Name: a direct and simple method to assess drosophila melanogaster's viability from embryo to adult
Uploaded: 2019-08-27T15:00:00
Duration: 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult at JoVE.com

Vårt arbeid er finansiert av NIH 1R15GM1131-01 til CFH og NIH PA-12-149 til CFH.

1. klargjøring av medier
<ol><li>Forbered drue agar i henhold til produsentens instruksjoner (se tabell over materialer) og hell i en 35 mm Petri parabolen til halv full (figur 5).  La det stivne i ca 1 time. Etter drue agar stivner, umiddelbart bruke eller lagre ved 4 ° c.</li>
	<li>Forsiktig lage riper over agar plate ved hjelp av en liten plast kniv (fluer liker å legge på ujevne overflater) forlater midten av platen uten riper (figur 5). Plasser en liten mengde gjær lim (laget fersk; se tabell over materialer) i midten av platen (figur 5).</li>
</ol>2. embryo samling mini Cage satt opp
<ol><li>Sett opp et kors ved hjelp av to jomfru kvinner og en ung mannlig inne i embryo samlingen buret inneholder drue agar plate supplert med gjær lim (figur 5).</li>
	<li>Etter 24 h, inspisere bur for lagt embryo uten å åpne buret ved å se på bunnen av agar plate.  Hvis embryo har blitt lagt, fjerne agar plate fra kammeret og plassere den inne i et fuktig kammer for mikroskopisk observasjon (figur 6).  Hvis flere dager med legging er scoret (f. eks, fruktbarhet/lang analyser), holde avl foreldrene og erstatte platen med en frisk en forberedt som beskrevet. Tidlig samlinger av mindre enn 24 h kan gjøres, men når du bruker jomfru kvinner, Vær oppmerksom på at de ikke vil legge til 48 h etter nye fra sin puppe sak.</li>
	<li>Dekk agar plate som inneholder embryo med Petri parabolen lokket for å unngå dehydrering og plassere den umiddelbart inne i et fuktig kammer (figur 7). Observer under en dissekere mikroskop og posten klekket embryo og L1.  Skift lokk og oppbevar ved romtemperatur i fuktig kammer inntil alle embryo hadde klekket og utviklet seg til L1 larver (figur 6).</li>
</ol>3. Counting embryo og larver
<ol><li>Etter 48 h, observere platene under dissekere mikroskop og registrere tallene en siste gang før overføring av agar plate til mat hetteglass.  Befruktet/levedyktig embryo bør bli L1 da.  Lengre inkubasjons perioder før overføring er mulig, men vær oppmerksom på at platene kan begynne å miste fuktighet og agar kan knekke kompromittere en ren overføring til mat hetteglass (figur 7).  For å sikre at platene forblir hydrert og embryo levedyktighet er ikke kompromittert under telling, unngå å bruke en direkte gooseneck lys over agar overflaten (figur 7E viser en passende avstand).</li>
	<li>Etter telling, dekkplaten og oppbevar den i fuktig kammer til klar til å overføre. Registrer funn.</li>
</ol>4. Overfør drue agar platen til en mat hetteglass for å overvåke levedyktighet under utvikling
<ol><li>Når tallene er registrert (klekket embryo/L1/L2), bruk en slikkepott til å nøye overføre drue agar platen til et hetteglass stor nok til å imøtekomme en 35 mm plate som inneholder Drosophila mat medier utarbeidet i henhold til produsentens instruksjoner (se liste over og reagenser). Plasser drue agar platen L1-side ned på maten (figur 7).  Etter overføring av agar platen med larver til mat hetteglasset, nøye inspisere den tomme Petri parabolen for noen larver igjen (figur 7E).</li>
	<li>Sett opp en tidsplan for å inspisere mat ampuller daglig, på omtrent samme tid hver dag, for å sikre L2/L3 larver er observert å gjøre veien til maten i hetteglasset (Figur 8).</li>
	<li>Registrer antall pupae og voksen Drosophila (figur 9). Hold telling inntil ingen flere voksne er observert og unngå å telle følgende generasjon (ikke teller siste 9 dager etter å observere de første voksne).</li>
	<li>Observere og registrere funnene. Juster tidsrammen for embryo innsamling, telling og opptak i henhold til det muterte lageret som brukes.</li>
	<li>Utfør en Chi firkantet analyse. Null hypotesen forutsetter 100% levedyktighet slik at antall voksne vil være lik antall klekket embryo og L1 opprinnelig registrert og overført til maten hetteglass</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hartung, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+observations+on+the+larval+growth+rate+and+viability+of+two+tumor+strains+of+Drosophila+melanogaster.">Some observations on the larval growth rate and viability of two tumor strains of Drosophila melanogaster.</a> Science. 107 (2777), 296-297 (1948).</li><li>Moree, R., King, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+Studies+on+Relative+Viability+in+Drosophila+Melanogaster.">Experimental Studies on Relative Viability in Drosophila Melanogaster.</a> Genetics. 46 (12), 1732-1752 (1961).