Name: a direct and simple method to assess drosophila melanogaster's viability from embryo to adult
Uploaded: 2019-08-27T15:00:00
Duration: 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult at JoVE.com

Vores arbejde er finansieret af NIH 1R15GM1131-01 til CFH og NIH PA-12-149 til CFH.

1. forberedelse af medierne
<ol><li>Forbered drue agar i henhold til producentens anvisninger (Se tabel over materialer) og hæld i en 35 mm Petri skål til halvt fuld (figur 5).  Lad det størkne i ca. 1 time. Efter drue agar størkner, straks brug eller opbevares ved 4 °C.</li>
	<li>Foretag forsigtigt ridser på tværs af agar pladen ved hjælp af en lille plastik kniv (fluer gerne lægge på ujævne overflader), der forlader midten af pladen uden ridser (figur 5). Placer en lille mængde gær pasta (lavet friske; Se tabel over materialer) i midten af pladen (figur 5).</li>
</ol>2. opsætning af embryo opsamling mini bur
<ol><li>Der oprettes et kryds ved hjælp af to jomfru hunner og en ung mand inde i embryon opsamlings buret, der indeholder drue agarpladen suppleret med gær pasta (figur 5).</li>
	<li>Efter 24 timer inspiceres bure for lagte embryoner uden at åbne buret ved at kigge i bunden af agarpladen.  Hvis der er lagt embryoner, skal du fjerne agarpladen fra kammeret og anbringe den i et fugtigt kammer for mikroskopisk observation (figur 6).  Hvis flere dage med æglæggende er scoret (f. eks fertilitet/lang levetid assays), holde avls forældrene og udskifte pladen med en frisk en forberedt som beskrevet. Tidlige samlinger af mindre end 24 h kan gøres, men når du bruger jomfru hunner, være opmærksom på, at de ikke vil lægge indtil 48 h efter at være opstået fra deres Pupa sag.</li>
	<li>Den agarplade, der indeholder embryoner, skal dækkes med Petri skålen for at undgå dehydrering og straks anbringe den i et fugtigt kammer (figur 7). Overhold under et dissekere mikroskop og Optag udklækkede embryoner og L1.  Udskift låget og opbevar ved stuetemperatur i fugtigt kammer, indtil alle embryoner er udklækket og udviklet til L1 larver (figur 6).</li>
</ol>3. tælling af embryoner og larver
<ol><li>Efter 48 h, observere pladerne under dissekere mikroskop og registrere numrene en sidste gang før overførsel af agar disk til mad hætteglas.  Befrugtede/levedygtige embryoner skal derefter være L1.  Længere inkubations perioder før overførsel er mulige, men vær opmærksom på, at pladerne kan begynde at miste fugt, og at agar kan knække en ren overførsel til hætteglas med fødevarer (figur 7).  For at sikre, at pladerne forbliver hydrerede, og embryo levedygtighed ikke kompromitteres under optællingen, skal du undgå at bruge et direkte svanehals-lys over agar-overfladen (figur 7E viser en passende afstand).</li>
	<li>Efter tælling dækkes pladen og opbevares i det fugtige kammer, indtil den er klar til overførsel. Registrere resultater.</li>
</ol>4. Overfør drue Agarskiven til et fødevare hætteglas for at overvåge levedygtigheden under
<ol><li>Når numrene er optaget (udklækkede embryoner/L1/L2), skal du bruge en spatel til forsigtigt at overføre drue agarskiven til et hætteglas, der er stort nok til at rumme en 35 mm Disc, som indeholder Drosophila fødevare medier, som er fremstillet i henhold til producentens anvisninger (Se listen over reagenser). Læg drue agarskiven L1-siden ned på maden (figur 7).  Efter overflytning af agar-skiven med larver til hætteglasset med fødevarer, inspiceres den tomme Petri skål omhyggeligt for enhver larver, som efterlades (figur 7E).</li>
	<li>Sæt en plan for at inspicere mad hætteglas dagligt, på nogenlunde samme tidspunkt hver dag, for at sikre L2/L3 larver observeres at gøre deres vej til fødevarer i hætteglasset (figur 8).</li>
	<li>Optag antallet af pupper og Adult Drosophila (figur 9). Fortsæt med at tælle, indtil der ikke observeres flere voksne, og undgå at tælle følgende generation (tælles ikke forbi 9 dage efter at have observeret de første voksne).</li>
	<li>Observere og registrere resultaterne. Juster tidsrammen for embryo opsamling,-tælling og-optagelse i overensstemmelse hermed til det mutante lager, der anvendes.</li>
	<li>Udfør en Chi-kvadratisk analyse. Nulhypotesen antager 100% levedygtighed, således at antallet af voksne vil være lig med antallet af udklækkede embryoner og L1 oprindeligt registreret og overført til fødevarer hætteglas</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hartung, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+observations+on+the+larval+growth+rate+and+viability+of+two+tumor+strains+of+Drosophila+melanogaster.">Some observations on the larval growth rate and viability of two tumor strains of Drosophila melanogaster.</a> Science. 107 (2777), 296-297 (1948).</li><li>Moree, R., King, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+Studies+on+Relative+Viability+in+Drosophila+Melanogaster.">Experimental Studies on Relative Viability in Drosophila Melanogaster.