Name: a direct and simple method to assess drosophila melanogaster's viability from embryo to adult
Uploaded: 2019-08-27T15:00:00
Duration: 4 s
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Il nostro lavoro è finanziato da NIH 1R15GM1131-01 a CFH e NIH PA -12-149 A CFH.

1. Preparazione dei supporti
<ol><li>Preparare l'agar d'uva secondo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali) e versare in un piatto Petri 35 mm a mezzo pieno ( Figura5).  Lasciare solidificare per circa 1 h. Dopo che l'agar dell'uva si solidifica, utilizzare immediatamente o conservare a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Fare delicatamente graffi attraverso la piastra di agar utilizzando un piccolo coltello di plastica (mosche piace giacere su superfici irregolari) lasciando il centro del piatto senza graffi (Figura 5). Posizionare una piccola quantità di pasta di lievito (fatta fresca; vedere Tabella dei materiali) al centro della piastra ( Figura5).</li>
</ol>2. Collezione di embrioni Mini Cage Set Up
<ol><li>Impostare una croce utilizzando due femmine vergini e un giovane maschio all'interno della gabbia di raccolta degli embrioni contenente la piastra di uva agar integrata con pasta di lievito (Figura 5).</li>
	<li>Dopo 24 h, ispezionare le gabbie per gli embrioni posseduti senza aprire la gabbia guardando il fondo della piastra di agar.  Se gli embrioni sono stati posati, rimuovere la piastra di agar dalla camera e posizionarla all'interno di una camera umida per l'osservazione microscopica (Figura 6).  Se vengono valutati diversi giorni di posa (ad esempio, saggi di fertilità/longevità), tenere i genitori all'allevamento e sostituire la piastra con una nuova preparata come descritto. Le prime collezioni di meno di 24 h possono essere fatte ma, quando si utilizzano femmine vergini, essere consapevoli del fatto che non saranno laici fino a 48 h dopo essere emerso dal loro caso pupa.</li>
	<li>Coprire la piastra di agar contenente gli embrioni con il coperchio della parabola Petri per evitare la disidratazione e posizionarla immediatamente all'interno di una camera umida (Figura 7). Osservare al microscopio e registrare gli embrioni schiuse e L1.  Sostituire il coperchio e conservarlo a temperatura ambiente in camera umida fino a quando tutti gli embrioni si erano schiusi e si sono sviluppati in larve Di L1 (Figura 6).</li>
</ol>3. Conteggio degli embrioni e delle larve
<ol><li>Dopo 48 h, osservare le piastre al microscopio dissezioso e registrare i numeri un'ultima volta prima del trasferimento del disco di agar in fiala alimentare.  Gli embrioni fecondati/vitali dovrebbero diventare L1 per allora.  Sono possibili periodi di incubazione più lunghi prima del trasferimento, ma tenere presente che le piastre possono iniziare a perdere umidità e l'agar può compromettere un trasferimento pulito alle fiale di cibo (Figura 7).  Per garantire che le piastre rimangano idratate e la vitalità dell'embrione non venga compromessa durante il conteggio, evitare di utilizzare una luce diretta a collo d'oca sulla superficie dell'agar (Figura7E mostra una distanza appropriata).</li>
	<li>Dopo aver contato, coprire la piastra e conservarla nella camera umida fino a quando non è pronto per il trasferimento. Registrare i risultati.</li>
</ol>4. Trasferire il disco di Uva agar su una fiala alimentare per monitorare la vitalità durante lo sviluppo
<ol><li>Una volta registrati i numeri (embrioni tratteggiati/L1/L2), utilizzare una spatola per trasferire con attenzione il disco di uva a gar su una fiala sufficientemente grande da contenere un disco di 35 mm contenente supporti alimentari della Drosophila preparati secondo le istruzioni del produttore (fare riferimento all'elenco reagenti). Posizionare il disco di agar uva L1-side verso il basso sul cibo (Figura 7).  Dopo aver trasferito il disco di agar con larve alla fiala alimentare, ispezionare attentamente il piatto Petri vuoto per eventuali larve lasciate alle spalle (Figura 7E).</li>
	<li>Impostare un programma per ispezionare le fiale di cibo ogni giorno, all'incirca alla stessa ora ogni giorno, per garantire che le larve L2/L3 siano osservate facendo la loro strada verso il cibo nella fiala (Figura 8).</li>
	<li>Registrare il numero di pupe e Drosophila adulti (Figura 9). Continua a contare fino a quando non si osservano più adulti ed evita di contare la generazione successiva (non contare oltre 9 giorni dopo aver osservato i primi adulti).</li>