</li><li>Da Costa, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+of+F1+and+F2+generations+of+crossed+Drosophila+and+Oregon+previously+adapted+to+2+different+nutrient+media.">Viability of F1 and F2 generations of crossed Drosophila and Oregon previously adapted to 2 different nutrient media.</a> Comptes rendus de l'Acad&#233;mie des Sciences. 242 (1), 177-180 (1956).</li><li>Garcia-Dorado, A., Caballero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mutational+rate+of+Drosophila+viability+decline:+tinkering+with+old+data.">The mutational rate of Drosophila viability decline: tinkering with old data.</a> Genome Research. 8 (2), 99-105 (2002).</li><li>Lence, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=m6A+modulates+neuronal+functions+and+sex+determination+in+Drosophila.">m6A modulates neuronal functions and sex determination in Drosophila.</a> Nature. 540 (7632), 304-318 (2016).</li><li>Haussmann, I. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=m(6)A+potentiates+Sxl+alternative+pre-mRNA+splicing+for+robust+Drosophila+sex+determination.">m(6)A potentiates Sxl alternative pre-mRNA splicing for robust Drosophila sex determination.</a> Nature. 54 (7632), 301-304 (2016).</li><li>Stockwer, H., Gallant, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+started:+An+overview+on+raising+and+handling+Drosophila.">Getting started: An overview on raising and handling Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).</li><li>Hales, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+on+the+Fly:+A+Primer+on+the+Drosophila+Model+System.">Genetics on the Fly: A Primer on the Drosophila Model System.</a> Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).</li><li>Gardner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Variation+for+Preadult+Viability+in+Drosophila+melanogaster.">Genetic Variation for Preadult Viability in Drosophila melanogaster.</a> Evolution. 55 (8), 1609-1620 (2001).</li><li>Hongay, C. F., Orr-Weaver, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Inducer+of+MEiosis+4+(IME4)+is+required+for+Notch+signaling+during+oogenesis.">Drosophila Inducer of MEiosis 4 (IME4) is required for Notch signaling during oogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14855-14860 (2011).</li><li>Zhong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MTA+Is+an+Arabidopsis+Messenger+RNA+Adenosine+Methylase+and+Interacts+with+a+Homolog+of+a+Sex-Specific+Splicing+Factor.">MTA Is an Arabidopsis Messenger RNA Adenosine Methylase and Interacts with a Homolog of a Sex-Specific Splicing Factor.</a> The Plant Cell. 5, 1278-1288 (2008).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N6-methyladenosine+modification+destabilizes+developmental+regulators+in+embryonic+stem+cells.">N6-methyladenosine modification destabilizes developmental regulators in embryonic stem cells.</a> Nature Cell Biology. 16, 191-198 (2014).</li><li>Hsu, P. J., Shi, H., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitranscriptomics+influence+on+development+and+disease.">Epitranscriptomics influence on development and disease.</a> Genome Biology. 18 (197), 1-9 (2017).</li><li>Kan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+m6A+pathway+facilitates+sex+determination+in+Drosophila.">The m6A pathway facilitates sex determination in Drosophila.</a> Nature Communications. 8, 1-16 (2017).</li><li>Senkowski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Cell+Culture-Based+Screening+Identifies+the+Anthelmintic+Drug+Nitazoxanide+as+a+Candidate+for+Treatment+of+Colorectal+Cancer.">Three-Dimensional Cell Culture-Based Screening Identifies the Anthelmintic Drug Nitazoxanide as a Candidate for Treatment of Colorectal Cancer.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 14 (6), 1504-1516 (2015).</li><li>Ramasamy, S., Bennet, D., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+and+bioactive+molecule+screening+based+on+a+bioelectrical+impedance+cell+culture+platform.">Drug and bioactive molecule screening based on a bioelectrical impedance cell culture platform.</a> International Journal of Nanomedicine. 9, 5789-5809 (2014).</li><li>Weltin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+monitoring+for+drug+screening+and+cancer+research:+a+transparent,+microfluidic,+multi-sensor+microsystem.">Cell culture monitoring for drug screening and cancer research: a transparent, microfluidic, multi-sensor microsystem.</a> Lab on a Chip. 14 (1), 138-146 (2014).</li><li>Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+evaluation+of+in+vitro+cell+culture+models+for+high-throughput+drug+screening+and+toxicity.">A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).</li></ol>

Det er ingen interessekonflikter.