</a> Genetics. 46 (12), 1732-1752 (1961).</li><li>Da Costa, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+of+F1+and+F2+generations+of+crossed+Drosophila+and+Oregon+previously+adapted+to+2+different+nutrient+media.">Viability of F1 and F2 generations of crossed Drosophila and Oregon previously adapted to 2 different nutrient media.</a> Comptes rendus de l'Acad&#233;mie des Sciences. 242 (1), 177-180 (1956).</li><li>Garcia-Dorado, A., Caballero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mutational+rate+of+Drosophila+viability+decline:+tinkering+with+old+data.">The mutational rate of Drosophila viability decline: tinkering with old data.</a> Genome Research. 8 (2), 99-105 (2002).</li><li>Lence, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=m6A+modulates+neuronal+functions+and+sex+determination+in+Drosophila.">m6A modulates neuronal functions and sex determination in Drosophila.</a> Nature. 540 (7632), 304-318 (2016).</li><li>Haussmann, I. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=m(6)A+potentiates+Sxl+alternative+pre-mRNA+splicing+for+robust+Drosophila+sex+determination.">m(6)A potentiates Sxl alternative pre-mRNA splicing for robust Drosophila sex determination.</a> Nature. 54 (7632), 301-304 (2016).</li><li>Stockwer, H., Gallant, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+started:+An+overview+on+raising+and+handling+Drosophila.">Getting started: An overview on raising and handling Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).</li><li>Hales, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+on+the+Fly:+A+Primer+on+the+Drosophila+Model+System.">Genetics on the Fly: A Primer on the Drosophila Model System.</a> Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).</li><li>Gardner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Variation+for+Preadult+Viability+in+Drosophila+melanogaster.">Genetic Variation for Preadult Viability in Drosophila melanogaster.</a> Evolution. 55 (8), 1609-1620 (2001).</li><li>Hongay, C. F., Orr-Weaver, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Inducer+of+MEiosis+4+(IME4)+is+required+for+Notch+signaling+during+oogenesis.">Drosophila Inducer of MEiosis 4 (IME4) is required for Notch signaling during oogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14855-14860 (2011).</li><li>Zhong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MTA+Is+an+Arabidopsis+Messenger+RNA+Adenosine+Methylase+and+Interacts+with+a+Homolog+of+a+Sex-Specific+Splicing+Factor.">MTA Is an Arabidopsis Messenger RNA Adenosine Methylase and Interacts with a Homolog of a Sex-Specific Splicing Factor.</a> The Plant Cell. 5, 1278-1288 (2008).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N6-methyladenosine+modification+destabilizes+developmental+regulators+in+embryonic+stem+cells.">N6-methyladenosine modification destabilizes developmental regulators in embryonic stem cells.</a> Nature Cell Biology. 16, 191-198 (2014).</li><li>Hsu, P. J., Shi, H., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitranscriptomics+influence+on+development+and+disease.">Epitranscriptomics influence on development and disease.</a> Genome Biology. 18 (197), 1-9 (2017).</li><li>Kan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+m6A+pathway+facilitates+sex+determination+in+Drosophila.">The m6A pathway facilitates sex determination in Drosophila.</a> Nature Communications. 8, 1-16 (2017).</li><li>Senkowski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Cell+Culture-Based+Screening+Identifies+the+Anthelmintic+Drug+Nitazoxanide+as+a+Candidate+for+Treatment+of+Colorectal+Cancer.">Three-Dimensional Cell Culture-Based Screening Identifies the Anthelmintic Drug Nitazoxanide as a Candidate for Treatment of Colorectal Cancer.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 14 (6), 1504-1516 (2015).</li><li>Ramasamy, S., Bennet, D., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+and+bioactive+molecule+screening+based+on+a+bioelectrical+impedance+cell+culture+platform.">Drug and bioactive molecule screening based on a bioelectrical impedance cell culture platform.</a> International Journal of Nanomedicine. 9, 5789-5809 (2014).</li><li>Weltin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+monitoring+for+drug+screening+and+cancer+research:+a+transparent,+microfluidic,+multi-sensor+microsystem.">Cell culture monitoring for drug screening and cancer research: a transparent, microfluidic, multi-sensor microsystem.</a> Lab on a Chip. 14 (1), 138-146 (2014).</li><li>Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+evaluation+of+in+vitro+cell+culture+models+for+high-throughput+drug+screening+and+toxicity.">A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).</li></ol>

Der er ingen interessekonflikter.