	<li>Osservare e registrare i risultati. Regolare l'intervallo di tempo della raccolta, del conteggio e della registrazione degli embrioni in base allo stock mutante utilizzato.</li>
	<li>Eseguire un'analisi del quadrato del chi. L'ipotesi nulla presuppone una fattibilità del 100% tale che il numero di adulti sarà uguale al numero di embrioni covati e L1 originariamente registrati e trasferiti alle fiale alimentari</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hartung, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+observations+on+the+larval+growth+rate+and+viability+of+two+tumor+strains+of+Drosophila+melanogaster.">Some observations on the larval growth rate and viability of two tumor strains of Drosophila melanogaster.</a> Science. 107 (2777), 296-297 (1948).</li><li>Moree, R., King, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+Studies+on+Relative+Viability+in+Drosophila+Melanogaster.">Experimental Studies on Relative Viability in Drosophila Melanogaster.</a> Genetics. 46 (12), 1732-1752 (1961).</li><li>Da Costa, M. 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J., Shi, H., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitranscriptomics+influence+on+development+and+disease.">Epitranscriptomics influence on development and disease.</a> Genome Biology. 18 (197), 1-9 (2017).</li><li>Kan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+m6A+pathway+facilitates+sex+determination+in+Drosophila.">The m6A pathway facilitates sex determination in Drosophila.</a> Nature Communications. 8, 1-16 (2017).</li><li>Senkowski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Cell+Culture-Based+Screening+Identifies+the+Anthelmintic+Drug+Nitazoxanide+as+a+Candidate+for+Treatment+of+Colorectal+Cancer.">Three-Dimensional Cell Culture-Based Screening Identifies the Anthelmintic Drug Nitazoxanide as a Candidate for Treatment of Colorectal Cancer.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 14 (6), 1504-1516 (2015).</li><li>Ramasamy, S., Bennet, D., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+and+bioactive+molecule+screening+based+on+a+bioelectrical+impedance+cell+culture+platform.">Drug and bioactive molecule screening based on a bioelectrical impedance cell culture platform.</a> International Journal of Nanomedicine. 9, 5789-5809 (2014).</li><li>Weltin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+monitoring+for+drug+screening+and+cancer+research:+a+transparent,+microfluidic,+multi-sensor+microsystem.">Cell culture monitoring for drug screening and cancer research: a transparent, microfluidic, multi-sensor microsystem.</a> Lab on a Chip. 14 (1), 138-146 (2014).</li><li>Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+evaluation+of+in+vitro+cell+culture+models+for+high-throughput+drug+screening+and+toxicity.">A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).</li></ol>

Non ci sono conflitti di interesse.

In sintesi, questo metodo fornisce una valutazione accurata e semplice della fattibilità in Drosophila. Il completamento dell'intero protocollo richiede circa 14 giorni. La procedura non richiede competenze tecniche di esperti; tuttavia, la tempistica corretta, un programma di osservazioni giornaliere e un attento trasferimento di agar è importante per la precisione e la riproducibilità.
Oltre al posizionamento del disco di uva-agar dal lato embrionale nella fiala alimentare, un altro passo cruciale della procedura è il trasferimento del disco di agar a una fiala alimentare non più tardi di 48 h dopo aver rimosso la piastra di agar d'uva dalle mini gabbie di raccolta dell'embrione. Il trasferimento dell'agar dopo 48 h ha comportato la perdita di embrioni e larve, probabilmente a causa della disidratazione del disco di agar. Per contare le transizioni L2/L3, la piastra deve incubare per 72 h. Se questa fase è cruciale, le piastre di agar dell'uva devono essere versate più spesse e deve essere utilizzata una camera umida per prevenire la disidratazione. Le croci sono state allestite in gabbie di raccolta embrionali che ospitano piastre da 35 mm; tuttavia, questa procedura può essere eseguita utilizzando anche gabbie di raccolta embrionali più grandi, come quella che ospita piastre Petri da 60 mm o 100 mm.  Le bottiglie di cibo devono quindi essere abbastanza grandi per ospitare quelle dimensioni.