Oppsummert gir denne metoden en nøyaktig og enkel vurdering av levedyktighet i Drosophila. Det tar ca. 14 dager å fullføre hele protokollen. Prosedyren krever ikke eksperttekniske ferdigheter; Imidlertid er riktig timing, en tidsplan for daglige observasjoner, og forsiktig agar overføring viktig for nøyaktighet og reproduserbarhet.
I tillegg til plassering av drue-agar plate embryo-side ned i maten hetteglass, en annen avgjørende skritt i prosedyren er å overføre agar platen til en mat hetteglass senest 48 h etter fjerning av drue agar plate fra embryo samlingen mini burene. Overføre agar etter 48 h resulterte i embryo og larver tap, sannsynligvis på grunn av dehydrering av agar platen. For å telle L2/L3 overganger, må platen ruge for 72 h. Hvis dette stadiet er avgjørende, bør drue agar platene helles tykkere og et fuktig kammer må brukes for å hindre uttørking. Korset ble satt opp i embryo samling bur som rommer 35 mm plater; Imidlertid kan denne prosedyren utføres ved hjelp av større embryo samling bur også, for eksempel en som rommer 60 mm eller 100 mm Petri plater.  Mat flasker må da være store nok til å imøtekomme disse størrelsene.
Det finnes trinn som kan legges til i denne protokollen. Som nevnt ovenfor, er L2/L3 overganger utfordrende å kvantifisere på plater på grunn av den tiden som kreves og den potensielle dehydrering av agar. I tillegg larver bli svært Mobile på overflaten av agar, utgjør en utfordring å nøyaktig telle dem. Plassere platene i kjøleskapet i 30 minutter eller legge noen dråper av en mild bedøvelse (lidokain løsning) på overflaten av agar før telling L2/L3 larver kan hjelpe tregere sine bevegelser for å telle dem mer nøyaktig.  En påminnelse til disse endringene er at de kan innføre variabler (kald følsomhet, anestesi følsomhet) og forvirre levedyktigheten resultater.  Selv uten disse trinnene, ved hjelp av farget mat, kan forskerne kvantifisere vandrende L3s/prepupae som de bosette seg på siden av maten ampuller å initiere forpupping. En begrensning på denne metoden er at det krever de voksne som brukes i kors for å overleve blir anesthetized med CO2 for bestemmelse av fenotype å sette opp krysser i embryo samling bur. DM ime4 homozygote mutant menn ikke komme seg godt og dø noen timer etter å våkne opp fra co2 behandling.  Andre metoder for å nakkens voksne for sortering kan utforskes, for eksempel å plassere hetteglass i kjøleskapet i noen minutter og deretter overføre hetteglass til knust is til langsom bevegelse og sortere raskt og effektivt.
Bortsett fra å sammenligne allel styrker og deres virkninger på levedyktighet, kan denne metoden brukes til skjerm følsomhet eller motstand mot definerte farmasøytiske forbindelser. I motsetning til andre metoder som skjermen sammensatte toksisitet i cellekultur15,16,17,18, denne metoden bruker hele organismer, noe som gjør vurderingen av utviklingsmessige effekter enklere å analysere. I sum, ved hjelp av denne protokollen og modifikasjoner deri, vil tillate å måle allel styrker, samt virkningene av miljømessige faktorer og kjemiske forbindelser på Drosophila levedyktighet, fekunditet, fruktbarhet, levetid, og varigheten av utviklingssyklusen.