Sammenfattende giver denne metode en nøjagtig og enkel vurdering af levedygtigheden i Drosophila. Hele protokollen tager cirka 14 dage at fuldføre. Proceduren kræver ikke ekspert tekniske færdigheder; men korrekt timing, en tidsplan for daglige observationer, og omhyggelig agar overførsel er vigtig for nøjagtighed og reproducerbarhed.
Ud over anbringelse af drue-agar-diskens embryon side ned i hætteglasset med fødevarer er et andet afgørende trin i proceduren at overføre agar-skiven til et fødevare-hætteglas senest 48 h efter fjernelse af drue agarpladen fra embryon opsamlings-mini bure. Overdragelse af agar efter 48 h resulterede i embryo-og larver-tab, sandsynligvis på grund af dehydrering af agar-skiven. For at tælle L2/L3-overgange skal pladen inkubere for 72 h. Hvis dette stadie er afgørende, skal drue agarpladerne hældes tykkere, og der skal anvendes et fugtigt kammer til at forhindre udtørring. Krydsninger blev sat op i embryon opsamlings bure, der rummer 35 mm plader; men denne procedure kan udføres ved hjælp af større embryon samling bure samt, såsom en, der rummer 60 mm eller 100 mm Petri plader.  Føde flasker skal så være store nok til at rumme disse størrelser.
Der er trin, der kan føjes til denne protokol. Som nævnt ovenfor er L2/L3-overgange udfordrende at kvantificere på plader på grund af den nødvendige tid og den potentielle dehydrering af agar. Derudover bliver larverne meget mobile på overfladen af agar, hvilket udgør en udfordring til præcist at tælle dem. Anbringelse af pladerne i køleskabet i 30 min eller tilsætning af et par dråber af en mild bedøvelse (lidocain opløsning) på overfladen af agar før optælling L2/L3 larver kan hjælpe med at bremse deres bevægelser til at tælle dem mere præcist.  En advarsel til disse ændringer er, at de kan indføre variabler (kold følsomhed, bedøvelses følsomhed) og forvirre levedygtigheden resultater.  Selv uden disse trin, ved hjælp af farvet mad, forskerne kan kvantificere vandrende L3s/prepupae som de bosætte sig på siden af fødevarer hætteglas til at indlede pupation. En begrænsning til denne metode er, at det kræver de voksne, der anvendes i Kors til at overleve at blive bedøvet med co2 for fænotypebestemmelse at oprette Kors i embryon indsamling bure. DM ime4 homozygot mutant mænd ikke restituere godt og dø et par timer efter at vågne op fra Co2 behandling.  Andre metoder til at immobilisere voksne til sortering kan udforskes, såsom at placere hætteglas i køleskabet i et par minutter og derefter overføre hætteglas til knust is til langsom bevægelse og sortere hurtigt og effektivt.
Ud over at sammenligne de alleliske styrker og deres indvirkning på levedygtigheden kan denne metode anvendes til at screene følsomhed eller resistens over for definerede farmaceutiske forbindelser. I modsætning til andre metoder, der skærm sammensatte toksicitet i cellekultur15,16,17,18, denne metode bruger hele organismer, gør vurdering af udviklingsmæssige virkninger lettere at analysere. I summen, ved hjælp af denne protokol og ændringer deri, vil gøre det muligt at måle alleliske styrker samt virkningerne af miljømæssige faktorer og kemiske forbindelser på Drosophila levedygtighed, frugtbarhed, fertilitet, levetid, og varigheden af udviklingscyklus.