Esistono passaggi che possono essere aggiunti a questo protocollo. Come accennato in precedenza, le transizioni L2/L3 sono difficili da quantificare sulle piastre a causa del tempo richiesto e della potenziale disidratazione dell'agar. Inoltre, le larve diventano altamente mobili sulla superficie dell'agar, ponendo una sfida per contarle con precisione. Posizionare le piastre in frigorifero per 30 minuti o aggiungere qualche goccia di un lieve anestetico (soluzione lidocaina) sulla superficie dell'agar prima di contare le larve L2/L3 può aiutare a rallentare i loro movimenti per contarle con maggiore precisione.  Un avvertimento a queste modifiche è che possono introdurre variabili (sensibilità al freddo, sensibilità anestetica) e confondere i risultati di fattibilità.  Anche senza questi passaggi, utilizzando cibo colorato, i ricercatori possono quantificare le L3/prepupae vaganti mentre si depositano sul lato delle fiale di cibo per avviare l'upupation. Una limitazione a questo metodo è che richiede agli adulti utilizzati nelle croci di sopravvivere essendo anestesizzati con CO2 per la fenotipizzazione per impostare le croci nelle gabbie di raccolta degli embrioni. Dm ime4 maschi mutanti omozivianoni non si riprendono bene e muoiono poche ore dopo il risveglio dal trattamento con CO 2.  Altri metodi per immobilizzare gli adulti per la selezione possono essere esplorati, come posizionare le fiale in frigorifero per alcuni minuti e quindi trasferire le fiale al ghiaccio tritato per rallentare il movimento e ordinare in modo rapido ed efficiente.
Oltre a confrontare i punti di forza allelici e i loro effetti sulla vitalità, questo metodo può essere utilizzato per lo screening della sensibilità o della resistenza a composti farmaceutici definiti. A differenza di altri metodi che vagliano la tossicità dei composti nella coltura cellulare15,16,17,18, questo metodo utilizza organismi interi, rendendo più facile analizzare la valutazione degli effetti dello sviluppo. In sintesi, utilizzando questo protocollo e le modifiche in esso in esso in esso, permetterà di misurare i punti di forza allelici, nonché gli effetti dei fattori ambientali e composti chimici sulla vitalità della Drosophila, la fecondità, la fertilità, la durata della vita e la durata ciclo dello sviluppo.

La durata della vita è influenzata da fattori genetici e non genetici. In condizioni di crescita standard del laboratorio a temperatura ambiente, il nostro laboratorio ha osservato variazioni significative di forma fisica e vitalità tra diversi alleli Dm ime4 cresciuti in condizioni identiche (Figura 1 e Figuresupplementari ). Studi di viabilità sono spesso fatti per studiare gli effetti di una certa combinazione allele o condizione di crescita negli studi genetici della popolazione1,2,3,4. Tuttavia, analisi dettagliate della vitalità all'interno di un gruppo di mutazioni non complementari sono difficili da trovare nella letteratura scientifica. Un allele è di solito etichettato come "non essenziale" se il ricercatore trova alcuni individui omozici per quell'allele all'interno della fiala alimentare che ospita lo stock equilibrato5,6. Tuttavia, analisi accurate del Chi quadrato per valutare se questi omozigoti sorgono al rapporto mendeliano previsto non sono riportati5,6. La temperatura più permissiva per qualsiasi stock di Drosophila è la temperatura ambiente (22-23 gradi centigradi) e, con nutrienti appropriati, il ciclo di vita delle mosche di tipo selvatico richiede circa dodici giorni per completare7,8. Poiché la durata di ogni fase di sviluppo della Drosophila di tipo selvaggio è nota7,8, il metodo descritto nella presente relazione può essere utilizzato per esaminare se il ceppo di Drosophila in fase di studio sia adeguato in ogni fase rispetto a un controllo appropriato per il background genetico testato. A differenza degli studi che si concentrano su un aspetto specifico dello sviluppo9, questo protocollo fornisce un modo pratico per valutare la fattibilità nelle diverse fasi dello sviluppo.