Levetid påvirkes av genetiske og ikke-genetiske faktorer. I standard Lab vekstforhold ved romtemperatur, har vår Lab observert betydelig variasjon av kondisjon og levedyktighet blant ulike DM ime4 alleler vokst under identiske forhold (figur 1 og supplerende tall). Levedyktighet studier er ofte gjort for å undersøke virkningene av en viss allel kombinasjon eller vekst tilstand i befolkningen genetiske studier1,2,3,4. Men detaljerte analyser av levedyktighet i en ikke-komplementær gruppe av mutasjoner er vanskelig å finne i den vitenskapelige litteraturen. En allel er vanligvis merket "ikke-essensielle" Hvis forskeren finner noen individer homozygote for at allel innen mat hetteglasset som huser balansert lager5,6. Men nøyaktig chi-kvadrat analyser for å vurdere om disse homozygoter oppstår på forventet mendelsk prosenter er ikke rapportert5,6. Den mest ettergivende temperaturen for alle Drosophila aksjer er romtemperatur (22-23 ° c), og med egnede næringsstoffer, tar livssyklusen av vill-type fluer ca tolv dager å fullføre7,8. Som varigheten av hver utviklingsmessige stadium av vill-type Drosophila er kjent7,8, metoden som er beskrevet i denne rapporten kan brukes til å undersøke om Drosophila belastning under studien er passe på hvert trinn i forhold til en kontroll som passer for den genetiske bakgrunnen testet. I motsetning til studier som fokuserer på ett bestemt aspekt av utvikling9, denne protokollen gir en praktisk måte å vurdere levedyktighet på ulike utviklingstrinn stadier.
I laboratoriet vårt, er denne protokollen brukes til å vurdere levedyktigheten til aksjer som er mangelfull for Drosophila induser av meiose 4 (DM ime4). DM ime4 er et essensielt gen10 som koder en RNA methyltransferase med kritiske roller i RNA metabolisme i Drosophila og andre flercellede organismer5,6,10, 11 flere , 12 flere , 13 på alle , 14 priser og priser . For raskt å evaluere romanen alleler av DM ime4 generert via CRISPR/Cas9 (supplerende tall), en ende-punkt levedyktighet analysen ble utført som bare telles voksen avkom produsert innen ampuller av balanserte aksjer (figur 1). Noen av aksjene som brukes ble beskrevet i tidligere DM ime4 rapporter5,6. Homozygote mutanter oppsto på sub-Mendelsk nivåer, som bestemmes av chi-kvadrat analyser (figur 1 og supplerende materialer). For å vurdere om disse lavere enn forventet tallene skyldtes færre embryo som ble lagt, eller færre klekket embryo, eller tap av levedyktighet i L1/L2 eller pupae, utvidet vi sporingen til å omfatte tellinger på hver av disse utviklingsfasene (figur 2, Figur 3, Figur 4, figur 5, figur 6, figur 7, Figur 8og figur 9).
Her beskriver vi metoden som bruker vill-type (OreR) fluer. For å empirisk teste denne metoden for bruk med andre genetiske bakgrunner eller Drosophila arter, anbefaler vi å bruke OreR som en referanse og justere tidspunkter i henhold til eksperimentell organisme.  Protokollen ble ytterligere evaluert å vurdere levedyktigheten til avkom generert av krysset jomfru vill-type kvinner med menn fra en heterozygot DM ime4 mutant lager5,6 (Figur 4).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:665px;" width="665">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antimold additive</td>
			<td style="width:121px;">Carolina</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Beaker</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scentific</td>
			<td style="width:161px;">S76100J</td>
			<td>Beaker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Benchmark scientific digital hotplate</td>
			<td style="width:121px;">The Lab Depot</td>
			<td style="width:161px;">H3760H</td>
			<td>Hot plate</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Britta-filtered tap water to prepare grape agar and instant fly food</td>
			<td style="width:121px;">Any tap water filtration system</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CO2 pistol or FlyNap</td>
			<td style="width:121px;">Carolina</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td>Anesthetic to sort/count adult flies</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dissecting microscope/stereoscope</td>
			<td style="width:121px;">Amscope</td>
			<td style="width:161px;">SM-1TSZ-V203</td>
			<td>Dissecting microscope</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Drosophila culture vials and stoppers</td>
			<td style="width:121px;">Carolina</td>
			<td align="right" style="width:161px;">173120</td>
			<td>Food vials for growing Drosophila</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Embryo collection mini cage</td>
			<td style="width:121px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:161px;">59-105</td>
			<td>chamber used to gather embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Erlenmeyer flask</td>
			<td style="width:121px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:161px;">70980</td>
			<td>Erlenmeyer flask</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Formula 4-24 Instant Drosophila Medium, Blue</td>
			<td style="width:121px;">Carolina</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td>https://www.carolina.com/drosophila-fruit-fly-genetics/formula-4-24-drosophila-medium-blue/FAM_173210.pr</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Grape agar</td>
			<td style="width:121px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:161px;">47-102</td>
			<td>Media used for agar plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Instant fly flood</td>
			<td style="width:121px;">Carolina</td>
			<td align="right" style="width:161px;">173210</td>
			<td>Blue media for food vials</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td height="21" style="height:21px;">Large Petri dish or any clear container to be used as a humid chamber by placing wet paper towels to keep the grape-agar plates moist during incubation/pre and post microscopic observation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Metal spatula (small)</td>
			<td style="width:121px;">Carolina</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microwave</td>
			<td style="width:121px;">Any</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td>To cook grape agar</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dish</td>
			<td style="width:121px;">Kord-Valmark</td>
			<td align="right" style="width:161px;">2901</td>
			<td>Petri dish for grape agar</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Stir bar</td>
			<td style="width:121px;">The Lab Depot</td>
			<td style="width:161px;">58948-981-EA</td>
			<td>Magnetic stir bar</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a direct and simple method to assess drosophila melanogaster's viability from embryo to adult

