler farklı göreceli sertliklere sahiptir ve hücreler vücuda göç ettikçe, bu değişiklikleri yönlendirirler, bu mekanik özellikleri kullanarak onlara rehberlik ederler1,2,3 , 4.2.2 , 5.000 , 6.000 , 7. Hücreler geliştirme, yara iyileşmesi ve kanser metastazı gibi süreçler sırasında onların hareketli davranış bilgilendirmek için belirli bir doku sertliği kullanın. Ancak, bu mekanik girdilerin hissi ve yanıt sağlayan moleküler mekanizmalar büyük ölçüde bilinmeyen kalır1,2,3,4,5, 6.000 , 7 .
Hücrelerin fiziksel çevresel ipuçlarına yanıt verme mekanizmalarını incelemek için, alt tabakanın alt tabakadaki katılığı veya sertliği manipüle edilmelidir. 2000 yılında, Chun-Min Lo, Yu-Li Wang ve meslektaşları değişen mekanik ipuçları için bireysel bir hücrenin hareketli yanıt doğrudan deforme ekstrasellüler matriks (ECM) kaplı poliakrilamid germe tarafından test edilebilir böylece bir test8 geliştirdi hücrelerin kaplandığı hidrojeller. Hücreler daha sert yüzeylere göç etmek için önemli bir tercih sergilerler, bu fenomen "durotaksis" olarak adlandırılır.
2000 yılında orijinal raporundan bu yana, birçok diğer teknikler durotaksis çalışmaları için istihdam edilmiştir. Dik sertlik degradeleri polistiren boncuklar9 veya sert polimer direkleri 10 gibi sert özellikleri üzerinde jeller döküm tarafından imal edilmiştir veya mekanik oluşturmak için bir cam kapakları11 kenarlarında substrat polimerize tarafından ' adım-sınırlar'. Alternatif olarak, sığ ama sabit sertlik gradyanları ile hidrojeller mikroakışkan cihazlar12tarafındanoluşturulan crosslinker gradyanları 12,13 veya yan yana hidrojel çözelti damlacıkları gibi çeşitli yöntemler tarafından imal edilmiştir farklı sertlik8, veya doğrusal sertlik gradyan oluşturmak için dereceli UV ışık maruziyeti ile tedavi fotoreaktif crosslinker ile hidrojeller14,15. Bu teknikler zaman içinde kitlesel durotaktik hücresel hareketi araştırmak için büyük etkisi kullanılmıştır. Ancak, tipik olarak bu özellikler hücre kaplaması öncesinde imal edilir ve özellikleri mekanik degradelerin örneklemesi için rastgele hücre hareketine güvenerek deney boyunca tutarlı kalır. Bu tekniklerin hiçbiri akut mekanik uyaranlara yanıt olarak hücresel davranışta hızlı değişikliklerin gözlemleneme elverişli değildir.
Mekanik ortamdaki akut değişikliklere hücresel tepkileri gözlemlemek için, tek hücreli durotaksis tahlilleri çeşitli avantajlar sunar. Bu tahlillerde, tek tek hücrelere, altta yatan substratı cam bir mikropipetle hücreden çekerek akut, mekanik bir uyarıcı verilir ve bu da hücre-matris geriliminin yön gradyanı nı ortaya çıkarır. Geçiş hızı veya yönü gibi hareketli davranıştaki değişiklikler daha sonra canlı hücre faz kontrast mikroskobu ile gözlenir. Bu yaklaşım, gerilim degradesinin yönünün ve büyüklüğünün hızlı, yinelemeli manipülasyonuna ve buna bağlı olarak değerlendirilmesine olanak sağladığından, mekanik uyaranlar ve hücre göçü arasındaki neden-sonuç ilişkilerinin doğrudan gözlemleni kolaylaştırır. gerçek zamanlı hücresel tepkiler. Ayrıca, bu yöntem, mechanosensing ve dahil olduğundan şüphelenilen proteinlerin miktarı, aktivitesi veya hücre altı lokalizasyonu değişiklikleri görselleştirmek için floresan füzyon proteinleri veya biyosensörler ifade hücreleri mekanik olarak uyarmak için kullanılabilir ve durotaksis.
Bu teknik durotaksis8,16 çalışma grupları tarafından istihdam edilmiştir ve burada Howe Laboratuvarı tarafından SKOV-3 yumurtalık kanseri hücrelerinin durotaktik davranışı ve moleküler mekanizmaları incelemek için adapte olduğu gibi tanımlanmıştır underly durotaxis17. Ayrıca, değiştirilmiş bir yöntem hücre kültürü yüzeyine yakın floresan mikroküreler tek, hatta tabaka ile hidrojellerin imalatı için açıklanmıştır; mikropipet tarafından üretilen gerinim gradyanlarının görselleştirilmesini ve optimizasyonunu kolaylaştırır ve çile kuvvet mikroskobu ile hücre kontraktilliğinin değerlendirilmesini sağlar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylamide 40 %&#160;</td>
			<td>National Diagnostic</td>
			<td>EC-810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP179-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD20A High frequency generator</td>
			<td>Electro Technic Products</td>
			<td>12011A</td>
			<td>115 V -&#160;Handheld Corona Wand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bind Silane (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane) (</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-acrylamide 2%&#160;</td>
			<td>National Diagnostic</td>
			<td>EC-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 2510 Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Bransonic</td>
			<td></td>
			<td>40 kHz frequency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coarse Manipulator</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MC35A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM without phenol red</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Stage Glass Micropipette Puller</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco-aaper</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (Qualified One Shot)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A31606-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>FC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluospheres Carboxylate 0.2 um&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8810, F8807, F8811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene 6</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1815091</td>
			<td>1.5 ug DNA / 6uL fugene 6 per 35mm dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38SI-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Dish</td>
			<td>CellVis</td>
			<td>D60-60-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslip</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72224-01</td>
			<td>22 mm, #1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>9535-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III&#160;Special cleaning concentrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z805939</td>
			<td>Used at 2% in ddH2O for cleaning coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES powder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Make 50mM HEPES buffer, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intelli-Ray 400 Shuttered UV Flood Light</td>
			<td>Uviton International</td>
			<td>UV0338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A417-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MF900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>MHW3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanopure Life Science UV/UF System</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>D11931</td>
			<td>ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Bemis Company, Inc</td>
			<td>PM-992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>139 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 28.6 mM Na2HPO4, 1.6 mM KH2PO4, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ref52</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rat embryonic fibroblast cell line; Culture in DMEM + 10% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringer&#39;s Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>134 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2.4 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 5 mM D-Glucose, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKOV-3</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td></td>
			<td>Culture in DMEM + 10% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH&#160;</td>
			<td>Covachem</td>
			<td>&#160;12414-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281-50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell durotaxis assay for assessing mechanical control of cellular movement and related signaling events