Livslang levetid påvirkes af genetiske og ikke-genetiske faktorer. I standard Lab vækstbetingelser ved stuetemperatur, vores laboratorium har observeret betydelig variation af egnethed og levedygtighed blandt forskellige DM ime4 alleler dyrket under identiske betingelser (figur 1 og supplerende tal). Levedygtighed undersøgelser er ofte gjort for at undersøge virkningerne af en bestemt allel kombination eller vækst tilstand i populations genetiske undersøgelser1,2,3,4. Det er imidlertid svært at finde detaljerede analyser af levedygtigheden inden for en ikke-komplementær gruppe af mutationer i den videnskabelige litteratur. En allel er normalt mærket "ikke-væsentlige", hvis forskeren finder et par individer homozygot for at allel i føde hætteglasset, der huser den afbalancerede bestand5,6. Men, nøjagtige Chi-kvadratiske analyser til at vurdere, om disse homozygoter opstår ved de forventede mendelian nøgletal er ikke rapporteret5,6. Den mest eftergivende temperatur for enhver Drosophila bestand er stuetemperatur (22-23 °c) og, med passende næringsstoffer, livscyklus af vilde-type fluer tager cirka tolv dage til at fuldføre7,8. Da varigheden af hver udviklingsfase af Wild-type Drosophila er kendt7,8, den metode, der er beskrevet i denne rapport kan anvendes til at undersøge, om Drosophila stamme under undersøgelse er egnet på hvert trin sammenlignet med en kontrol, der passer til den genetiske baggrund, som testes. I modsætning til undersøgelser, der fokuserer på et specifikt aspekt af udvikling9, er denne protokol en praktisk måde at vurdere levedygtigheden på forskellige udviklingsstadier.
I vores laboratorium, denne protokol anvendes til at vurdere levedygtigheden af bestande, der er mangelfuld for Drosophila inducer af Meiosis 4 (DM ime4). DM ime4 er et vigtigt gen10 , der koder en RNA-methyltransferase med kritiske roller i RNA-metabolismen i Drosophila og andre flercellede organismer5,6,10, 11 , 12 , 13 , 14 . For hurtigt at evaluere nye alleler af DM ime4 genereret via Crispr/Cas9 (supplerende tal) blev der udført en analyse af slutpunkts levedygtighed, som kun opregnede voksent afkom produceret i hætteglas med afbalancerede bestande (figur 1). Nogle af de anvendte bestande blev beskrevet i de foregående DM ime4 rapporter5,6. Homozygot mutanter opstod på sub-Mendelian niveauer, som bestemt af Chi-kvadratiske analyser (figur 1 og supplerende materialer). For at vurdere, om disse tal, der er lavere end forventet, skyldtes, at der blev lagt færre embryoner, eller færre udklækkede embryoner eller tab af levedygtighed i L1/L2 eller pupae, udvidede vi sporingen til at omfatte tællinger i hvert af disse udviklingsstadier (figur 2, Figur 3, figur 4, figur 5, figur 6, figur 7, figur 8og figur 9).
Her beskriver vi metoden med Wild-type (OreR) fluer. For at empirisk teste denne metode til brug med andre genetiske baggrunde eller Drosophila arter, anbefaler vi at bruge OreR som reference og justere tidspunkter i henhold til den eksperimentelle organisme.  Protokollen blev yderligere evalueret for at vurdere levedygtigheden af afkom genereret af krydsning af Jomfru vilde hunner med hanner fra en heterozygot DM ime4 mutant Stock5,6 (figur 4).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:665px;" width="665">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antimold additive</td>
			<td style="width:121px;">Carolina</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Beaker</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scentific</td>
			<td style="width:161px;">S76100J</td>
			<td>Beaker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Benchmark scientific digital hotplate</td>
			<td style="width:121px;">The Lab Depot</td>
			<td style="width:161px;">H3760H</td>
			<td>Hot plate</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Britta-filtered tap water to prepare grape agar and instant fly food</td>
			<td style="width:121px;">Any tap water filtration system</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CO2 pistol or FlyNap</td>
			<td style="width:121px;">Carolina</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td>Anesthetic to sort/count adult flies</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dissecting microscope/stereoscope</td>
			<td style="width:121px;">Amscope</td>
			<td style="width:161px;">SM-1TSZ-V203</td>
			<td>Dissecting microscope</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Drosophila culture vials and stoppers</td>
			<td style="width:121px;">Carolina</td>
			<td align="right" style="width:161px;">173120</td>
			<td>Food vials for growing Drosophila</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Embryo collection mini cage</td>
			<td style="width:121px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:161px;">59-105</td>
			<td>chamber used to gather embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Erlenmeyer flask</td>
			<td style="width:121px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:161px;">70980</td>
			<td>Erlenmeyer flask</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Formula 4-24 Instant Drosophila Medium, Blue</td>
			<td style="width:121px;">Carolina</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td>https://www.carolina.com/drosophila-fruit-fly-genetics/formula-4-24-drosophila-medium-blue/FAM_173210.pr</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Grape agar</td>
			<td style="width:121px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:161px;">47-102</td>
			<td>Media used for agar plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Instant fly flood</td>
			<td style="width:121px;">Carolina</td>
			<td align="right" style="width:161px;">173210</td>
			<td>Blue media for food vials</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td height="21" style="height:21px;">Large Petri dish or any clear container to be used as a humid chamber by placing wet paper towels to keep the grape-agar plates moist during incubation/pre and post microscopic observation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Metal spatula (small)</td>
			<td style="width:121px;">Carolina</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microwave</td>
			<td style="width:121px;">Any</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td>To cook grape agar</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dish</td>
			<td style="width:121px;">Kord-Valmark</td>
			<td align="right" style="width:161px;">2901</td>
			<td>Petri dish for grape agar</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Stir bar</td>
			<td style="width:121px;">The Lab Depot</td>
			<td style="width:161px;">58948-981-EA</td>
			<td>Magnetic stir bar</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a direct and simple method to assess drosophila melanogaster's viability from embryo to adult

