Name: a direct and simple method to assess drosophila melanogaster's viability from embryo to adult
Uploaded: 2019-08-27T15:00:00
Duration: 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult at JoVE.com

Vårt arbete finansieras av NIH 1R15GM1131-01 till CFH och NIH PA-12-149 till CFH.

1. förberedelse av media
<ol><li>Förbered druvagar enligt tillverkarens anvisningar (se tabell över material) och häll i en 35 mm petriskål till halv-full (figur 5).  Låt stelna i cirka 1 h. Efter att druvagar stelnar, Använd eller förvara omedelbart vid 4 ° c.</li>
	<li>Gör försiktigt repor över agarplattan med en liten plast kniv (flugor vilja lägga på ojämna ytor) lämnar mitten av plattan utan repor (figur 5). Placera en liten mängd jästpasta (gjord färsk; se tabell över material) i mitten av plattan (figur 5).</li>
</ol>2. Minibur för insamling av embryon
<ol><li>Ställ upp ett kors med två jungfru honor och en ung hane inuti embryosamlingsburen som innehåller druvagarplattan kompletterad med jästpasta (figur 5).</li>
	<li>Efter 24 h, inspektera burarna för lagda embryon utan att öppna buren genom att titta på botten av agarplattan.  Om embryon har lagts, avlägsna agarplattan från kammaren och placera den i en fuktig kammare för mikroskopisk observation (figur 6).  Om flera dagar av utläggning görs (t. ex. fertilitet/livslängd analyser), hålla avel föräldrarna och ersätta plattan med en fräsch en beredd som beskrivs. Tidiga samlingar av mindre än 24 h kan göras, men när du använder jungfru honor, vara medveten om att de inte kommer att lägga förrän 48 h efter framväxande från deras Pupa fall.</li>
	<li>Täck agarplattan som innehåller embryon med petriskål för att undvika uttorkning och placera den omedelbart inuti en fuktig kammare (figur 7). Observera under ett dissekera Mikroskop och registrera kläckta embryon och L1.  Byt ut locket och förvara i rumstemperatur i fuktig kammare tills alla embryon har kläckts och utvecklats till L1 larver (figur 6).</li>
</ol>3. räkning av embryon och larver
<ol><li>Efter 48 h, Observera plattorna under dissekera Mikroskop och spela in siffrorna en sista gång innan överföring av agar skiva till mat injektionsflaska.  Befruktade/livskraftiga embryon bör bli L1 då.  Längre inkubationstider före överföring är möjliga men tänk på att plattorna kan börja tappa fukt och att agar kan spricka kompromissa med en ren överföring till mat flaskor (figur 7).  För att säkerställa att plattorna förblir hydratiserade och embryots livskraft inte äventyras vid räkning, Undvik att använda en direkt svan hals ljus över agarytan (figur 7E visar ett lämpligt avstånd).</li>
	<li>Efter räkning, täck plattan och förvara den i den fuktiga kammaren tills redo att överföra. Rekordresultat.</li>
</ol>4. överför Druvagar-skivan till en livsmedels flaska för att övervaka lönsamheten under
<ol><li>När siffrorna är inspelade (kläckta embryon/L1/L2), Använd en spatel för att noggrant överföra druvagar-skivan till en injektionsflaska som är tillräckligt stor för att rymma en 35 mm skiva som innehåller Drosophila Food Media beredd enligt tillverkarens anvisningar (se lista över reagenser). Placera druvagar-skivan L1-sida nedåt på maten (figur 7).  Efter överföring av agar-skiva med larver till maten injektionsflaska, inspektera noggrant den tomma petriskål för alla larver kvar (figur 7E).</li>
	<li>Ställ in ett schema för att inspektera mat flaskor dagligen, vid ungefär samma tid varje dag, för att säkerställa L2/L3 larver observeras gör sin väg till maten i injektionsflaskan (figur 8).</li>
	<li>Anteckna antalet puppor och Adult Drosophila (figur 9). Fortsätt räkna tills inga fler vuxna observeras och Undvik att räkna följande generation (räkna inte förbi 9 dagar efter observation av de första vuxna).</li>
	<li>Observera och anteckna resultaten. Justera tidsramen för insamling, inventering och registrering av embryon i enlighet med det muterade beståndet som används.</li>
	<li>Utför en Chi Square-analys. Nollhypotesen förutsätter 100% lönsamhet så att antalet vuxna kommer att vara lika med antalet kläckta embryon och L1 ursprungligen registreras och överföras till livsmedels flaskor</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hartung, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+observations+on+the+larval+growth+rate+and+viability+of+two+tumor+strains+of+Drosophila+melanogaster.">Some observations on the larval growth rate and viability of two tumor strains of Drosophila melanogaster.</a> Science. 107 (2777), 296-297 (1948).</li><li>Moree, R., King, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+Studies+on+Relative+Viability+in+Drosophila+Melanogaster.">Experimental Studies on Relative Viability in Drosophila Melanogaster.</a> Genetics. 