Nel nostro laboratorio, questo protocollo viene utilizzato per valutare la fattibilità delle scorte carenti per Drosophila Inducer di Meiosis 4 (Dm ime4). Dm ime4 è un gene essenziale10 che codifica un RNA metiltransferasi con ruoli critici nel metabolismo dell'RNA nella Drosophila e in altri organismi multicellulari5,6,10, 11 Del sistema di , 12 mila , 13 del sistema , 14 Del sistema . Per valutare rapidamente nuovi alleli di Dm ime4 generatitramite CRISPR/Cas9 ( Cifre supplementari ), è stato eseguito un saggio di fattibilità finale che contava solo la progenie adulta prodotta all'interno di fiale di titoli bilanciati (Figura 1). Alcuni degli stock utilizzati sono stati descritti nei precedenti rapporti Dm ime4 5,6. I mutanti omoygosi sono emersi a livelli sub-mendeliani, come determinato dalle analisi del chi quadrato (Figura 1 e Materialisupplementari ). Per valutare se questi numeri inferiori al previsto fossero dovuti alla posa di un minor numero di embrioni, o a un minor numero di embrioni schiuse o alla perdita di redditività in L1/L2 o pupe, abbiamo ampliato il monitoraggio per includere i conteggi in ciascuna di queste fasi di sviluppo (Figura 2, Figura 3, Figura 4, Figura 5, Figura 6, Figura 7, Figura 8e Figura 9).
Qui, descriviamo il metodo usando mosche di tipo selvaggio (OreR). Per testare empiricamente questo metodo per l'uso con altri background genetici o specie di Drosophila, si consiglia di utilizzare OreR come riferimento e regolare i tempi in base all'organismo sperimentale.  Il protocollo è stato ulteriormente valutato per valutare la fattibilità della progenie generata incrociando femmine di tipo selvaggio vergine con maschi da un etetozigao Dm ime4 mut stock5,6 ( Figura4).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:665px;" width="665">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antimold additive</td>
			<td style="width:121px;">Carolina</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Beaker</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scentific</td>
			<td style="width:161px;">S76100J</td>
			<td>Beaker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Benchmark scientific digital hotplate</td>
			<td style="width:121px;">The Lab Depot</td>
			<td style="width:161px;">H3760H</td>
			<td>Hot plate</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Britta-filtered tap water to prepare grape agar and instant fly food</td>
			<td style="width:121px;">Any tap water filtration system</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CO2 pistol or FlyNap</td>
			<td style="width:121px;">Carolina</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td>Anesthetic to sort/count adult flies</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dissecting microscope/stereoscope</td>
			<td style="width:121px;">Amscope</td>
			<td style="width:161px;">SM-1TSZ-V203</td>
			<td>Dissecting microscope</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Drosophila culture vials and stoppers</td>
			<td style="width:121px;">Carolina</td>
			<td align="right" style="width:161px;">173120</td>
			<td>Food vials for growing Drosophila</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Embryo collection mini cage</td>
			<td style="width:121px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:161px;">59-105</td>
			<td>chamber used to gather embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Erlenmeyer flask</td>
			<td style="width:121px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:161px;">70980</td>
			<td>Erlenmeyer flask</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Formula 4-24 Instant Drosophila Medium, Blue</td>
			<td style="width:121px;">Carolina</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td>https://www.carolina.com/drosophila-fruit-fly-genetics/formula-4-24-drosophila-medium-blue/FAM_173210.pr</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Grape agar</td>
			<td style="width:121px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:161px;">47-102</td>
			<td>Media used for agar plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Instant fly flood</td>
			<td style="width:121px;">Carolina</td>
			<td align="right" style="width:161px;">173210</td>
			<td>Blue media for food vials</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td height="21" style="height:21px;">Large Petri dish or any clear container to be used as a humid chamber by placing wet paper towels to keep the grape-agar plates moist during incubation/pre and post microscopic observation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Metal spatula (small)</td>
			<td style="width:121px;">Carolina</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microwave</td>
			<td style="width:121px;">Any</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td>To cook grape agar</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dish</td>