I Drosophila melanogasteranvendes rentabilitetsanalyser til at bestemme egnetheden af visse genetiske baggrunde. Alleliske variationer kan resultere i delvis eller fuldstændig tab af levedygtighed på forskellige udviklingsstadier. Vores laboratorium har udviklet en metode til at vurdere levedygtigheden i Drosophila fra embryo til fuldt moden voksen. Metoden er baseret på kvantificering af antallet af afkom, som er til stede på forskellige stadier under udviklingen, begyndende med udklækkede embryoner. Efter at embryonerne er blevet kvantificeret, tælles yderligere stadier, herunder L1/L2, pupae og modne voksne. Når alle stadier er undersøgt, anvendes en statistisk analyse som den Chi-kvadratiske test til at afgøre, om der er en signifikant forskel mellem startantallet af afkom (udklækkede embryoner) og senere stadier, som kulminerede med det observerede antal voksne således afvisning eller accept af nulhypotesen (at antallet af udklækkede embryoner vil være lig med antallet af larver, pupae, og voksne registreres i hele udviklingsfaserne). Den primære fordel ved denne analyse er dens enkelhed og nøjagtighed, da det ikke kræver en embryo skylle til at overføre dem til fødevarer hætteglasset, undgå tab fra tekniske fejl. Selv om den protokol, der er beskrevet her, ikke direkte undersøger L2/L3 larver, kan der tilføjes yderligere trin for at gøre rede for disse. Sammenligning af antallet af udklækkede embryoner, L1, pupae og voksne kan hjælpe med at afgøre, om levedygtigheden blev kompromitteret under L2/L3-faserne for yderligere undersøgelser (brugen af farvet mad hjælper med visuel identifikation af larver). Samlet, denne metode kan hjælpe Drosophila forskere og pædagoger afgøre, hvornår levedygtighed er kompromitteret i løbet af flyve livscyklus. Rutinemæssig vurdering af bestande ved hjælp af denne analyse kan forhindre ophobning af sekundære mutationer, der kan påvirke Fænotypen af den oprindeligt isolerede mutant, især hvis de oprindelige mutationer påvirker fitness. Af denne grund, vores laboratorium vedligeholder flere eksemplarer af hver af vores DM ime4 alleler og rutinemæssigt kontrollerer renhed af hver bestand med denne metode ud over andre molekylære analyser.