Durotaksis, hücrelerin gerilim degradelerini algılama ve tepki verme sürecidir. Bu süreci in vitro olarak incelemek için, bir hücrenin altında yatan substrat sertliği manipüle edilmelidir. Dereceli sertlik ve uzun süreli göç testleri ile hidrojeller durotaksis çalışmalarında yararlı kanıtlanmış olsa da, substrat gerginliği yerel değişikliklere hemen, akut tepkiler bireysel hücre hareketleri ve subselliler sinyal olayları odaklanmış çalışma sağlar. Hücrelerin altta yatan substrat sertliğini algılama ve yanıt verme yeteneğini tekrar tekrar test etmek için, deforme edilebilir hidrojeller üzerinde kültürlenmiş bireysel hücrelere artan gerilimin akut degradelerinin uygulanması için değiştirilmiş bir yöntem kullanılır ve bu yöntem gerçek zamanlı olarak söz konusu hücrelere verilen sertlik degradelerinin gücü ve yönünün manipülasyonu. Ayrıca, mikropipetin şekli ve boyutları veya uygulanan degradenin göreceli konumu, yerleşimi ve yönü gibi tayın ayrıntılarını ve parametrelerini ince ayarlayarak, hassas hücre tipi ve sistemi. Bu parametreler, uygulanan uyaranları güvenilir bir şekilde değiştirmek ve talın işlevselliğini ve çok yönlülüğünü genişletmek için değiştirilebilir. Bu yöntem, değişen sertliğe yanıt olarak hem uzun süreli durotaktik hareketin hem de hücresel sinyalizasyon ve morfolojik dinamiklerde daha acil değişikliklerin incelenmesini sağlar.