			<td style="width:121px;">Kord-Valmark</td>
			<td align="right" style="width:161px;">2901</td>
			<td>Petri dish for grape agar</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Stir bar</td>
			<td style="width:121px;">The Lab Depot</td>
			<td style="width:161px;">58948-981-EA</td>
			<td>Magnetic stir bar</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a direct and simple method to assess drosophila melanogaster's viability from embryo to adult

In Drosophila melanogaster, saggi di fattibilità sono utilizzati per determinare l'idoneità di alcuni background genetici. Le variazioni alleliche possono comportare una perdita parziale o completa di vitalità nelle diverse fasi di sviluppo. Il nostro laboratorio ha sviluppato un metodo per valutare la vitalità nella Drosophila da embrione a adulto completamente maturo. Il metodo si basa sulla quantificazione del numero di progenie presenti nelle diverse fasi durante lo sviluppo, a partire dagli embrioni schiuse. Dopo che gli embrioni sono stati quantificati, vengono conteggiate fasi aggiuntive, tra cui L1/L2, pupe e adulti maturi. Dopo che tutte le fasi sono state esaminate, viene utilizzata un'analisi statistica come il test del chi quadrato per determinare se esiste una differenza significativa tra il numero iniziale di progenie (embrioni schiuse) e le fasi successive che culminano nel numero osservato di adulti, rifiutando o accettando così l'ipotesi nulla (che il numero di embrioni schiusi sarà uguale al numero di larve, pupe e adulti registrati durante le fasi di sviluppo). Il vantaggio principale di questo saggio è la sua semplicità e precisione, in quanto non richiede un risciacquo embrione per trasferirli alla fiala alimentare, evitando perdite da errori tecnici. Anche se il protocollo qui descritto non esamina direttamente le larve L2/L3, è possibile aggiungere ulteriori passaggi per tenerne conto. Confrontando il numero di embrioni schiusi, L1, pupe e adulti può aiutare a determinare se la vitalità è stata compromessa durante le fasi L2/L3 per ulteriori studi (l'uso di alimenti colorati aiuta con l'identificazione visiva delle larve). Nel complesso, questo metodo può aiutare i ricercatori e gli educatori della Drosophila a determinare quando la vitalità viene compromessa durante il ciclo di vita del volo. La valutazione di routine degli stock che utilizzano questo test può prevenire l'accumulo di mutazioni secondarie che possono influenzare il fenotipo del mutante originariamente isolato, specialmente se le mutazioni originali influenzano la forma fisica. Per questo motivo, il nostro laboratorio conserva più copie di ciascuno dei nostri alleli Dm ime4 e controlla regolarmente la purezza di ogni stock con questo metodo oltre ad altre analisi molecolari.

Questo metodo con precisione e riproducibilità permette di misurare la vitalità dagli embrioni agli adulti emersi quando accoppiati ad analisi quadrate del chi.
Negli studi iniziali, dopo aver contato gli embrioni e le larve, l'agar dell'uva è stato posizionato all'interno della fiala in posizione verticale sul lato della fiala. Purtroppo, quando l'agar è stato posto sul lato della fiala molti degli embrioni e delle larve non sono maturati agli adulti. Ciò era probabilmente dovuto all'essiccazione del disco di uva gar (Figura 3). Questo posizionamento ha introdotto una variabile ambientale (idratazione del disco di agar) che potrebbe confondere i risultati. Circa il 39% della progenie è stata persa tra gli embrioni per adulti, dato che solo il 61% degli adulti è emerso. Le perdite maggiori si sono verificate tra le larve L1 (contate sulla superficie delle piastre di uva agar) e le pupe (contate sulle pareti delle fiale di cibo) conta. Tuttavia, quando l'agar dell'uva è stato posto rivolto verso il basso all'interno della fiala a diretto contatto con la superficie alimentare, meno del 6% della progenie è stato perso (Figura 2). L'agar è rimasto idratato poiché l'intero disco di uva agar è rimasto in contatto con l'umidità del cibo istantaneo all'interno della fiala (Figura 7, Figura 8). Questi risultati indicano che la posizione dell'agar all'interno della fiala è importante per ottenere dati affidabili e ridurre al minimo il contributo delle variabili ambientali. Ulteriori dati a sostegno dell'efficacia del metodo sono stati raccolti confrontando la progenie di tipo selvatico utilizzata nella convalida iniziale del metodo e la progenie prodotta incrociando le femmine di tipo selvaggio vergine con i maschi da uno stock di mutanti Dm ime4 bilanciato ( Figurasupplementare 2 , ime4 - null/TM3sb). Circa il 91% della progenie è maturato in età adulta rispetto al 94% della progenie di tipo selvatico (Figura 4).  Questa differenza non era statisticamente significativa.