46 (12), 1732-1752 (1961).</li><li>Da Costa, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+of+F1+and+F2+generations+of+crossed+Drosophila+and+Oregon+previously+adapted+to+2+different+nutrient+media.">Viability of F1 and F2 generations of crossed Drosophila and Oregon previously adapted to 2 different nutrient media.</a> Comptes rendus de l'Acad&#233;mie des Sciences. 242 (1), 177-180 (1956).</li><li>Garcia-Dorado, A., Caballero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mutational+rate+of+Drosophila+viability+decline:+tinkering+with+old+data.">The mutational rate of Drosophila viability decline: tinkering with old data.</a> Genome Research. 8 (2), 99-105 (2002).</li><li>Lence, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=m6A+modulates+neuronal+functions+and+sex+determination+in+Drosophila.">m6A modulates neuronal functions and sex determination in Drosophila.</a> Nature. 540 (7632), 304-318 (2016).</li><li>Haussmann, I. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=m(6)A+potentiates+Sxl+alternative+pre-mRNA+splicing+for+robust+Drosophila+sex+determination.">m(6)A potentiates Sxl alternative pre-mRNA splicing for robust Drosophila sex determination.</a> Nature. 54 (7632), 301-304 (2016).</li><li>Stockwer, H., Gallant, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+started:+An+overview+on+raising+and+handling+Drosophila.">Getting started: An overview on raising and handling Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).</li><li>Hales, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+on+the+Fly:+A+Primer+on+the+Drosophila+Model+System.">Genetics on the Fly: A Primer on the Drosophila Model System.</a> Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).</li><li>Gardner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Variation+for+Preadult+Viability+in+Drosophila+melanogaster.">Genetic Variation for Preadult Viability in Drosophila melanogaster.</a> Evolution. 55 (8), 1609-1620 (2001).</li><li>Hongay, C. F., Orr-Weaver, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Inducer+of+MEiosis+4+(IME4)+is+required+for+Notch+signaling+during+oogenesis.">Drosophila Inducer of MEiosis 4 (IME4) is required for Notch signaling during oogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14855-14860 (2011).</li><li>Zhong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MTA+Is+an+Arabidopsis+Messenger+RNA+Adenosine+Methylase+and+Interacts+with+a+Homolog+of+a+Sex-Specific+Splicing+Factor.">MTA Is an Arabidopsis Messenger RNA Adenosine Methylase and Interacts with a Homolog of a Sex-Specific Splicing Factor.</a> The Plant Cell. 5, 1278-1288 (2008).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N6-methyladenosine+modification+destabilizes+developmental+regulators+in+embryonic+stem+cells.">N6-methyladenosine modification destabilizes developmental regulators in embryonic stem cells.</a> Nature Cell Biology. 16, 191-198 (2014).</li><li>Hsu, P. J., Shi, H., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitranscriptomics+influence+on+development+and+disease.">Epitranscriptomics influence on development and disease.</a> Genome Biology. 18 (197), 1-9 (2017).</li><li>Kan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+m6A+pathway+facilitates+sex+determination+in+Drosophila.">The m6A pathway facilitates sex determination in Drosophila.</a> Nature Communications. 8, 1-16 (2017).</li><li>Senkowski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Cell+Culture-Based+Screening+Identifies+the+Anthelmintic+Drug+Nitazoxanide+as+a+Candidate+for+Treatment+of+Colorectal+Cancer.">Three-Dimensional Cell Culture-Based Screening Identifies the Anthelmintic Drug Nitazoxanide as a Candidate for Treatment of Colorectal Cancer.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 14 (6), 1504-1516 (2015).</li><li>Ramasamy, S., Bennet, D., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+and+bioactive+molecule+screening+based+on+a+bioelectrical+impedance+cell+culture+platform.">Drug and bioactive molecule screening based on a bioelectrical impedance cell culture platform.</a> International Journal of Nanomedicine. 9, 5789-5809 (2014).</li><li>Weltin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+monitoring+for+drug+screening+and+cancer+research:+a+transparent,+microfluidic,+multi-sensor+microsystem.">Cell culture monitoring for drug screening and cancer research: a transparent, microfluidic, multi-sensor microsystem.</a> Lab on a Chip. 14 (1), 138-146 (2014).</li><li>Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+evaluation+of+in+vitro+cell+culture+models+for+high-throughput+drug+screening+and+toxicity.">A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).</li></ol>

Det finns inga intressekonflikter.