Denne metode præcist og reproducerbart tillader en at måle levedygtigheden fra embryoner til opstod voksne, når koblet til Chi square analyser.
I de indledende undersøgelser, efter optælling af embryoner og larver, blev drue agar anbragt i hætteglasset opretstående på siden af hætteglasset. Desværre, når agar blev placeret på siden af hætteglasset mange af embryoner og larver ikke modne til voksne. Dette skyldtes sandsynligvis, at drue agar-skiven udtørrer (figur 3). Denne placering indførte en miljømæssig variabel (hydrering af agar skive), der kunne tolerere resultaterne. Ca. 39% af afkom blev tabt mellem embryoner til voksne, da kun 61% af de voksne opstod. De største tab opstod mellem L1 larverne (regnet på overfladen af drue agarplader) og pupper (tælles på vægge af fødevarer hætteglas) tæller. Men når drue agar blev anbragt i hætteglasset i direkte kontakt med fødevare overfladen, blev mindre end 6% af afkom tabt (figur 2). Agar forblev hydreret, da hele drue agar-skiven forblev i kontakt med fugten fra den øjeblikkelige fødevare i hætteglasset (figur 7, figur 8). Disse resultater indikerer, at placeringen af agar inde i hætteglasset er vigtigt for at opnå pålidelige data og minimere bidrag af miljøvariabler. Yderligere data til støtte for metodens effektivitet blev indsamlet ved at sammenligne vildtype afkom anvendt ved Initial metodevalidering og afkom fremstillet af krydsning af jomfruelige hundyr til mænd fra en balanceret DM ime4 mutant bestand ( Supplerende figur 2, IME4ΔNULL/TM3SB). Ca. 91% af afkom modnet til voksenalderen sammenlignet med 94% af afkom fra dværg (figur 4).  Denne forskel var ikke statistisk signifikant.
Homozygot DM ime4 mutant mænd5 blev også brugt til at give yderligere validering af metoden. Men de homozygot mutanter var for syge til at reproducere og døde før embryoner blev deponeret. Derfor er en begrænsning af forsøget, at hannerne skal være sunde nok til at reproducere for at generere en start embryo population at spore.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig1.jpg"> Figur 1 : DM ime4 mutant bestande opstår på sub-mendelian niveauer. Bestande, hvor dele af det katalytiske domæne eller ADO-met-bindings domænet blev muteret, vises (Se supplerende figur 1 for detaljer). Nogle bestande havde dele af enten domæne erstattet med ALA (alanin-scanning mutagenesis), mens andre bestande havde enten eller begge domæner slettet. Forholdet mellem det observerede antal homozygoter og de forventede tal er repræsenteret i procenter (sammenlignet med heterozygot sidestillede Kontroller, se supplerende figur 3 for sorterings skema og Chi-kvadratisk analyse). Der blev udført Chi-kvadratiske analyser for at afgøre, om forskellen mellem observeret og forventet var statistisk signifikant og ikke på grund af tilfældighed alene (p-værdier < 0,01). Fejllinjer repræsenterer standardfejl af middelværdien (minimum tre forsøg pr. kryds angivet).  Et regneark med alle data kan findes i supplerende materialer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig2.jpg"> Figur 2 : Agar-positionen inde i hætteglasset kan medføre utilsigtede miljøvariabler. Histogram over antallet af individer på forskellige udviklingsstadier regnet fra drue agarskive embryon side ned i hætteglas med fødevarer eller agar på siden af hætteglasset med fødevarer. Placeringen af agarskiven i hætteglasset resulterede i 94% (SD ± 0,02) af de oprindelige embryoner, som overlevede indtil voksenalderen. Placeringen af agar på siden af hætteglasset med fødevarer resulterede i, at kun 61% (SD ± 0,07) af de oprindeligt optalte embryoner nåede voksenalderen. Et regneark med alle data kan findes i de supplerende materialer. De forventede tal på hvert trin er angivet som det oprindelige antal embryoner/L1, der er optalt på drue agarskiven, inden de overføres til hætteglasset med fødevarer (nulhypotesen: 100% af de udklækkede embryoner udvikles). De observerede tal er det faktiske antal personer, der er talt for den angivne udviklingsfase. Hver etape sammenlignes således med det oprindelige antal udklækkede embryoner, der er optalt på drue agarpladen. Der blev udført Chi-kvadratiske analyser for at afgøre, om forskellen mellem observeret og forventet var statistisk signifikant og ikke på grund af tilfældigheden alene ved hjælp af en p-værditærskel på 0,05. Forskellen var signifikant for embryoner dyrket med agar på siden af mad hætteglasset, men ikke for dem, der dyrkes i en skive embryo side ned. Fejllinjer repræsenterer standardfejl (minimum tre forsøg pr. kryds angivet). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig3.jpg"> Figur 3 : Tegneserie viser to måder drue agar skiver transporterer embryoner/L1s kan placeres inde i fødevarer hætteglas. Der var en signifikant forskel mellem det samlede antal embryoner og voksent afkom baseret på agar-positionen i hætteglasset med fødevarer. Forskellen skyldes en miljømæssig variabel (hydrering), der er skabt af forskellen i placeringen af skiven inde i hætteglasset med fødevarer: en statistisk signifikant forskel mellem forventede og observerede tal i larverne og pupper tæller, når agar- disken blev placeret på siden af hætteglasset versus ingen signifikant forskel i forventede versus observerede tal, når agar skiven var i kontakt med fødevarer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig4.jpg"> Figur 4 : Histogram, der viser antallet af individer på forskellige udviklingsstadier fra vildtype mænd versus mænd fra en DM ime4 mutant afbalanceret bestand. Afbalancerede hanner krydsede til jomfru vildtype hunner som beskrevet i 2,1.  Agar blev overført embryo-side ned i hætteglas med fødevarer.  Den gennemsnitlige andel af voksne, der kom fra de oprindelige embryoner, og som var optalt i drue agarskiver af vildtype X vildtype, var 94%, SD ± 0,02, mens dette forhold for DM ime4 mutant/+ X Wild-type var 91%, sd ± 0,01. Statistisk analyse blev udført som beskrevet for figur 2. forskelle var ikke signifikante for begge grupper. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig5.jpg"> Figur 5 : Eksperimentel opsætning. A) mini bure og drue-agar-mini-Petri skåle til embryon opsamling. Pladerne anbringes i et fugtigt kammer (standard Petri skål med absorberende papir skive mættet med vand) for at forhindre dehydrering.  En lille mængde gær pasta blev placeret i midten af hver drue-agar plade.  B) Afmonter låget til embryoopsamlings pladen (rødt), og Anbring en klar tallerken, gærside opad.  C) overføre korset til embryo buret og straks anbringe en Petri skål til at holde fluer indeni.  (D) Fjern hurtigt dækslet og vend embryonet, så åbningen kontakter drue-agar plade.  Inkuber for 24-48 h, inspicerer dagligt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig6.jpg"> Figur 6 : Embryo udvikling på drue-agar-plader. A) vilde embryoner, der er deponeret på drue-agar-mini-Petri skålene, tælles under et dissekere-mikroskop. Hold pladerne inde i fugtigt kammer, når de ikke visualiserer, og undgå direkte lys for at forhindre dehydrering.  B) drue agarpladerne opbevares i et fugtigt kammer, og der registreres udklækkede vildtype embryoner.  Dette billede viser tre dværg L1 larver, der er udviklet fra embryoner vist i A.  C) eksempel på registreret antal embryoner (dag 1) og L1 larver (dag 2) for de to plader, der er vist i figur 5.  Det "forventede antal" for nulhypotesen bestemmes af antallet af embryoner, der klækkede og blev L1 larver på tidspunktet for overførslen til føde hætteglasset (tabellen nedenfor).  For vildtype fluer luger næsten alle embryoner og udvikler sig til L1 larver.  Dette kan ikke være tilfældet for andre genetiske baggrunde, og denne metode anvendes til at bestemme disse forskelle i levedygtighed. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig6large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig7.jpg"> Figur 7 : Overførsel af larver.  A) efter optagelse af L1-optællinger fjernes drue agarpladerne forsigtigt fra Petri skålen ved hjælp af en ren (ethanol-udtørret) spatel (B,C) og overføres L1 side ned for at kontakte fødevarer i hætteglassene som vist i D.  E) den tomme Petri skål inspiceres omhyggeligt for at detektere eventuelle larver, der er tilbage.  Hvis larver lades i live og kan overføres til føde hætteglasset, skal du gøre det omhyggeligt og umiddelbart (F).  Hvis larver efterladt er døde eller ikke kan overføres, registrere dette faktum at korrigere "forventet antal" for efterfølgende beregninger. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig7large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig8.jpg"> Figur 8 : L2 larver gør deres vej ind i maden. Se sprækker og riller mellem drue-agar-skiven og den blå mad.  Indstil en tidsplan for at observere hætteglassene dagligt, helst på samme tidspunkt af dagen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig8large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig9.jpg"> Figur 9 : Voksen fremkomst. (A) L3 larver gør deres vej ud af maden for at blive pupae.  (B) voksne begynder at dukke op på dag 11.  Oprette en tidsplan for at observere hætteglassene dagligt, helst på samme tidspunkt af dagen og omhyggeligt registrere dine observationer.  Stop optælling, når alle pupper er dukket op (tælle tomme pupper tilfælde) og undgå at tælle den næste generation af fluer ved at stoppe eksperimentet på dag 15 og tælle Dead pupper hvis nogen (sort/tørret pupper).  Mutanter med længerevarende livscyklus kan have brug for længere tidsperioder, som skal bestemmes empirisk. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig9large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Supplerende tal. Venligst klik <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/Supplemental_Figures.zip" target="_blank">her for at downloade disse filer.</a>  
Supplerende materialer. Venligst klik <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/Supplemental_Materials.zip" target="_blank">her for at downloade disse filer.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult at JoVE.com