Homozygous Dm ime4 mutanti maschi5 sono stati utilizzati anche per fornire un'ulteriore convalida del metodo. Tuttavia, i mutanti omozionali erano troppo malati per riprodursi e morirono prima che gli embrioni fossero depositati. Pertanto, una limitazione dell'esperimento è che i maschi devono essere abbastanza sani da riprodursi per generare una popolazione embrionale iniziale da monitorare.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig1.jpg"> Figura 1 : Le scorte mutanti Dm ime4 emergono a livelli sub-mendeliani. Vengono mostrati gli stock in cui sono state mutate parti del dominio catalitico o del dominio di binding Ado-Met (fare riferimento alla figura supplementare 1 per i dettagli). Alcuni stock avevano porzioni di entrambi i domini sostituite con Ala (mutagenesi alanina-scansione), mentre altri stock hanno avuto uno o entrambi i domini cancellati. Il rapporto tra il numero osservato di omozigoti e i numeri previsti è rappresentato in percentuali (rispetto ai controlli di pari livello eteroziggoti, si riferisce alla figura supplementare 3 per lo schema di ordinamento e l'analisi del chi quadrato). Sono state eseguite analisi quadrate del chi per determinare se la differenza tra osservato e previsto fosse statisticamente significativa e non dovuta al solo casuale (p-values < 0.01). Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media (minimo tre prove per croce indicate).  Un foglio di calcolo con tutti i dati è disponibile in Materialisupplementari . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig2.jpg"> Figura 2 : La posizione di gar all'interno della fiala può introdurre variabili ambientali non intenzionali. Istogramma del numero di individui in diverse fasi di sviluppo contato da uva agar disco embrione lato verso il basso in cibo fiala o agar sul lato della fiala alimentare. Collocando l'embrione del disco di agar nella fiala ha provocato il 94% degli embrioni iniziali sopravvissuti fino all'età adulta. Collocare l'agar sul lato della fiala alimentare ha comportato solo il 61% (SD - 0,07) degli embrioni originariamente conteggiati che raggiungono l'età adulta. Un foglio di calcolo con tutti i dati è disponibile nel campo Materialisupplementari . I numeri attesi in ogni fase sono fissati come il numero iniziale di embrioni/L1 contati sul disco di agar dell'uva prima del trasferimento al cibo (si sviluppano ipotesi nulla: si sviluppa il 100% degli embrioni covati). I numeri osservati sono il numero effettivo di individui contati per la fase di sviluppo indicata. Pertanto, ogni fase viene confrontata con il numero iniziale di embrioni schiuse contato sulla piastra di uva agar. Le analisi quadrate del chi sono state eseguite per determinare se la differenza tra osservato e previsto fosse statisticamente significativa e non dovuta al solo caso utilizzando una soglia di valore p pari a 0,05. La differenza era significativa per gli embrioni coltivati con agar sul lato della fiala alimentare, ma non per quelli coltivati in un lato embrione di disco verso il basso. Le barre degli errori rappresentano un errore standard (minimo tre prove per croce indicate). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig3.jpg"> Figura 3 : Cartone animato che mostra due modi in cui i dischi di uvaa che trasportano embrioni/L1 possono essere collocati all'interno della fiala alimentare. C'era una differenza significativa tra il numero totale di embrioni e la progenie adulta in base alla posizione dell'agar nella fiala alimentare. La differenza deriva da una variabile ambientale (idratazione) creata dalla differenza nel posizionamento del disco all'interno della fiala alimentare: c'è una differenza statisticamente significativa tra i numeri attesi e osservati nelle larve e nelle pupe conta quando l'agar conta quando l'agar disco è stato posizionato sul lato della fiala rispetto a nessuna differenza significativa nei numeri attesi rispetto a quelli osservati quando il disco di agar era in contatto con il cibo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig4.jpg"> Figura 4 : istogramma che mostra il numero di individui in diverse fasi di sviluppo da maschi di tipo selvaggio contro maschi da uno stock bilanciato mutante Dm ime4. I maschi equilibrati hanno attraversato le femmine di tipo selvatico vergine come descritto in 2.1.  Agar è stato trasferito a lato embrionale in fiale di cibo.  Il rapporto medio tra gli adulti che emergono dagli embrioni originali conteggiati nei dischi di agar d'uva da wild-type X selvatici è stato del 94%, SD - 0,02, mentre tale rapporto per Dm ime4 mutant/X wild-type era del 91%, SD - 0,01. L'analisi statistica è stata eseguita come descritto nella figura 2; differenze non erano significative per entrambi i gruppi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig4large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig5.jpg"> Figura 5 : Configurazione sperimentale. (A) Collezione di embrioni mini-gabbia e piatti mini-Petri di uva-agar. Le piastre sono collocate all'interno di una camera umida (piatto Petri standard con disco di carta assorbente saturo d'acqua) per prevenire la disidratazione.  