I Drosophila melanogasterbrukes levedyktighet analyser til å bestemme egnethet for visse genetiske bakgrunner. Allel variasjoner kan føre til delvis eller fullstendig tap av levedyktighet på ulike stadier av utviklingen. Vår Lab har utviklet en metode for å vurdere levedyktighet i Drosophila fra embryo til fullt moden voksen. Metoden er avhengig av kvantifisere antall avkom tilstede på ulike stadier under utvikling, og starter med klekket embryo. Etter embryo har blitt kvantifisert, er flere etapper telles, inkludert L1/L2, pupae, og eldre voksne. Etter at alle stadier har blitt undersøkt, en statistisk analyse som chi-kvadrat testen brukes til å avgjøre om det er en betydelig forskjell mellom Startantall avkom (klekket embryo) og senere stadier kulminerte i det observerte antall voksne, dermed avvise eller akseptere null hypotesen (at antall klekket embryo vil være lik antall larver, pupae, og voksne registrert gjennom stadier av utvikling). Den primære fordelen med denne analysen er dens enkelhet og nøyaktighet, da det ikke krever et embryo skyll for å overføre dem til mat hetteglasset, unngå tap fra tekniske feil. Selv om protokollen beskrevet her ikke direkte undersøke L2/L3 larver, kan flere trinn legges til kontoen for disse. Sammenligning av antall klekket embryo, L1, pupae, og voksne kan bidra til å avgjøre om levedyktighet ble kompromittert under L2/L3 stadier for videre studier (bruk av farget mat hjelper med visuell identifisering av larver). Samlet sett kan denne metoden hjelpe Drosophila forskere og pedagoger avgjøre når levedyktighet er kompromittert under fly livssyklus. Rutinemessig vurdering av aksjer ved hjelp av denne analysen kan hindre opphopning av sekundære mutasjoner som kan påvirke fenotype av den opprinnelig isolerte mutant, spesielt hvis den opprinnelige mutasjoner påvirker fitness. Av denne grunn, vår Lab opprettholder flere eksemplarer av hver av våre DM ime4 alleler og rutinemessig sjekker renheten av hver aksje med denne metoden i tillegg til andre molekylære analyser.

