Name: a direct and simple method to assess drosophila melanogaster's viability from embryo to adult
Uploaded: 2019-08-27T15:00:00
Duration: 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult at JoVE.com

Наша работа финансируется NIH 1R15GM1131-01 в CFH и NIH PA -12-149 TO CFH.

1. Подготовка средств массовой информации
<ol><li>Подготовка виноградного агара в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицаматериалов) и залить в 35 мм Петри блюдо наполовину полный (рисунок5).  Дайте затвердеть примерно 1 ч. После того, как виноградный агар затвердевет, немедленно используйте или храните при 4 градусах Цельсия.</li>
	<li>Аккуратно сделайте царапины по всей агаровой пластине с помощью небольшого пластикового ножа (мухи любят лежать на неровных поверхностях), оставляя середину пластины без царапин(рисунок5). Поместите небольшое количество дрожжевой пасты (сделанной свежей; см. Таблица Материалов) в центре пластины (рисунок5).</li>
</ol>2. Эмбрион Коллекция Мини-Клетка Настройка
<ol><li>Назначь крест с помощью двух девственных самок и одного молодого мужчины внутри клетки коллекции эмбрионов, содержащей виноградную агарную пластину, дополненную дрожжевой пастой(рисунок5).</li>
	<li>После 24 ч осмотрите клетки на наличие уложенных эмбрионов, не открывая клетку, глядя на дно агарной пластины.  Если эмбрионы были заложены, удалите агар пластины из камеры и поместите его в влажную камеру для микроскопического наблюдения(рисунок 6).  Если несколько дней прокладки засчитаны (например, анализы плодородности/долголетия), то держите размножения родителей и заменяйте плиту свежим подготовленным как описано. Ранние коллекции менее 24 ч может быть сделано, но, при использовании девственных женщин, имейте в виду, что они не будут лежать до 48 ч после выхода из их куколка случае.</li>
	<li>Обложка агар пластины, содержащие эмбрионы с крышкой чашки Петри, чтобы избежать обезвоживания и поместите его сразу же внутри влажной камеры (Рисунок 7). Наблюдайте под рассекающим сярпод микроскопом и записывайте вылупившихся эмбрионов и L1.  Замените крышку и храните при комнатной температуре во влажной камере до тех пор, пока все эмбрионы не вылупились и не превратились в личинки L1(рисунок 6).</li>
</ol>3. Подсчет эмбрионов и личинок
<ol><li>После 48 ч наблюдайте за пластинами под рассекающим микроскопом и записывайте цифры в последний раз перед переносом агар-диска на пищевой флакон.  Оплодотворенные/жизнеспособные эмбрионы должны стать L1 к тому времени.  Более длительные инкубационные периоды до передачи возможны, но имейте в виду, что пластины могут начать терять влагу и агар может взломать компрометирующую чистую передачу пищевых флаконов(рисунок 7).  Для обеспечения того, чтобы пластины оставались гидратированными и жизнеспособность эмбриона не была нарушена при подсчете, избегайте использования прямого гусиного света над поверхностью агара(рисунок 7E показывает соответствующее расстояние).</li>
	<li>После подсчета, накрыть тарелку и хранить его во влажной камере до готовности к передаче. Запись результатов.</li>
</ol>4. Передача виноградного агар-диска в пищевой виваль для мониторинга жизнеспособности во время разработки
<ol><li>После того, как номера записаны (зародившиеся эмбрионы /L1/L2), используйте шпатель, чтобы тщательно перенести диск виноградного агара на флакон, достаточно большой, чтобы вместить 35-мм диск, содержащий дрозофилы пищевых носителей, подготовленных в соответствии с инструкциями производителя (обратитесь к списку реагентов). Поместите виноградный агар-диск L1-стороной вниз на пищу(рисунок 7).  После переноса агар-диска с личинками в пищевой флакон, тщательно осмотрите пустую чашку Петри на наличие личинок(рисунок 7E).</li>
	<li>Настройка графика для проверки пищевых флаконов ежедневно, примерно в то же время каждый день, чтобы обеспечить L2/L3 личинки наблюдаются пробираясь к пище во флаконе (Рисунок 8).</li>
	<li>Запись числа куски и взрослых Drosophila(рисунок 9). Продолжайте считать, пока больше не наблюдается взрослых и не считать следующее поколение (не считать последние 9 дней после наблюдения первых взрослых).</li>
	<li>Наблюдайте и записывайте находки. Отрегулируйте временные рамки сбора эмбрионов, подсчета и записи соответственно используемого запаса мутантов.</li>