Una piccola quantità di pasta di lievito è stata posta al centro di ogni piatto di uva-agar.  (B) Staccare il coperchio del portapunitore della piastra embrionale (rosso) e posizionare una piastra preparata, lato lievito verso l'alto.  (C) Trasferire la croce nella gabbia embrionale e mettere immediatamente un coperchio del piatto Petri per contenere le mosche all'interno.  (D) Rimuovere rapidamente il coperchio e capovolgere la gabbia embrionale in modo che l'apertura contatti piastra di uva-agar.  Incubare per 24-48 h, ispezionando ogni giorno. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig5large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig6.jpg"> Figura 6 : Sviluppo dell'embrione su piatti di uvagar. (A) Gli embrioni wildtype depositati sui piatti mini-Petri dell'uva-agar sono conteggiati al microscopio sezionato. Tenere i piatti all'interno della camera umida quando non si visualizza ed evitare la luce diretta per prevenire la disidratazione.  (B) Le piastre di uva da gofa sono conservate in una camera umida e vengono registrati embrioni di tipo selvatico nati.  Questa foto mostra tre larve L1 di tipo selvatico che si sono sviluppate da embrioni mostrati in A.  (C) Esempio di numero registrato di embrioni (giorno 1) e larve L1 (giorno 2) per le due placche indicate nella figura 5.  Il "numero previsto" per l'ipotesi nulla è determinato dal numero di embrioni che si sono schiusi e sono diventati larve L1 al momento del trasferimento alla fiala alimentare (tabella seguente).  Per le mosche wildtype, quasi tutti gli embrioni si schiudono e si sviluppano in larve L1.  Questo potrebbe non essere il caso per altri background genetici e questo metodo viene utilizzato per determinare queste differenze di vitalità. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig6large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig7.jpg"> Figura 7 : Trasferimento delle larve.  (A) Dopo la registrazione dei conteggi L1, i dischi di uva-agar vengono accuratamente rimossi dalla parabola Petri utilizzando una spatola pulita (pulita) (B,C) e trasferiti L1 lateralmente verso il basso per contattare il cibo nelle fiale come mostrato nella D.  (E) La parabola Petri vuota viene attentamente ispezionata per rilevare eventuali larve lasciate indietro.  Se le larve lasciate sono vive e possono essere trasferite alla fiala alimentare, fatelo con attenzione e immediatamente (F).  Se le larve lasciate sono morte o non possono essere trasferite, registrare questo fatto per correggere il "numero previsto" per i calcoli successivi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig7large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig8.jpg"> Figura 8 : Le larve L2 si fanno strada nelcibo. Vedere fessure e scanalature tra il disco di uva-agar e il cibo blu.  Impostare un programma per osservare le fiale ogni giorno, preferibilmente alla stessa ora del giorno. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig8large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig9.jpg"> Figura 9 : apparizione degli adulti. (A) Le larve L3 escono dal cibo per diventare pupe.  (B) Gli adulti iniziano ad emergere il giorno 11.  Impostare un programma per osservare le fiale ogni giorno, preferibilmente alla stessa ora del giorno e registrare con attenzione le vostre osservazioni.  Smettere di contare quando tutte le pupe sono emerse (conta noto casi di pupe vuote) ed evitare di contare la prossima generazione di mosche fermando l'esperimento il giorno 15 e contare pupe morte se presenti (pupe nere / secche).  I mutanti con cicli di vita più lunghi possono aver bisogno di periodi di tempo più lunghi, che devono essere determinati empiricamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig9large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Cifre supplementari. Fare <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/Supplemental_Figures.zip" target="_blank">clic qui per scaricare questi file.</a>  
Materiali supplementari. Fare <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/Supplemental_Materials.zip" target="_blank">clic qui per scaricare questi file.</a>

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A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

Questo protocollo è progettato per valutare la fattibilità della Drosophila in ogni fase dello sviluppo, dall'embrione all'adulto. Il metodo può essere utilizzato per determinare e confrontare la fattibilità di diversi genotipi o condizioni di crescita.