Yukarıda açıklandığı gibi mikropipetler (Şekil 1) hazırlanarak ve çekme kuvveti oluşumunu normalleştirerek (Şekil2 ve Şekil 3)birden fazla hücre hattı için optimal durotaktik koşullar tanımlanmıştır. Şekil4'te belirtildiği gibi bu tekniği kullanarak, hem SKOV-3 yumurtalık kanseri hücreleri17 hem de Ref52 sıçan embriyonik fibroblastları (Şekil<strong ...

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events at JoVE.com

Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events

Mekanik kuvvetler hücre göçlerini kontrol etmek için önemlidir. Bu protokol, hücre yapısı ve göç değişiklikleri ortaya çıkarmak için yerel bir sertlik gradyan ile hücreleri uyarmak için bir cam mikropipette ve bir mikromanipülatör kullanılarak deforme edilebilir elastik hidrojellerin kullanımını göstermektedir.

Hücresel Hareketin Mekanik Kontrolünün Ve İlgili Sinyal Olaylarının Değerlendirilmesi için Tek Hücreli Durotaksis Tsay

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate ...

Mekanik mikroortamın hücre sinyalizasyonu ve göçü üzerindeki etkisi ne kadar takdir edilebilip bulunulmaktadır. Tek tek hücreye mekanik stimülasyon sağlamak için benzersiz, deneysel yaklaşımların kullanılmasını gerektirir. Bu teknik, bir hücrenin altındaki mekanik mikro ortamın gerçek zamanlı olarak dinamik olarak manipüle edilebilmektedir.Hücre göçü davranışında mekanik olarak düzenlenmiş değişikliklerin ve hücre altı sinyal olaylarının gözlemlemesine izin vermek. Prosedürü benimle birlikte gösteren nyla Naim, bir post-doc ve Johnathan Patterson, bizim laboratuvar bir teknisyen olacaktır. Her alt kapak fişinin cam yüzeyini 20 saniye boyunca etkinleştirmek için bir Chorono-1 kullanarak başlayın, her kapak fişinin üzerine hemen 50 mikrolitre bağlama silane çalışma çözeltisi döşenmeden önce.Kapağı durulamadan önce çözeltinin %95 etanol ve iki kez isopropanol ile iki kez durulanmadan önce 10 dakika kurumasını bekleyin. Daha sonra, kapak fişleri yaklaşık 20 dakika kuru hava sağlar. Floresan mikro boncuk birikimi için, ilk bir saat boyunca çalışan mikro boncuk çözeltisi sonicate.Sonication'ın bitiminden 15 dakika önce, aktif kapak fişlerini seramik kapak tutucuya dikey olarak yerleştirin ve tutucuyu üç dakika boyunca oda havaplazması tedavisi için masa üstü plazma temizleyicisine aktarın. Daha sonra, 60 mililitre petri çanak kapakları parafin film parçaları yerleştirin ve film ve coverslip arasında iyi bir temas sağlamak için hafifçe her kapak fişi dokunarak, filmler üzerine kapak fişleri yerleştirin. Daha sonra, her coverslip üstüne çalışan boncuk çözeltisi 150 mikrolitre ekleyin ve hemen coverlips kenarından etanol çözeltisi aspire, coverslip üzerinde boncuk bırakarak.Hydrogels'i hazırlıklarından hemen sonra atmak için, her alt kapağın aktif tarafına 25 mikrolitrelik bir Hydrogel çözeltisi damlatın ve hemen boncuklu üst kapakları damlacık üzerine ters çevirin. Kapakları nazikçe çıkarmak için forseps kullanmadan önce jellerin 30 dakika polimerize olmasını bekleyin. Sonra, yıkama başına taze 50 miliMoler Hepes