Denne metoden nøyaktig og reproduserbar tillater en å måle levedyktighet fra embryo å fremkom voksne når koplet til chi kvadrat analyser.
I innledende studier, etter telling av embryo og larver, ble drue agar plassert inne i hetteglasset oppreist på siden av hetteglasset. Dessverre, da agar ble plassert på siden av hetteglasset mange av embryo og larver ikke modne for voksne. Dette var sannsynligvis på grunn av drue agar platen tørker ut (Figur 3). Denne plasseringen introduserte en miljøvariabel (hydrering av agar plate) som kunne forvirre resultatene. Ca 39% av avkom var tapt mellom embryo til voksen som bare 61% av voksne dukket opp. Den største tap skjedde mellom L1 larver (telles på overflaten av drue agar plater) og pupae (telles på veggene i mat ampuller) teller. Men når drue agar ble plassert møtte ned inne i hetteglasset i direkte kontakt med maten overflaten, mindre enn 6% av avkom var tapt (figur 2). Den agar forble hydrert som hele drue agar platen forble i kontakt med fuktigheten i Instant Food inne i hetteglasset (figur 7, Figur 8). Disse resultatene tyder på at plasseringen av agar inne i hetteglasset er viktig for å oppnå pålitelige data og minimere bidrag av miljømessige variabler. Ytterligere data for å støtte effektiviteten av metoden ble samlet inn ved å sammenligne vill-type avkom brukes i første metode validering og avkom produsert ved krysset jomfru vill-type kvinner til menn fra en balansert DM ime4 mutant lager ( Supplerende figur 2, IME4ΔNULL/TM3SB). Omtrent 91% av avkom modnet til voksen alder sammenlignet med 94% av avkom fra wildtype (Figur 4).  Denne forskjellen var ikke statistisk signifikant.
Homozygote DM ime4 mutant hanner5 ble også brukt til å gi ytterligere validering av metoden. Men homozygote mutanter var for syke til å reprodusere og døde før embryo ble avsatt. Derfor, en begrensning av eksperimentet er at menn trenger å være frisk nok til å reprodusere å generere en start embryo befolkning å spore.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig1.jpg"> Figur 1 : DM ime4 mutant aksjer dukke opp på sub-mendelsk nivåer. Aksjer i hvilke deler av katalysatoren eller ADO-Met bindende domene ble mutert vises (se supplerende figur 1 for detaljer). Noen aksjer hadde deler av enten domene erstattet med ala (alanin-skanning mutagenese), mens andre aksjer hadde enten eller begge domenene slettet. Forholdet observert antall homozygoter til de forventede tallene er representert i prosenter (sammenlignet med heterozygot søsken kontroller, se supplerende figur 3 for sortering ordningen og chi kvadrat analyse). Chi kvadrat analyser ble utført for å avgjøre om forskjellen mellom observert og forventet var statistisk signifikant og ikke på grunn av tilfeldighet alene (p-verdier < 0,01). Feilfelt representerer standard feil i gjennomsnittet (minimum tre forsøk per kryss angitt).  Du finner et regneark med alle dataene i supplerende materialer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig2.jpg"> Figur 2 : Agar posisjon inne i hetteglasset kan innføre utilsiktede miljømessige variabler. Histogram av antall individer på ulike stadier av utviklingen telles fra drue agar plate embryo side ned i mat hetteglass eller agar på siden av maten hetteglasset. Plassering av agar platen embryo-side ned i hetteglasset resulterte i 94% (SD ± 0,02) av første embryo overlevende til voksen alder. Plassere agar på siden av mat hetteglasset resulterte i bare 61% (SD ± 0,07) av opprinnelig telles embryo nådde voksen alder. Du finner et regneark med alle dataene i Tilleggsmaterialet. De forventede tallene på hvert trinn er satt som det opprinnelige antall embryo/L1 telles på drue agar platen før overføring til mat hetteglass (null hypotese: 100% av klekket embryo utvikle). De observerte tallene er det faktiske antallet individer som telles for utviklingstrinnet indikert. Dermed er hvert trinn i forhold til det opprinnelige antall klekket embryo telles på drue agar plate. Chi kvadrat analyser ble utført for å avgjøre om forskjellen mellom observert og forventet var statistisk signifikant og ikke på grunn av tilfeldighet alene ved hjelp av en p-verdi terskel på 0,05. Forskjellen var viktig for embryo vokst med agar på siden av maten hetteglasset, men ikke for de som dyrkes i en plate embryo side ned. Feil stolper representerer standard feil (minimum tre forsøk per kryss angitt). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig3.jpg"> Figur 3 : Cartoon viser to måter drue agar plater bærer embryo/L1s kan plasseres inne i maten hetteglasset. Det var en betydelig forskjell mellom det totale antall embryo og voksen avkom basert på plasseringen av agar i maten hetteglasset. Forskjellen stammer fra en miljømessig variabel (hydration) skapt av forskjellen i disk plassering inne i maten hetteglass: det er en statistisk signifikant forskjell mellom forventet og observert tall i larvene og pupae teller når agar platen ble plassert på siden av hetteglasset kontra ingen signifikant forskjell i forventet versus observerte tall når agar platen var i kontakt med maten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig4.jpg"> Figur 4 : Histogram som viser antall individer på ulike stadier av utviklingen fra vill-type menn versus menn fra en DM ime4 mutant balansert lager. Balanserte menn krysset til jomfru vill-type kvinner som beskrevet i 2,1.  Agar ble overført embryo-side ned i mat ampuller.  Den gjennomsnittlige forholdet mellom voksne som kommer fra den opprinnelige embryo telles i drue agar plater fra vill-type X Wild-type var 94%, SD ± 0,02, mens det forholdet for DM ime4 mutant/+ X Wild-type var 91%, sd ± 0,01. Statistisk analyse ble utført som beskrevet for figur 2; forskjeller var ikke signifikant for noen av gruppene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig4large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig5.jpg"> Figur 5 : Eksperimentell oppsett. (A) embryo samling mini-bur og drue-agar mini-Petri retter. Platene er plassert inne i et fuktig kammer (standard Petri parabolen med absorberende papir plate mettet med vann) for å hindre dehydrering.  En liten mengde gjær lim ble plassert i midten av hver drue-agar plate.  (B) løsne dekselet på embryo oppsamlings platen (rød) og Plasser en forberedt plate, gjær side opp.  (C) overføre korset til fosteret buret og umiddelbart plassere en Petri parabolen lokket til å holde fluer inne.  (D) Fjern raskt deksel og Vend embryo bur så åpning kontakter drue-agar plate.  Ruge for 24-48 h, inspeksjon daglig. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig5large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig6.jpg"> Figur 6 : Embryo utvikling på drue-agar plater. (A) wildtype embryo avsatt på drue-agar mini-Petri rettene telles under en dissekere mikroskop. Hold platene inne i fuktig kammer når du ikke visualisere og unngå direkte lys for å hindre dehydrering.  (B) drue-agar platene holdes i et fuktig kammer og klekket wildtype embryo er registrert.  Dette bildet viser tre wildtype L1 larver som utviklet seg fra embryo vist i A.  (C) eksempel på innspilte tall av embryo (dag 1) og L1 larver (dag 2) for de to platene vist i figur 5.  Den "forventet antall" for null hypotesen bestemmes av antall embryo som klekket og ble L1 larver på tidspunktet for overføring til mat hetteglasset (tabellen nedenfor).  For wildtype fluer, nesten alle embryo klekkes og utvikle seg til L1 larver.  Dette kan ikke være tilfelle for andre genetiske bakgrunner og denne metoden brukes til å bestemme disse forskjellene i levedyktighet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig6large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig7.jpg"> Figur 7 : Overføring av larver.  (A) etter innspillingen L1 teller, drue-agar platene er nøye fjernet fra Petri parabolen bruker en ren (etanol-tørket) slikkepott (B,C) og overført L1 side-ned for å kontakte maten i hetteglassene som vist i D.  (E) den tomme Petri parabolen er nøye inspisert for å oppdage eventuelle larver etterlatt.  Hvis larvaee igjen er i live og kan overføres til mat hetteglasset, må du gjøre det forsiktig og umiddelbart (F).  Hvis larver etterlatt er døde eller ikke kan overføres, ta opp dette faktum for å rette opp "forventet antall" for etterfølgende beregninger. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig7large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig8.jpg"> Figur 8 : L2 larver gjøre veien inn i maten. Se sprekker og riller mellom drue-agar platen og den blå maten.  Sett opp en tidsplan for å observere hetteglassene daglig, fortrinnsvis på samme tid på dagen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig8large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig9.jpg"> Figur 9 : Voksen fremveksten. (A) L3 larver gjør vei ut av maten for å bli pupae.  (B) voksne begynner å dukke opp på dag 11.  Sett opp en tidsplan for å observere hetteglassene daglig, fortrinnsvis på samme tid på dagen og nøye registrere dine observasjoner.  Opphøre opptellingen når alle pupae ha smaragd (greven tom emballasje pupae sakene) og unngå opptellingen morgendagen generasjon av fluer av stoppskilt forsøket opp på dag 15 og greven død pupae eventuell (sort/tørket pupae).  Mutanter med lengre livssykluser kan trenge lengre perioder, som må bestemmes empirisk. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig9large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Supplerende tall. Vennligst klikk <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/Supplemental_Figures.zip" target="_blank">her for å laste ned disse filene.</a>  
Supplerende materialer. Vennligst klikk <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/Supplemental_Materials.zip" target="_blank">her for å laste ned disse filene.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult at JoVE.com

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

Denne protokollen er utformet for å vurdere levedyktigheten til Drosophila på alle utviklingstrinn, fra embryo til voksen. Metoden kan brukes til å bestemme og sammenligne levedyktigheten til ulike genotyper eller vekstforhold.

En direkte og enkel metode for å vurdere Drosophila melanogaster' s levedyktighet fra embryo til Adult

In Drosophila melanogaster, viability assays are used to determine the fitness of certain genetic backgrounds. Allelic variations can result in partial or ...

Den primære fordelen med denne analysen er enkelheten og nøyaktigheten fordi det ikke krever embryoskylling for å overføre til mathetthett og som unngår tap fra tekniske feil. Denne protokollen krever ikke tekniske ferdigheter. Riktig timing og forsiktig vannoverføring er imidlertid viktig for nøyaktigheten og reproduserbarheten.Å demonstrere denne prosedyren vil være Antonio Rockwell, en nylig uteksaminert ph.d.-student fra laboratoriet mitt. Før du begynner prosedyren, hell druegar i en 35-millimeter petriskål til halvfull og la agaren størkne i en time. Når agaren har størknet, bruk en liten plastkniv til å forsiktig skrape overflaten av agaren rundt utsiden av platen, slik at midten av platen er fri for riper.Legg deretter en liten mengde nylaget gjærpasta i midten av parabolen og legg parabolen i et embryosamlings minibur. For embryosamling, første plass to jomfru Drosophila kvinner og en ung mann inne i samlingen buret i 24 timer. Neste dag, inspiser bunnen av agarplaten for å se etter embryoer.Hvis embryoer er lagt, overfør agarplaten til et fuktig kammer og dekk platen med lokket for å unngå dehydrering. Hvis flere dager med legging skal scores, legg en ny agarplate i samlingsburet. Bruk mikroskopet til å bestemme antall klekkede embryoer og L1 larver, og returner embryoene til det fuktige kammeret ved romtemperatur til alle embryoene har klekket og utviklet seg til L1 larver.Etter 48 timer teller du antall klekket embryoer og L1 larver og bruker en slikkepott til å forsiktig fjerne platen av druegar fra petriskålen, og plasser disken L1 side ned på maten i et mathåpe som er stort nok til å romme platen. Deretter inspiserer du petriskålen nøye for eventuelle gjenværende larver. Overvåk mat hetteglasset daglig på omtrent samme tid hver dag for å bekrefte at L2 og L3 larver kan observeres på vei til maten.Registrer antall pupper og voksen Drosophila, fortsetter å telle til ikke flere voksne blir observert og unngå å telle den påfølgende generasjonen. Utfør deretter en chi-kvadratanalyse. Nullhypotesen forutsetter en 100% levedyktighet, slik at antall voksne vil være lik antall klekkede embryoer og L1 opprinnelig registrert og overført til mat hetteglass.Når agaren er plassert på siden av hetteglasset, modnes mange av embryoene og larvene ikke til voksne, sannsynligvis på grunn av drueagarplaten dehydrering. Når drueagaren plasseres med forsiden ned inne i hetteglasset i direkte kontakt med matoverflaten, går mindre enn 6% av avkom vanligvis tapt, da agaren forblir hydrert mens den er i kontakt med fuktigheten til instant food inne i hetteglasset. I dette representative eksperimentet som sammenligner villtype og mutert avkomutvikling, modnet ca. 91% av det muterte avkomet til voksen alder ved hjelp av denne metoden sammenlignet med 94% av avkom fra villtypefluer.Husk å overføre agarplaten embryo-side ned i mathåpet og deretter, for å sjekke den tomme petriskålen for eventuelle gjenværende larver som ikke ble overført. Et annet viktig trinn er å overføre agarskiven til et mathulle senest 48 timer etter at druegarplaten er fjernet fra embryosamlingsminiburene for å forhindre dehydrering.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

Epigenetisk konvertering som en trygg og enkel metode for å skaffe insulin-sekresjon celler fra voksne hudfibroblaster

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

Using Touch-evoked Response and Locomotion Assays to Assess Muscle Performance and Function in Zebrafish

Ved hjelp av Touch-fremkalt respons og locomotion Analyser for å vurdere muskel ytelse og funksjon i Sebrafisk

Zebrafish muscle development is highly conserved with mammalian systems making them an excellent model to study muscle function and disease. Many ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Metoder for å undersøke lymfekjertel og Hemocytes i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Acute and Chronic Models of Hyperglycemia in Zebrafish: A Method to Assess the Impact of Hyperglycemia on Neurogenesis and the Biodistribution of Radiolabeled Molecules

Akutte og kroniske modeller av hyperglykemi i sebrafisk: En metode for å vurdere virkningen av hyperglykemi på neurogenese og biodistribusjon av radiomerkede molekyler

Hyperglycemia is a major health issue that leads to cardiovascular and cerebral dysfunction. For instance, it is associated with increased neurological ...

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

En enkel metode for å identifisere kinaser som regulerer embryonisk stamcellepluripotens ved høy gjennomstrømningsinhibitor screening

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

En rask og effektiv metode å dissekere Pupal vingene av Drosophila egnet for Immunodetections eller PCR analyser

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

En forenklet og effektiv metode å isolere primære menneskelige keratinocytter fra voksen hud vev

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Direkte avstamning omprogrammering av voksen mus Fibroblast å Erythroid Progenitors

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging og analyse av muskelsammentrekninger i Drosophila embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Tiner dyrking og Cryopreserving Drosophila linjer

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...