Un metodo diretto e semplice per valutare la vitalità di Drosophila melanogasterda embrione ad adulto

In Drosophila melanogaster, viability assays are used to determine the fitness of certain genetic backgrounds. Allelic variations can result in partial or ...

Il vantaggio principale di questo saggio è la semplicità e l'accuratezza perché non richiede un risciacquo embrionale da trasferire sulla fiala alimentare e che evita perdite da errori tecnici. Questo protocollo non richiede competenze tecniche esperte. Tuttavia, la tempistica corretta e un attento trasferimento dell'acqua sono importanti per la sua accuratezza e riproducibilità.A dimostrare questa procedura sarà Antonio Rockwell, dottorando di recente laurea presso il mio laboratorio. Prima di iniziare la procedura, versare l'agar d'uva in una piastra di Petri di 35 millimetri a metà piena e lasciare che l'agar si solidifichi per un'ora. Quando l'agar si è solidificato, utilizzare un piccolo coltello di plastica per graffiare delicatamente la superficie dell'agar intorno all'esterno della piastra, lasciando il centro della piastra privo di graffi.Quindi mettere una piccola quantità di pasta di lievito appena preparata al centro del piatto e posizionare il piatto in una mini gabbia per la raccolta degli embrioni. Per la raccolta degli embrioni, al primo posto due femmine vergini di Drosophila e un giovane maschio all'interno della gabbia di raccolta per 24 ore. Il giorno dopo, ispezionare il fondo della piastra dell'agar per cercare embrioni.Se gli embrioni sono stati deposti, trasferire la piastra di agar in una camera umida e coprire la piastra con il coperchio per evitare la disidratazione. Se devono essere segnati diversi giorni di posa, posizionare una nuova piastra di agar nella gabbia di raccolta. Utilizzare il microscopio per determinare il numero di embrioni nati e larve di L1 e riportare gli embrioni nella camera umida a temperatura ambiente fino a quando tutti gli embrioni si sono schiusi e sviluppati in larve L1.Dopo 48 ore, contare il numero di embrioni nati e larve di L1 e utilizzare una spatola per rimuovere con cura il disco di agar d'uva dalla piastra di Petri, posizionando il lato L1 del disco sul cibo in una fiala alimentare abbastanza grande da ospitare il disco. Quindi ispezionare attentamente la piastra di Petri alla ricerca di eventuali larve rimanenti. Monitora la fiala alimentare ogni giorno all'incirca alla stessa ora ogni giorno per confermare che le larve L2 e L3 possono essere osservate mentre si divano verso il cibo.Registra il numero di pupe e Drosophila adulta, continuando a contare fino a quando non vengono osservati più adulti ed evitando di contare la generazione successiva. Quindi eseguire un'analisi chi quadrato. L'ipotesi nulla presuppone una vitalità del 100%, tale che il numero di adulti sarà uguale al numero di embrioni nati e L1 originariamente registrato e trasferito alle fiale alimentari.Quando l'agar viene posto sul lato del flaconcino, molti degli embrioni e delle larve non maturano per gli adulti, probabilmente a causa della disidratazione del disco di agar dell'uva. Quando l'agar dell'uva viene posizionato a faccia in giù all'interno della fiala a diretto contatto con la superficie alimentare, meno del 6% della progenie viene tipicamente persa, poiché l'agar rimane idratato mentre è a contatto con l'umidità del cibo istantaneo all'interno del flaconcino. In questo esperimento rappresentativo che confronta lo sviluppo della progenie selvatica e mutante, circa il 91% della progenie mutante è maturata fino all'età adulta usando questo metodo rispetto al 94% della progenie delle mosche di tipo selvatico.Ricordarsi di trasferire il disco di agar embrionale verso il basso nella fiala alimentare e poi, per controllare la piastra di Petri vuota per eventuali larve rimanenti che non sono state trasferite. Un altro passo cruciale è il trasferimento del disco di agar su una fiala alimentare non più tardi di 48 ore dopo aver rimosso il piatto di agar dell'uva dalle mini gabbie di raccolta degli embrioni per prevenire la disidratazione.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

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