	<li>Выполните анализ квадратного чи. Нулевая гипотеза предполагает 100% жизнеспособность, так что число взрослых будет равна количеству вылупившихся эмбрионов и L1 первоначально зарегистрированных и переданных в пищевые флаконы</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hartung, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+observations+on+the+larval+growth+rate+and+viability+of+two+tumor+strains+of+Drosophila+melanogaster.">Some observations on the larval growth rate and viability of two tumor strains of Drosophila melanogaster.</a> Science. 107 (2777), 296-297 (1948).</li><li>Moree, R., King, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+Studies+on+Relative+Viability+in+Drosophila+Melanogaster.">Experimental Studies on Relative Viability in Drosophila Melanogaster.</a> Genetics. 46 (12), 1732-1752 (1961).</li><li>Da Costa, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+of+F1+and+F2+generations+of+crossed+Drosophila+and+Oregon+previously+adapted+to+2+different+nutrient+media.">Viability of F1 and F2 generations of crossed Drosophila and Oregon previously adapted to 2 different nutrient media.</a> Comptes rendus de l'Acad&#233;mie des Sciences. 242 (1), 177-180 (1956).</li><li>Garcia-Dorado, A., Caballero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mutational+rate+of+Drosophila+viability+decline:+tinkering+with+old+data.">The mutational rate of Drosophila viability decline: tinkering with old data.</a> Genome Research. 8 (2), 99-105 (2002).</li><li>Lence, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=m6A+modulates+neuronal+functions+and+sex+determination+in+Drosophila.">m6A modulates neuronal functions and sex determination in Drosophila.</a> Nature. 540 (7632), 304-318 (2016).</li><li>Haussmann, I. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=m(6)A+potentiates+Sxl+alternative+pre-mRNA+splicing+for+robust+Drosophila+sex+determination.">m(6)A potentiates Sxl alternative pre-mRNA splicing for robust Drosophila sex determination.</a> Nature. 54 (7632), 301-304 (2016).</li><li>Stockwer, H., Gallant, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+started:+An+overview+on+raising+and+handling+Drosophila.">Getting started: An overview on raising and handling Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).</li><li>Hales, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+on+the+Fly:+A+Primer+on+the+Drosophila+Model+System.">Genetics on the Fly: A Primer on the Drosophila Model System.</a> Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).</li><li>Gardner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Variation+for+Preadult+Viability+in+Drosophila+melanogaster.">Genetic Variation for Preadult Viability in Drosophila melanogaster.</a> Evolution. 55 (8), 1609-1620 (2001).</li><li>Hongay, C. F., Orr-Weaver, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Inducer+of+MEiosis+4+(IME4)+is+required+for+Notch+signaling+during+oogenesis.">Drosophila Inducer of MEiosis 4 (IME4) is required for Notch signaling during oogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14855-14860 (2011).</li><li>Zhong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MTA+Is+an+Arabidopsis+Messenger+RNA+Adenosine+Methylase+and+Interacts+with+a+Homolog+of+a+Sex-Specific+Splicing+Factor.">MTA Is an Arabidopsis Messenger RNA Adenosine Methylase and Interacts with a Homolog of a Sex-Specific Splicing Factor.</a> The Plant Cell. 5, 1278-1288 (2008).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N6-methyladenosine+modification+destabilizes+developmental+regulators+in+embryonic+stem+cells.">N6-methyladenosine modification destabilizes developmental regulators in embryonic stem cells.</a> Nature Cell Biology. 16, 191-198 (2014).</li><li>Hsu, P. J., Shi, H., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitranscriptomics+influence+on+development+and+disease.">Epitranscriptomics influence on development and disease.</a> Genome Biology. 18 (197), 1-9 (2017).</li><li>Kan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+m6A+pathway+facilitates+sex+determination+in+Drosophila.">The m6A pathway facilitates sex determination in Drosophila.</a> Nature Communications. 8, 1-16 (2017).</li><li>Senkowski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Cell+Culture-Based+Screening+Identifies+the+Anthelmintic+Drug+Nitazoxanide+as+a+Candidate+for+Treatment+of+Colorectal+Cancer.">Three-Dimensional Cell Culture-Based Screening Identifies the Anthelmintic Drug Nitazoxanide as a Candidate for Treatment of Colorectal Cancer.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 14 (6), 1504-1516 (2015).</li><li>Ramasamy, S., Bennet, D., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+and+bioactive+molecule+screening+based+on+a+bioelectrical+impedance+cell+culture+platform.">Drug and bioactive molecule screening based on a bioelectrical impedance cell culture platform.</a> International Journal of Nanomedicine. 9, 5789-5809 (2014).</li><li>Weltin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+monitoring+for+drug+screening+and+cancer+research:+a+transparent,+microfluidic,+multi-sensor+microsystem.">Cell culture monitoring for drug screening and cancer research: a transparent, microfluidic, multi-sensor microsystem.</a> Lab on a Chip. 14 (1), 138-146 (2014).</li><li>Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+evaluation+of+in+vitro+cell+culture+models+for+high-throughput+drug+screening+and+toxicity.">A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).</li></ol>

Конфликта интересов нет.

Таким образом, этот метод обеспечивает точную и простую оценку жизнеспособности в Drosophila. Полный протокол занимает около 14 дней. Процедура не требует экспертных технических навыков; однако, надлежащее время, график ежедневных наблюдений, и тщательный перенос агара имеет важное значение для точности и воспроизводимости.
В дополнение к размещению виноградно-агар-диска эмбриона стороне вниз в пищевой флакон, еще одним важным шагом в процедуре является передача агар-диск агар агар ана в пищевой флакон не позднее 48 ч после удаления виноградной агар пластины из эмбриона сбора мини-клетки. Передача агара после 48 ч привела к потере эмбриона и личинок, вероятно, из-за обезвоживания агар-диска. Чтобы подсчитать l2/L3 переходы, пластина должна инкубировать для 72 ч. Если этот этап имеет решающее значение, виноградные агар пластины должны быть налиты толще и влажная камера должна быть использована для предотвращения высыхания. Кресты были установлены в клетках коллекции эмбрионов, которые вмещают 35-мм пластины; однако, эта процедура может быть выполнена с помощью больших клеток коллекции эмбрионов, а также, такие, как тот, который вмещает 60 мм или 100 мм Петри пластин.  Пищевые бутылки должны быть достаточно большими, чтобы вместить эти размеры.
Есть шаги, которые могут быть добавлены в этот протокол. Как уже упоминалось выше, L2/L3 переходы являются сложными для количественной оценки на пластинах из-за времени, необходимого и потенциального обезвоживания агара. Кроме того, личинки становятся очень мобильными на поверхности агара, что создает проблему для их точного подсчета. Размещение пластин в холодильнике в течение 30 минут или добавление нескольких капель мягкого анестетика (раствор лидокаина) на поверхности агара до подсчета личинок L2/L3 может помочь замедлить их движения, чтобы посчитать их более точно.  Предостережение к этим изменениям является то, что они могут ввести переменные (холодная чувствительность, чувствительность обезболительного) и заставить засомниться результаты жизнеспособности.  Даже без этих шагов, с помощью цветной пищи, исследователи могут количественно блуждающих L3s / prepupae, как они оседают на стороне пищевых флаконов, чтобы инициировать освящение. Ограничение мелопков этого метода заключается в том, что он требует, чтобы взрослые, используемые в крестах, чтобы выжить, будучи под анестетом с CO2 для фенотипирования, чтобы создать кресты в клетках коллекции эмбрионов. Dm ime4 гомозиготных мутантных самцов не выздоравливают хорошо и умирают через несколько часов после пробуждения от лечения CO2.  Другие методы обездвиживания взрослых для сортировки могут быть изучены, такие как размещение флаконов в холодильнике в течение нескольких минут, а затем передать флаконы дробленый лед, чтобы замедлить движение и сортировать быстро и эффективно.
Помимо сравнения аллельных сильных сторон и их влияния на жизнеспособность, этот метод может быть использован для проверки чувствительности или устойчивости к определенным фармацевтическим соединениям. В отличие от других методов, которые экран соединения токсичности в клеточной культуре15,16,17,18, этот метод использует целые организмы, что делает оценку развития эффекты легче анализировать. В целом, используя этот протокол и изменения в ней, позволит измерить все сторонние сильные стороны, а также влияние факторов окружающей среды и химических соединений на жизнеспособность Дрозофилы, плодовитость, плодовитость, продолжительность жизни и продолжительность цикл развития.

Продолжительность жизни зависит от генетических и негенетических факторов. В стандартных условиях роста лаборатории при комнатной температуре, наша лаборатория наблюдается значительное изменение пригодности и жизнеспособности между различными Dm ime4 аллели, выращенные в одинаковых условиях(Рисунок 1 и дополнительные цифры). Исследования жизнеспособности часто проводятся для исследования последствий определенной комбинации аллелей или состояния роста в популяционныхгенетических исследованиях1,2,3. Однако детальный анализ жизнеспособности в недополнятируемой группе мутаций трудно найти в научной литературе. Аллель, как правило, помечены как "несущественные", если исследователь находит несколько человек homozygous для этого аллеля в пищевой флакон, что дома сбалансированный запас5,6. Тем не менее, точные анализы Чи-квадрат, чтобы оценить, являются ли эти гомозиготы возникают при ожидаемых мендельских соотношений не сообщается5,6. Наиболее разрешительной температурой для любого запаса Дрозофилы является комнатная температура (22-23 градусов по Цельсию) и, при соответствующих питательных веществах, жизненный цикл мух дикого типа занимает около двенадцати дней, чтобы завершить7,8. Как продолжительность каждой стадии развития дикого типа Drosophila известно7,8, метод, описанный в настоящем докладе может быть использован для изучения ли штамм Drosophila в стадии исследования подходит на каждом этапе по сравнению с контролем, подходящим для генетического фона. В отличие от исследований, которые сосредоточены на одном конкретном аспекте развития9, этот протокол предоставляет практический способ оценки жизнеспособности на различных стадиях развития.
В нашей лаборатории, этот протокол используется для оценки жизнеспособности запасов, которые являются недостаточными для Drosophila индуктор Meiosis 4 (Dm ime4). Dm ime4 является важным геном10, который кодирует метилтрансферазу РНК с критическими ролями в метаболизме РНК в Дрозофиле и других многоклеточных организмах5,6,10, 11 Год , 12 Лет , 13 Год , 14 Год . Для быстрой оценки новых аллелей Dm ime4, генерируемых через CRISPR/Cas9 (Дополнительныецифры),был проведен конечный вывод о жизнеспособности, который учитывал только потомство взрослого, произведенное в флаконах сбалансированных запасов (рисунок1). Некоторые из используемых запасов были описаны в предыдущих отчетах Dm ime4 5,6. Гомозиговые мутанты появились на субмендельских уровнях, о пределе анализа чи-квадрата(рисунок 1 и дополнительные материалы). Чтобы оценить, были ли эти более низкие, чем ожидалось, цифры были вызваны меньшим количеством закладыванных эмбрионов или меньшим количеством вылупившихся эмбрионов или потерей жизнеспособности в L1/L2 или куколках, мы расширили отслеживание, включив в него количество на каждом из этих стадий развития (Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, и рисунок 9).
Здесь мы описываем метод с использованием диких типов (OreR) мух. Для эмпирического тестирования этого метода для использования с другими генетическими фонами или видами Drosophila, мы рекомендуем использовать OreR в качестве эталона и корректировать временные точки в зависимости от экспериментального организма.  Протокол был дополнительно оценен для оценки жизнеспособности потомства, порожденного скрещиванием девственных диких самок с самцами из гетерозиготного запаса мутантов Dm ime4 5,6 (Рисунок4).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:665px;" width="665">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antimold additive</td>
			<td style="width:121px;">Carolina</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Beaker</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scentific</td>
			<td style="width:161px;">S76100J</td>
			<td>Beaker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Benchmark scientific digital hotplate</td>
			<td style="width:121px;">The Lab Depot</td>
			<td style="width:161px;">H3760H</td>
			<td>Hot plate</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Britta-filtered tap water to prepare grape agar and instant fly food</td>
			<td style="width:121px;">Any tap water filtration system</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CO2 pistol or FlyNap</td>
			<td style="width:121px;">Carolina</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td>Anesthetic to sort/count adult flies</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dissecting microscope/stereoscope</td>
			<td style="width:121px;">Amscope</td>
			<td style="width:161px;">SM-1TSZ-V203</td>
			<td>Dissecting microscope</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Drosophila culture vials and stoppers</td>
			<td style="width:121px;">Carolina</td>
			<td align="right" style="width:161px;">173120</td>
			<td>Food vials for growing Drosophila</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Embryo collection mini cage</td>
			<td style="width:121px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:161px;">59-105</td>
			<td>chamber used to gather embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Erlenmeyer flask</td>
			<td style="width:121px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:161px;">70980</td>
			<td>Erlenmeyer flask</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Formula 4-24 Instant Drosophila Medium, Blue</td>
			<td style="width:121px;">Carolina</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td>https://www.carolina.com/drosophila-fruit-fly-genetics/formula-4-24-drosophila-medium-blue/FAM_173210.pr</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Grape agar</td>
			<td style="width:121px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:161px;">47-102</td>
			<td>Media used for agar plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Instant fly flood</td>
			<td style="width:121px;">Carolina</td>
			<td align="right" style="width:161px;">173210</td>
			<td>Blue media for food vials</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td height="21" style="height:21px;">Large Petri dish or any clear container to be used as a humid chamber by placing wet paper towels to keep the grape-agar plates moist during incubation/pre and post microscopic observation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Metal spatula (small)</td>
			<td style="width:121px;">Carolina</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microwave</td>
			<td style="width:121px;">Any</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td>To cook grape agar</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dish</td>
			<td style="width:121px;">Kord-Valmark</td>
			<td align="right" style="width:161px;">2901</td>
			<td>Petri dish for grape agar</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Stir bar</td>
			<td style="width:121px;">The Lab Depot</td>
			<td style="width:161px;">58948-981-EA</td>
			<td>Magnetic stir bar</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a direct and simple method to assess drosophila melanogaster's viability from embryo to adult

В Drosophila melanogaster, жизнеспособность анализы используются для определения пригодности определенных генетических фонов. Аллельные вариации могут привести к частичной или полной потере жизнеспособности на разных стадиях развития. Наша лаборатория разработала метод оценки жизнеспособности дрозофилы от эмбриона до полностью зрелого взрослого. Метод опирается на количественную оценку количества потомства, присутствующее на различных стадиях развития, начиная с вылупившихся эмбрионов. После того, как эмбрионы были количественно, подсчитываются дополнительные этапы, в том числе L1/L2, куски и зрелые взрослые. После того, как все этапы были изучены, статистический анализ, такой как тест чи-квадрат используется, чтобы определить, есть ли существенная разница между начальным числом потомства (зародышевые эмбрионы) и более поздними стадиями, кульминацией которых является наблюдаемое число взрослых, таким образом, отвергая или принимая нулевую гипотезу (что количество вылупившихся эмбрионов будет равно количеству личинок, кусков и взрослых, зарегистрированных на этапах развития). Основным преимуществом этого исследования является его простота и точность, так как он не требует промывки эмбриона, чтобы перевести их в пищевой флакон, избегая потерь от технических ошибок. Хотя описанный здесь протокол непосредственно не исследует личинки L2/L3, для их учета могут быть добавлены дополнительные шаги. Сравнение количества вылупившихся эмбрионов, L1, куски и взрослых может помочь определить, была ли жизнеспособность нарушена во время этапов L2/L3 для дальнейших исследований (использование цветной пищи помогает с визуальной идентификацией личинок). В целом, этот метод может помочь drosophila исследователей и преподавателей определить, когда жизнеспособность скомпрометирована во время жизненного цикла летать. Регулярная оценка запасов с помощью этого асссе может предотвратить накопление вторичных мутаций, которые могут повлиять на фенотип первоначально изолированного мутанта, особенно если оригинальные мутации влияют на фитнес. По этой причине, наша лаборатория поддерживает несколько копий каждого из наших аллелей Dm ime4 и регулярно проверяет чистоту каждого запаса с помощью этого метода в дополнение к другим молекулярным анализам.

Watch this Scientific Journal Video about A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult at JoVE.com

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

Этот протокол предназначен для оценки жизнеспособности дрозофилы на каждом этапе развития, от эмбриона до взрослого. Метод может быть использован для определения и сравнения жизнеспособности различных генотипов или условий роста.

Прямой и простой метод для оценки Drosophila меланогастер'S жизнеспособность от эмбриона к взрослому

In Drosophila melanogaster, viability assays are used to determine the fitness of certain genetic backgrounds. Allelic variations can result in partial or ...

Основным преимуществом этого анализа является простота и точность, поскольку он не требует полоскания эмбриона для передачи в пищевой флакон, что позволяет избежать потерь от технических ошибок. Этот протокол не требует экспертных технических навыков. Тем не менее, надлежащее время и тщательная передача воды имеют важное значение для его точности и воспроизводимости.Демонстрация этой процедуры будет Антонио Рокуэлл, недавно окончил аспирант из моей лаборатории. Перед началом процедуры налейте виноградный агар в 35-миллиметровую чашку Петри до половины полной и дайте агару затвердеть в течение одного часа. Когда агар затвердеет, используйте небольшой пластиковый нож, чтобы аккуратно поцарапать поверхность агара вокруг внешней стороны пластины, оставляя середину пластины свободной от царапин.Затем поместите небольшое количество свежеприготовленной дрожжевой пасты в центр блюда и поместите блюдо в мини-клетку коллекции эмбрионов. Для сбора эмбрионов, первое место две девственные самки Drosophila и один молодой мужчина внутри клетки сбора в течение 24 часов. На следующий день осмотрите дно агарной пластины, чтобы найти эмбрионы.Если эмбрионы были уложены, перенесите агарную пластину во влажную камеру и накройте ее крышкой, чтобы избежать обезвоживания. Если несколько дней укладки должны быть забиты, поместите новую пластину агара в клетку сбора. Используйте микроскоп, чтобы определить количество вылупившихся эмбрионов и личинок L1, и вернуть эмбрионы во влажную камеру при комнатной температуре, пока все эмбрионы не вылупились и не превратились в личинки L1.После 48 часов подсчитайте количество вылупившихся эмбрионов и личинок L1 и используйте шпатель, чтобы тщательно удалить диск виноградного агара из чашки Петри, поместив диск L1 вниз на пищу в пищевой флакон достаточно большой, чтобы разместить диск. Затем внимательно осмотрите чашку Петри на оставшиеся личинки. Мониторинг пищевой флакон ежедневно примерно в то же время каждый день, чтобы подтвердить, что личинки L2 и L3 можно наблюдать, делая свой путь к пище.Запись количество куколок и взрослых Drosophila, продолжая считать, пока не более взрослых наблюдаются и избежать подсчета последующего поколения. Затем выполните анализ чи-квадрата. Нулевая гипотеза предполагает 100%-ную жизнеспособность, так что число взрослых будет равно количеству вылупившихся эмбрионов и L1, первоначально записанных и перенесенных в пищевые флаконы.Когда агар помещается на стороне флакона, многие эмбрионы и личинки не созревают для взрослых, вероятно, из-за обезвоживания диска виноградного агара. Когда виноградный агар помещается лицом вниз внутри флакона в непосредственном контакте с поверхностью пищи, менее 6% потомства, как правило, теряется, так как агар остается гидратированных в то время как в контакте с влагой мгновенной пищи внутри флакона. В этом репрезентативном эксперименте, сравнивая развитие дикого и мутантного потомства, примерно 91% потомства мутантов созрело до совершеннолетия, используя этот метод по сравнению с 94% потомства мух дикого типа.Не забудьте перенести агар-диск эмбриона стороне вниз в пищевой флакон, а затем, чтобы проверить пустую чашку Петри для любых оставшихся личинок, которые не были переданы. Другим важным шагом является передача агар-диска в пищевой флакон не позднее чем через 48 часов после удаления виноградной агарной пластины из мини-клеток эмбриона для предотвращения обезвоживания.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

Эпигенетическое преобразования как безопасный и простой метод получения секретирующих инсулин клеток из фибробластов кожи взрослых

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

Using Touch-evoked Response and Locomotion Assays to Assess Muscle Performance and Function in Zebrafish

Использование сенсорного вызванной реакции и локомоции Анализы для оценки производительности мышц и функции в данио рерио

Zebrafish muscle development is highly conserved with mammalian systems making them an excellent model to study muscle function and disease. Many ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Методы Изучить лимфа железой и гемоцитах в<em&gt; Drosophila</em&gt; личинки

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Acute and Chronic Models of Hyperglycemia in Zebrafish: A Method to Assess the Impact of Hyperglycemia on Neurogenesis and the Biodistribution of Radiolabeled Molecules

Острые и хронические модели гипергликемии у рыбок данио: метод оценки влияния гипергликемии на нейрогенез и биораспределение радиоактивно меченых молекул

Hyperglycemia is a major health issue that leads to cardiovascular and cerebral dysfunction. For instance, it is associated with increased neurological ...

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

Простой метод для идентификации киназ, которые регулируют плюрипотентность эмбриональных стволовых клеток посредством высокопроизводительного скрининга ингибиторов

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

Быстрый и эффективный метод для того чтобы рассечь куколки крылья дрозофилы подходит для Immunodetections или анализы ПЦР

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Упрощенная и эффективный метод для изоляции первичных человеческие кератиноциты от взрослых кожной ткани

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Прямые, Lineage перепрограммирование взрослых мыши фибробластов в эритроидные предшественники

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging и анализ мышечных сокращений в дрозофилы эмбриона

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Размораживание, культивирования и Cryopreserving дрозофила клеточных линий

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...