Sammanfattningsvis ger denna metod en noggrann och enkel bedömning av lönsamheten i Drosophila. Hela protokollet tar cirka 14 dagar att slutföra. Förfarandet kräver inte tekniska expertkunskaper. emellertid, rätt timing, en tidsplan för dagliga observationer, och noggrann agar överföring är viktigt för noggrannhet och reproducerbarhet.
Förutom placeringen av druva-agar skiva embryo-sida ner i maten injektionsflaska, en annan avgörande steg i förfarandet är att överföra agar skivan till en mat injektionsflaska senast 48 h efter avlägsnande av druvagar plattan från embryot samling mini burar. Överföring av agar efter 48 h resulterade i embryo och larver förlust, sannolikt på grund av uttorkning av agar skivan. För att räkna L2/L3 övergångar, plattan måste Inkubera för 72 h. Om detta skede är avgörande, bör druvagar plattor hällas tjockare och en fuktig kammare måste användas för att förhindra uttorkning. Korsen sattes upp i embryosamlingsburar som rymmer 35 mm plattor; Detta förfarande kan dock utföras med större embryon uppsamlings burar också, såsom en som rymmer 60 mm eller 100 mm petriskålar.  Mat flaskor måste då vara tillräckligt stora för att rymma dessa storlekar.
Det finns åtgärder som kan läggas till i det här protokollet. Som nämnts ovan, L2/L3 övergångar är utmanande att kvantifiera på tallrikar på grund av den tid som krävs och den potentiella uttorkning av agar. Dessutom, larver blir mycket rörlig på ytan av agar, utgör en utmaning att exakt räkna dem. Placera plattorna i kylskåpet i 30 min eller lägga till några droppar av en mild bedövningsmedel (lidokain lösning) på ytan av agar innan du räknar L2/L3 larver kan hjälpa bromsa deras rörelser att räkna dem mer exakt.  En varning för dessa modifieringar är att de kan införa variabler (kall känslighet, bedövnings känslighet) och blanda ihop lönsamheten resultat.  Även utan dessa steg, genom att använda färgad mat, forskare kan kvantifiera vandrande L3s/prepupae som de bosätta sig på sidan av maten flaskor för att initiera pupation. En begränsning av denna metod är att det kräver att de vuxna som används i korsningar för att överleva är sövda med CO2 för fenotypning att inrätta korsningar i embryon uppsamlings burar. DM ime4 homozygot Mutant hanar inte återhämta sig väl och dö några timmar efter att vakna upp från Co2 behandling.  Andra metoder för att immobilisera vuxna för sortering kan utforskas, såsom att placera flaskor i kylskåpet i några minuter och sedan överföra flaskor till krossad is till långsamma rörelser och sortera snabbt och effektivt.
Bortsett från att jämföra alleliska styrkor och deras effekter på lönsamhet, denna metod kan användas för att skärmens känslighet eller resistens mot definierade farmaceutiska föreningar. Till skillnad från andra metoder som skärmen sammansatta toxicitet i cellkulturen15,16,17,18, denna metod använder hela organismer, gör bedömning av utvecklingseffekter lättare att analysera. Sammanfattningsvis, med hjälp av detta protokoll och ändringar däri, kommer att göra det möjligt att mäta alleliska styrkor samt effekterna av miljöfaktorer och kemiska föreningar på Drosophila lönsamhet, fruktsamhet, fertilitet, livslängd, och varaktighet av utvecklingscykeln.