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

Denne protokol er designet til at vurdere levedygtigheden af Drosophila i alle udviklingsmæssige stadier, fra embryo til voksen. Metoden kan bruges til at bestemme og sammenligne levedygtigheden af forskellige genotyper eller vækstbetingelser.

En direkte og enkel metode til at vurdere Drosophila melanogasterslevedygtighed fra embryo til voksen

In Drosophila melanogaster, viability assays are used to determine the fitness of certain genetic backgrounds. Allelic variations can result in partial or ...

Den primære fordel ved denne analyse er enkelheden og nøjagtigheden, fordi den ikke kræver en embryolævning for at overføre til fødevarehætteglasset, og som undgår tab som følge af tekniske fejl. Denne protokol kræver ikke tekniske ekspertfærdigheder. Men den korrekte timing og omhyggelig vandoverførsel er vigtige for dens nøjagtighed og reproducerbarhed.Demonstrere denne procedure vil være Antonio Rockwell, en nyligt gradueret ph.d.-studerende fra mit laboratorium. Før du begynder proceduren, hæld drue agar i en 35-millimeter petriskål til halv fuld og lad agaren til at størkne i en time. Når agaren er størknet, skal du bruge en lille plastikkniv til forsigtigt at ridse agarens overflade omkring ydersiden af pladen, så midten af pladen er fri for ridser.Derefter placere en lille mængde frisklavet gær pasta i midten af skålen og placere skålen i et embryon indsamling mini bur. Til embryosamling, første sted to jomfru Drosophila hunner og en ung mand inde i indsamling bur i 24 timer. Den næste dag, inspicere bunden af agar plade til at lede efter embryoner.Hvis der er lagt embryoner, skal agarpladen overføres til et fugtigt kammer og dækkes pladen med låget for at undgå dehydrering. Hvis der skal scores flere dage med lægning, skal du placere en ny agarplade i opsamlingsburet. Brug mikroskopet til at bestemme antallet af udklækkede embryoner og L1-larver, og tilbagefør embryonerne tilbage til det fugtige kammer ved stuetemperatur, indtil alle embryonerne er udklækket og udviklet sig til L1 larver.Efter 48 timer tælles antallet af udklækkede embryoner og L1-larver, og der skal anvendes en spatel til forsigtigt at fjerne skiven af druegaren fra petriskålen, hvor disken L1-siden er placeret på maden i et madglas, der er stort nok til at rumme disken. Derefter omhyggeligt inspicere petriskålen for eventuelle resterende larver. Overvåg dagligt madhætteglasset på omtrent samme tidspunkt hver dag for at bekræfte, at L2- og L3-larverne kan observeres på vej til maden.Optag antallet af pupper og voksne Drosophila, fortsætter med at tælle, indtil der ikke flere voksne er observeret, og undgå at tælle den efterfølgende generation. Derefter udføre en chi-square analyse. Nulhypotesen forudsætter en levedygtighed på 100 %, således at antallet af voksne vil være lig med antallet af udklækkede embryoner og L1, der oprindeligt blev registreret og overført til fødevarehætteglassene.Når agaren er placeret på siden af hætteglasset, mange af embryoner og larver ikke modnes til voksne, sandsynligvis på grund af drue agar disk dehydrering. Når druegaren placeres med forsiden nedad inde i hætteglasset i direkte kontakt med fødevareoverfladen, går mindre end 6 % af afkomet typisk tabt, da agaren forbliver hydreret, mens den kommer i kontakt med fugten i det øjeblikkelige mad i hætteglasset. I dette repræsentative eksperiment, der sammenlignede udviklingen af vildtype og mutant afkom, modnede ca. 91 % af det mutante afkom til voksenalderen ved hjælp af denne metode sammenlignet med 94 % af afkomet fra vilde fluer.Husk at overføre agar skiven embryo-side ned i fødevarehætteglasset og derefter, at kontrollere den tomme petriskål for eventuelle resterende larver, der ikke fik overført. Et andet afgørende skridt er at overføre agardisen til et fødevarehætteglas senest 48 timer efter fjernelse af druegarpladen fra embryosamlingen minibure for at forhindre dehydrering.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

Epigenetisk Konvertering som en sikker og enkel metode til at opnå insulinproducerende celler fra voksne hud fibroblaster

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

Using Touch-evoked Response and Locomotion Assays to Assess Muscle Performance and Function in Zebrafish

Brug Touch-fremkaldt reaktion og Locomotion Analyser til Vurdere Muskel Ydeevne og funktion i zebrafisk

Zebrafish muscle development is highly conserved with mammalian systems making them an excellent model to study muscle function and disease. Many ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Metoder til at undersøge lymfeknuder kirtel og hæmocytter i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Acute and Chronic Models of Hyperglycemia in Zebrafish: A Method to Assess the Impact of Hyperglycemia on Neurogenesis and the Biodistribution of Radiolabeled Molecules

Akutte og kroniske modeller af hyperglykæmi i zebrafisk: En metode til vurdering af virkningen af ​​hyperglykæmi på neurogenese og biodistribution af radiomærkede molekyler

Hyperglycemia is a major health issue that leads to cardiovascular and cerebral dysfunction. For instance, it is associated with increased neurological ...

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

En simpel metode til at identificere kinaser, der regulerer embryonisk stamcellepluripotens ved høj gennemstrømningshæmmende screening

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

En hurtig og effektiv metode til at dissekere puppe vinger af Drosophila velegnet til Immunodetections eller PCR Assays

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

En forenklet og effektiv metode til at isolere primære humane keratinocytter fra voksen hudvæv

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Direkte afstamning omprogrammering af voksne mus Fibroblast til Erythroid ophav

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Levende billeddannelse og analyse af muskelsammentrækninger i Drosophila embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Optøning, dyrkning og Cryopreserving Drosophila cellelinjer

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...