üç, beş dakika yıkar ile jelleri durulayın.Hydrogels yüzeyleri etkinleştirmek için, taze jeller kuluçka 50 miliMoler Hepes, 0.4 miliMolar Sulfo Sanpah ile takviye, ve hemen kapalı bir alanda ultraviyole kemer lamba jelleri maruz 90 saniye. Aktivasyon sonunda, taze Hepes üç, beş dakikalık yıkar ile jelleri yıkayın ve 37 santigrat derece bir saat için fibronectin mililitre başına 20 mikrogram ile aktive Hydrogels tedavi. Kuluçka sonunda, aşırı fibronektin çözeltisi aspire ve yıkama başına beş dakika PBS üç kez jelleri yıkayın.Son yıkamadan sonra Hydrogels'i küçük bir hacimde PBS'ye yerleştirin ve jelleri bir doku kültürü başlığında ultraviyole ışık altında 15 dakika sterilize edin. Sonra, taze PBS bir kez jelleri yıkayın. Hücre kaplaması için, tohum 2.1 kez 10 orta başına üç mililitre ilgi hücrelerinin dört ve hücrelerin 4 ila 18 saat boyunca 37 derece santigrat yapışmasını sağlar.Hücreler dengelenirken, bir milimetre çapında 100 milimetre uzunluğunda borosilicate cam mikro-pipet çekmek için bir mikro-pipet çekmece kullanın, ilk milimetre çapı yaklaşık 50 mikrometre ye kadar azaltır iki milimetrenin üzerinde bir konik elde etmek için, ve son milimetre içinde uzun, paralel 10 mikrometre çapında tüp kadar uzanır. Daha sonra, pipeti bir mikroforge içine yükleyin ve pipet insanın geri kalanından yaklaşık 35 derece melek bükülmüş bir 250 mikrometre bölümü tam sonunda kapalı bir 15 mikrometre körpli ucu var şekli. Bükümde yaklaşık çapı ucuna mukavemet vermek için yaklaşık 30 mikrometre olmalıdır.Daha sonra, ters bir mikroskop aşamasına bir Hydrogel yerleştirin. Orta yı mineral yağile kaplayın ve 10x hedefini seçin. Hazırlanan mikro pipeti %70 alkol le sterilize edin.Daha sonra, çanağa doğru işaret kanca ile mikro-pipet tutucu içine takın ve kanca sadece sıvı yüzeyine dokunan kadar pipet düşürmek için ders manipülatör kullanın. Mikroskobu jelin üst kısmına yapışan hücrelere odakla ve amacın numuneye veya aşamaya çarpma tehlikesi olmadığına dikkat edin, mikro pipetin ucunu bulmak için odağı jelin üzerine getirin. Ucu odak düzlemine dik olana kadar pipeti döndürün, böylece mikro pipetin körelmiş ucu aşağı yaslanır ve gerektiğinde pipetin ucuna yeniden odaklanın.Pipetin jel yüzeyinden ne kadar uzakta olduğunu ölçmek için hücre katmanına geri odaklanın ve jel ile pipetin ucu arasında yarı yolda olan bir düzleme odaklanın. Daha sonra, ara odak düzlemine ulaşmak için pipeti yavaşça indirin ve pipeti Hydrogel'in yüzeyinin hemen üzerinde gezinene kadar indirmeden önce deneyde kullanılacak olana büyütmeyi artırın. Mikro-manipülatör kalibrasyonu için, hücrelerden yoksun bir alanı, boncuklu bir alanı, ama manipülasyon yok, pipet jeli çekerek ve devreye giren pipetle jeli çekerek görüntüleyin.Daha sonra, nişan olmadan boncuk alanları için boncuk alanları karşılaştırmak için görüntü J kullanın, jel meşgul ile boncuk alanları, ve göreceli boncuk deplasmanları ve jeller uygulanan kuvvet hesaplamak için çekilen jel. Durotaksis titretisi yapmak için, yönlendirilmiş bir şekilde hareket eden hücreleri