Livslängden påverkas av genetiska och icke-genetiska faktorer. I standard Lab tillväxtförhållanden vid rumstemperatur, vårt labb har observerat betydande variation av kondition och lönsamhet bland olika DM ime4 alleler odlas under identiska förhållanden (figur 1 och kompletterande siffror). Genomförbarhet studier görs ofta för att undersöka effekterna av en viss allel kombination eller tillväxtvillkor i populationsgenetiska studier1,2,3,4. Detaljerade analyser av lönsamheten inom en icke-komplementär grupp av mutationer är dock svåra att hitta i den vetenskapliga litteraturen. En allel brukar märkas "icke-väsentliga" om forskaren finner ett fåtal individer homozygot för att allel inom livsmedels flaskan som inrymmer balanserade beståndet5,6. Emellertid, noggrann Chi-Square analyser för att bedöma om dessa homozygoter uppstår vid de förväntade Mendelian nyckeltal rapporteras inte5,6. Den mest tillåtande temperaturen för alla Drosophila lager är rumstemperatur (22-23 ° c) och, med lämpliga näringsämnen, livscykeln av Wild-Type flugor tar cirka tolv dagar att slutföra7,8. Eftersom varaktigheten av varje utvecklingsstadium av vildtyp Drosophila är känd7,8, kan den metod som beskrivs i denna rapport användas för att undersöka om Drosophila stammen under studie är lämplig i varje skede i jämförelse med en kontroll som är lämplig för den genetiska bakgrunden testad. I motsats till studier som fokuserar på en specifik aspekt av utveckling9, ger detta protokoll ett praktiskt sätt att bedöma lönsamheten i olika utvecklingsstadier.
I vårt labb, detta protokoll används för att bedöma lönsamheten för bestånd som är bristfällig för Drosophila inducerare av Meiosis 4 (DM ime4). DM ime4 är en essentiellgen 10 som kodar ett RNA-metyltransferas med kritiska roller i RNA-metabolism i Drosophila och andra flercelliga organismer5,6,10, elva , 12 , 13 , fjorton . För att snabbt utvärdera nya alleler av DM-ime4 som genererats via CRISPR/Cas9 (kompletterande siffror) utfördes en analys av slutpunkts genomförbarhet som endast räknade vuxna avkomman som producerats inom injektionsflaskor med balanserade bestånd (figur 1). Några av de bestånd som används beskrevs i tidigare DM ime4 rapporter5,6. Homozygot mutanter uppstod vid sub-Mendelian nivåer, som bestäms av Chi-kvadrat analyser (figur 1 och kompletterande material). För att bedöma om dessa lägre antal än väntat berodde på färre embryon som lades, eller färre kläckta embryon, eller förlust av livskraft i L1/L2 eller puppor, utvidgade vi spårningen till att omfatta räknas vid var och en av dessa utvecklingsstadier (figur 2, Figur 3, figur 4, figur 5, figur 6, figur 7, figur 8och figur 9).
Här beskriver vi metoden med Wild-Type (OreR) flugor. För att empiriskt testa denna metod för användning med andra genetiska bakgrunder eller Drosophila arter, rekommenderar vi att använda OreR som referens och justera tidspunkter enligt den experimentella organismen.  Protokollet utvärderades ytterligare för att bedöma lönsamheten för avkomman som genererats genom att korsa Virgin Wild-Type honor med hanar från en heterozygot DM ime4 Mutant Stock5,6 (figur 4).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:665px;" width="665">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antimold additive</td>
			<td style="width:121px;">Carolina</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Beaker</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scentific</td>
			<td style="width:161px;">S76100J</td>
			<td>Beaker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Benchmark scientific digital hotplate</td>
			<td style="width:121px;">The Lab Depot</td>
			<td style="width:161px;">H3760H</td>
			<td>Hot plate</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Britta-filtered tap water to prepare grape agar and instant fly food</td>
			<td style="width:121px;">Any tap water filtration system</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CO2 pistol or FlyNap</td>
			<td style="width:121px;">Carolina</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td>Anesthetic to sort/count adult flies</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dissecting microscope/stereoscope</td>
			<td style="width:121px;">Amscope</td>
			<td style="width:161px;">SM-1TSZ-V203</td>
			<td>Dissecting microscope</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Drosophila culture vials and stoppers</td>
			<td style="width:121px;">Carolina</td>
			<td align="right" style="width:161px;">173120</td>
			<td>Food vials for growing Drosophila</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Embryo collection mini cage</td>
			<td style="width:121px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:161px;">59-105</td>
			<td>chamber used to gather embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Erlenmeyer flask</td>
			<td style="width:121px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:161px;">70980</td>
			<td>Erlenmeyer flask</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Formula 4-24 Instant Drosophila Medium, Blue</td>
			<td style="width:121px;">Carolina</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td>https://www.carolina.com/drosophila-fruit-fly-genetics/formula-4-24-drosophila-medium-blue/FAM_173210.pr</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Grape agar</td>
			<td style="width:121px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:161px;">47-102</td>
			<td>Media used for agar plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Instant fly flood</td>
			<td style="width:121px;">Carolina</td>
			<td align="right" style="width:161px;">173210</td>
			<td>Blue media for food vials</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td height="21" style="height:21px;">Large Petri dish or any clear container to be used as a humid chamber by placing wet paper towels to keep the grape-agar plates moist during incubation/pre and post microscopic observation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Metal spatula (small)</td>
			<td style="width:121px;">Carolina</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microwave</td>
			<td style="width:121px;">Any</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td>To cook grape agar</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dish</td>
			<td style="width:121px;">Kord-Valmark</td>
			<td align="right" style="width:161px;">2901</td>
			<td>Petri dish for grape agar</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Stir bar</td>
			<td style="width:121px;">The Lab Depot</td>
			<td style="width:161px;">58948-981-EA</td>
			<td>Magnetic stir bar</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a direct and simple method to assess drosophila melanogaster's viability from embryo to adult

I Drosophila melanogasteranvänds lönsamhetsanalyser för att fastställa lämpligheten hos vissa genetiska bakgrunder. Alleliska variationer kan resultera i partiell eller fullständig förlust av lönsamhet i olika utvecklingsstadier. Vårt labb har utvecklat en metod för att bedöma lönsamheten i Drosophila från embryo till fullt mogen vuxen. Metoden bygger på att kvantifiera det antal avkomman som finns i olika stadier under utvecklingen, med början i kläckade embryon. Efter att embryona har kvantifierats räknas ytterligare stadier, inklusive L1/L2, puppor och mogna vuxna. Efter att alla stadier har undersökts används en statistisk analys som Chi-Square-testet för att avgöra om det finns en signifikant skillnad mellan start antalet avkomma (kläckta embryon) och senare stadier som kulminerar i det observerade antalet vuxna. således avvisa eller acceptera nollhypotesen (att antalet kläckta embryon kommer att vara lika med antalet larver, puppor, och vuxna registreras under utvecklingsstadierna). Den främsta fördelen med denna analys är dess enkelhet och noggrannhet, eftersom det inte kräver ett embryo skölj för att överföra dem till maten injektionsflaskan, undvika förluster från tekniska fel. Även om det protokoll som beskrivs här inte direkt undersöker för L2/L3 larver, kan ytterligare steg läggas till för att redovisa dessa. Jämföra antalet kläckta embryon, L1, puppor, och vuxna kan hjälpa till att avgöra om lönsamheten var äventyras under L2/L3 stadier för ytterligare studier (användning av färgade livsmedel hjälper till med visuell identifiering av larver). Sammantaget kan denna metod hjälpa Drosophila forskare och lärare avgöra när lönsamheten äventyras under flyga livscykel. Rutinmässig bedömning av bestånd med hjälp av denna analys kan förhindra ackumulering av sekundära mutationer som kan påverka fenotyp av den ursprungligen isolerade Mutant, särskilt om de ursprungliga mutationer påverkar Fitness. Av denna anledning, vårt labb upprätthåller flera kopior av var och en av våra DM ime4 alleler och rutinmässigt kontrollerar renhet av varje bestånd med denna metod utöver andra molekylära analyser.

Denna metod korrekt och reproducerbart tillåter en att mäta lönsamhet från embryon till vuxit fram vuxna när de kopplas till Chi Square analyser.
I initiala studier, efter att ha räknat embryon och larver, placerades druvagar inuti injektionsflaskan upprätt på sidan av injektionsflaskan. Tyvärr, när agar placerades på sidan av injektionsflaskan många av embryon och larver inte mogna till vuxna. Detta berodde sannolikt på att druvagar-skivan torkar ut (figur 3). Denna placering infördes en miljövariabel (hydrering av agar skiva) som kunde blanda ihop resultaten. Ungefär 39% av avkomman förlorades mellan embryon till vuxna som endast 61% av vuxna dök upp. De största förlusterna inträffade mellan L1 larver (räknat på ytan av druvagar plattor) och puppor (räknat på väggarna i livsmedel flaskor) räknas. När druvagar placerades på insidan av injektionsflaskan i direkt kontakt med födo ytan försvann dock mindre än 6% av avkomman (figur 2). Agar förblev hydrerad som hela druvagar skivan förblev i kontakt med fukten i omedelbar mat inuti flaskan (figur 7, figur 8). Dessa resultat indikerar att placeringen av agar inuti injektionsflaskan är viktig för att erhålla tillförlitliga data och minimera bidraget av miljövariabler. Ytterligare uppgifter för att stödja metodens effektivitet samlades in genom en jämförelse av den vildtyp-avkomman som användes vid den första metodens validering och avkomman som framställts genom att korsa jungfru vilda hondjur till hanar från ett balanserat DM ime4 Mutant bestånd ( Kompletterande figur 2, IME4ΔNULL/avsett TM3SB). Ungefär 91% av avkomman mognat till vuxen ålder jämfört med 94% av avkomman från vildtyp (figur 4).  Denna skillnad var inte statistiskt signifikant.
Homozygous DM ime4 Mutant hanar5 användes också för att ge ytterligare validering av metoden. Men homozygot mutanter var för sjuka för att reproducera och dog innan embryon sattes in. Därför är en begränsning av experimentet att män måste vara friska nog att reproducera sig för att generera en start embryonal population att spåra.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig1.jpg"> Figur 1 : DM ime4 Mutant bestånd dyka upp på sub-Mendelian nivåer. Bestånd där delar av den katalytiska domänen eller ADO-met bindande domän var muterade visas (se kompletterande figur 1 för detaljer). Vissa bestånd hade delar av antingen domänen ersätts med ALA (alanin-scanning mutagenes), medan andra bestånd hade antingen eller båda domäner bort. Förhållandet mellan observerade antalet homozygoter till de förväntade siffrorna representeras i procent (jämfört med heterozygot syskon kontroller, se kompletterande figur 3 för sortering schema och Chi Square analys). Chi Square-analyser utfördes för att avgöra om skillnaden mellan observerad och förväntad var statistiskt signifikant och inte enbart på grund av slumpen (p-värden < 0,01). Felstaplar representerar standardfel för medelvärdet (minst tre försök per kryss anges).  Ett kalkylblad med alla data kan hittas i kompletterande material. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig2.jpg"> Figur 2 : Agarposition inuti injektionsflaskan kan introducera oavsiktliga miljövariabler. Histogram över antalet individer i olika stadier av utvecklingen räknat från druvagar skiva embryo sida ner i mat injektionsflaska eller agar på sidan av maten injektionsflaska. Att placera agarskivan embryo-sida nedåt i injektionsflaskan resulterade i 94% (SD ± 0,02) av initiala embryon överlevande fram till vuxen ålder. Placering av agar på sidan av maten injektionsflaska resulterade i endast 61% (SD ± 0,07) av de ursprungligen räknade embryon når vuxen ålder. Ett kalkylblad med alla data kan hittas i kompletterande material. De förväntade siffrorna i varje etapp anges som det initiala antalet embryon/L1 som räknats på druvagar-skivan innan de överförs till injektionsflaskan med livsmedel (nollhypotesen: 100% av kläckta embryon utvecklas). De observerade siffrorna är det faktiska antalet individer som räknas för utvecklingsstadiet som anges. Varje etapp jämförs således med det initiala antalet kläckta embryon som räknats på druvagar-plattan. Chi Square analyser utfördes för att avgöra om skillnaden mellan observerade och förväntade var statistiskt signifikant och inte på grund av en slump med hjälp av ett p-värde tröskel på 0,05. Skillnaden var signifikant för embryon som odlas med agar på sidan av injektionsflaskan med föda, men inte för dem som odlas i en skivembryonal sida ner. Felstaplarna representerar standardfel (minst tre försök per kryss anges). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig3.jpg"> Figur 3 : Tecknad visar två sätt druvagar skivor transporterar embryon/L1s kan placeras inuti maten injektionsflaska. Det fanns en signifikant skillnad mellan det totala antalet embryon och vuxna avkomman baserat på placeringen av agar i injektionsflaskan med livsmedel. Skillnaden beror på en miljövariabel (hydrering) som skapas av skillnaden i skiv placering inne i injektionsflaskan med föda: det finns en statistiskt signifikant skillnad mellan förväntat och observerat tal i larverna och puppan räknas när agar skivan placerades på sidan av injektionsflaskan kontra ingen signifikant skillnad i förväntade kontra observerade tal när agarskivan var i kontakt med livsmedlet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig3large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig4.jpg"> Figur 4 : Histogram som visar antalet individer i olika stadier av utveckling från vildtyp män kontra män från en DM ime4 Mutant balanserad lager. Balanserad hanar korsade till Virgin vildtyp honor som beskrivs i 2,1.  Agar överfördes embryo-sida ner i mat flaskor.  Det genomsnittliga förhållandet mellan vuxna och de ursprungliga embryon som räknats i druvagar-skivor från vildtyp X vildtyp var 94%, SD ± 0,02, medan förhållandet för DM ime4 Mutant/+ X Wild-type var 91%, sd ± 0,01. Statistisk analys har utförts enligt figur 2. skillnader var inte signifikanta för endera gruppen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig4large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig5.jpg"> Figur 5 : Experimentell installation. A) mini-burar för insamling av embryon och druvagar-mini-petriskålar. Plattorna är placerade inuti en fuktig kammare (standard petriskål med absorberande pappers skiva mättad med vatten) för att förhindra uttorkning.  En liten mängd jästpasta placerades i mitten av varje druva-agar plattan.  (B) Lossa plattan hållaren locket (röd) och placera en förberedd tallrik, jäst sida upp.  (C) överför korset till embryobur och omedelbart placera en petriskål att hålla flugor inuti.  (D) snabbt ta bort locket och vänd embryobur så öppna kontakter druva-agar plattan.  Inkubera för 24-48 h, inspektera dagligen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig5large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig6.jpg"> Figur 6 : Embryonal utveckling på druva-agar plattor. A) vildtyp embryon som deponeras på druvor-agar mini-petriskålar räknas under en dissekera Mikroskop. Förvara plattorna inuti fuktiga kammaren när de inte visualiserar och undviker direkt ljus för att förhindra uttorkning.  B) druvagar-plattor förvaras i en fuktig kammare och kläckas vildtyp embryon registreras.  Detta foto visar tre vildtyp L1 larver som utvecklats från embryon som visas i A.  C) exempel på antal registrerade embryon (dag 1) och L1-larver (dag 2) för de två plattorna som visas i figur 5.  "Förväntat antal" för nollhypotesen bestäms av antalet embryon som kläckts och blev L1 larver vid tidpunkten för överföringen till livsmedels flaskan (tabell nedan).  För vildtyp flugor, nästan alla embryon kläcks och utvecklas till L1 larver.  Detta kan inte vara fallet för andra genetiska bakgrunder och denna metod används för att fastställa dessa skillnader i lönsamhet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig6large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig7.jpg"> Figur 7 : Överföra larver.  (A) efter att L1-värdena har tagits bort, avlägsnas druvan-agar-skivorna försiktigt från petriskål med en ren (etanol-torkas) spatel (B,C) och överförs L1 sida-ner för att kontakta livsmedlet i injektionsflaskorna som visas i D.  (E) den tomma petriskål inspekteras noggrant för att upptäcka eventuella larver kvar.  Om larvaee kvar är levande och kan överföras till mat flaskan, gör så noggrant och omedelbart (F).  Om larverna kvar är döda eller inte kan överföras, registrera detta faktum att korrigera "Förväntat antal" för efterföljande beräkningar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig7large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig8.jpg"> Figur 8 : L2 larver gör sin väg in i maten. Se sprickor och spår mellan druvagar-skivan och den blå maten.  Ställ in ett schema för att observera injektionsflaskorna dagligen, helst vid samma tidpunkt på dagen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig8large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig9.jpg"> Figur 9 : Vuxen-uppkomst. (A) L3 larver gör sin väg ut ur maten för att bli puppa.  (B) vuxna börjar dyka upp på dag 11.  Ställ in ett schema för att observera injektionsflaskorna dagligen, helst vid samma tid på dagen och noggrant anteckna dina observationer.  Sluta räkna när alla puppor har uppstått (räkna tomma puppor fall) och undvika att räkna nästa generation av flugor genom att stoppa experimentet på dag 15 och räkna döda puppor om någon (svart/torkad puppor).  Mutanter med långa livscykler kan behöva längre tid, som måste bestämmas empiriskt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig9large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Kompletterande siffror. Vänligen klicka <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/Supplemental_Figures.zip" target="_blank">här för att ladda ner dessa filer.</a>  
Kompletterande material. Vänligen klicka <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/Supplemental_Materials.zip" target="_blank">här för att ladda ner dessa filer.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult at JoVE.com

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

Detta protokoll är utformat för att bedöma Drosophilas livskraft vid varje utvecklingsstadium, från embryo till vuxen. Metoden kan användas för att bestämma och jämföra lönsamheten för olika genotyper eller tillväxtförhållanden.

En direkt och enkel metod för att bedöma Drosophila melanogasterlönsamhet från embryo till vuxen

In Drosophila melanogaster, viability assays are used to determine the fitness of certain genetic backgrounds. Allelic variations can result in partial or ...

Den primära fördelen med denna analys är enkelheten och noggrannheten eftersom det inte kräver ett embryo skölj för att överföra till mat injektionsflaskan och som undviker förluster från tekniska fel. Detta protokoll kräver inte experttekniska färdigheter. Men den korrekta tidpunkten och noggrann vattenöverföring är viktiga för dess noggrannhet och reproducerbarhet.Visar detta förfarande kommer att Antonio Rockwell, en nyligen examen doktorand från mitt laboratorium. Innan du börjar med proceduren, häll druvagar i en 35-millimeters Petri-skålen till halvfull och låt agar att stelna i en timme. När agarn har stelnat, använd en liten plastkniv för att försiktigt skrapa agarens yta runt utsidan av plattan och lämna mitten av plattan fri från repor.Placera sedan en liten mängd nyberedda jästpasta i mitten av skålen och placera skålen i ett embryo samling mini bur. För embryosamling, första plats två jungfru Drosophila honor och en ung hane inne i samlingen buren i 24 timmar. Nästa dag, inspektera botten av agarplattan för att leta efter embryon.Om embryon har lagts, överför agarplattan till en fuktig kammare och täck plattan med locket för att undvika uttorkning. Om flera dagars läggning ska göras, placera en ny agar platta i samlingen buren. Använd mikroskopet för att bestämma antalet kläckta embryon och L1-larver, och återföra embryona till den fuktiga kammaren vid rumstemperatur tills alla embryon har kläckts och utvecklats till L1-larver.Efter 48 timmar, räkna antalet kläckta embryon och L1 larver och använd en spatel för att försiktigt ta bort skivan av druvagar från Petriskålen, placera disken L1-sidan ner på maten i en matflaska som är tillräckligt stor för att rymma skivan. Inspektera sedan noggrant petriskålen för eventuella kvarvarande larver. Övervaka matflaskan dagligen vid ungefär samma tid varje dag för att bekräfta att larverna L2 och L3 kan observeras på väg till maten.Registrera antalet puppor och vuxna Drosophila, fortsätter att räkna tills inga fler vuxna observeras och undvika att räkna den efterföljande generationen. Utför sedan en chi-square analys. Nollhypotesen förutsätter en 100%lönsamhet, så att antalet vuxna kommer att vara lika med antalet kläckta embryon och L1 ursprungligen registreras och överförs till livsmedels- injektionsflaska.När agaren placeras på sidan av injektionsflaskan mognar många av embryona och larverna inte till vuxna, sannolikt på grund av druvagarskivans uttorkning. När druvagaren placeras nedåt inuti injektionsflaskan i direkt kontakt med matytan, är mindre än 6%av avkomman vanligtvis förlorad, eftersom agaren förblir hydrerad när den är i kontakt med fukten från snabbmat inuti injektionsflaskan. I detta representativa experiment som jämförde vildtyps- och mutant avkommautveckling, mognade ungefär 91%av den muterade avkomman till vuxen ålder med denna metod jämfört med 94%av avkomman från flugor av vildtyp.Kom ihåg att överföra agarskivan embryo-sida ner i matflaskan och sedan, för att kontrollera den tomma Petri-skålen för eventuella kvarvarande larver som inte fick överföras. Ett annat avgörande steg är att överföra agarskivan till en matflaska senast 48 timmar efter att du tagit bort druvagarplattan från miniburarna för att förhindra uttorkning.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

Epigenetiska Konvertering som en säker och enkel metod för att få insulinfrisättande cellerna från sex hudfibroblaster

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

Using Touch-evoked Response and Locomotion Assays to Assess Muscle Performance and Function in Zebrafish

Användning av anslags-framkallat svar och Locomotion Analyser för att bedöma muskel prestanda och funktion i Zebrafish

Zebrafish muscle development is highly conserved with mammalian systems making them an excellent model to study muscle function and disease. Many ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Metoder för att undersöka lymfkörtel och hemocyter i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Acute and Chronic Models of Hyperglycemia in Zebrafish: A Method to Assess the Impact of Hyperglycemia on Neurogenesis and the Biodistribution of Radiolabeled Molecules

Akuta och kroniska modeller av hyperglykemi i sebrafisk: En metod för att bedöma effekterna av hyperglykemi på neurogenes och biodistribution av radiomärkta molekyler

Hyperglycemia is a major health issue that leads to cardiovascular and cerebral dysfunction. For instance, it is associated with increased neurological ...

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

En enkel metod för att identifiera kinaser som reglerar embryonisk stamcellspluripotens genom genomströmningshämmande screening

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

En snabb och effektiv metod att dissekera Pupp vingar av Drosophila lämplig för Immunodetections eller PCR-analyser

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

En förenklad och effektiv metod att isolera primära mänskliga keratinocyter från vuxen hudvävnad

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Direkt härstamning omprogrammering av vuxen mus Fibroblast till erytroid stamfäder

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Levande avbildning och analys av muskelsammandragningar i Drosophila embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Upptining, odling och bevarandet Drosophila cellinjer

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...