tanımlamak için bir grup hücreyi 30 dakika boyunca izleyin. Tek bir yönde sürekli hareket eden bir hücre seçin ve istenen kare hızındaki hücreleri 30 dakika daha izleyin.Daha sonra, pipeti seçili hücrenin ön kenarının yakın tarafının yaklaşık 50 mikrometre önüne yerleştirin ve mikro manipülatörü jelin ortogonal olarak hücrenin hareket yönüne doğru hareket ettirin. Daha sonra, hidrojel sertliğinin akut, lokal degradesine yanıt verebilmek için hücreyi zaman içinde gözlemleyin. Gösterildiği gibi bu tekniği kullanarak, sıçan embriyonik fibroblastlar bir cam mikro-pipet tarafından uygulanan degradelerde artan sertlik doğru hareket.Sıçan embriyonik fibroblast hücreleri, geçici 125 kilopascal poliakrilamid jeller üzerinde vinkülin gerilim sensörü ifade de 40 dakikalık bir süre boyunca streç yönde fokal yapışıklıkoluşumunu göstermektedir. Forster Rezonans Enerji Transferi analizi, fokal yapışıklıklara lokalize vinkülin, akut durotaktik stimülasyon ile sunulduğunda gerginlikte ani bir değişim yaşadığını ortaya koymaktadır. Durotaktik stimülasyona yanıt olarak, bu tazyiğin yararını hücre altı sinyal olaylarının gözlemine genişletmek.Bir hücreyi germek için birden fazla girişimde bulunursanız veya deneme sırasında mikroiğne kayıyorsa, birden fazla, değişken, mekanik uyaran vermemek için yeni bir hücreyle baştan başlayın. Durotaksisi'ni atama ya da bu teknik, mechanotransdüksiyonda yer alan moleküler mekanizmaların çizgilendirilmesine yardımcı olmak için biyosensörler, RNAI veya gen düzenleme gibi genetik yaklaşımlarla birleştirilebilir.

Research

JoVE Journal

Biology

Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay

MCF-7 Hücre Line Nanogenomedicine Hücresel Toksisite: MTT assay

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Görüntüleme G-protein Coupled Reseptör (GPCR) aracılı Sinyal Olaylar Kontrolü Kemotaksis Diktiyostelyum diskodeyum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

Unimoleküler Biyosensörler kullanma Canlı Hücreler Olaylar Sinyal gerçek zamanlı izlenmesi için Mikroskopi FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

Kranial mesenchyme Hücresel Davranış Değerlendirme için bir Eksplantasyon Assay

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Hücre Tek katmanlar mekanik uyarılması bağlı Kalsiyum Dalga Yayılım: Sığır Kornea Endotel Hücreleri Örneği

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Hücre Haberleşme Analizi İçin Tek hücreli Mikroenjeksiyon

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

Değerlendirilmesi Hücre Mechanosensing ve Durotaxis için Basitleştirilmiş Sistemi<em&gt; İn Vitro</em

The composition and mechanical properties of the extracellular matrix are highly variable between tissue types. This connective tissue stroma diversity ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Fisyon Maya Cytokinetic Olayların zamanmekansal Analizi

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Bacillus subtilis tek hücreli mikrosıvısal analizi

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers ...