Name: using human induced pluripotent stem cells for the generation of tumor antigen-specific t cells
Uploaded: 2019-10-24T13:00:00
Duration: 10 min 57 s
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我们感谢艾伦·胡弗林和埃里娜·他寻求图形援助。这项研究得到了国家癌症研究所（ZIA BC010763）的内学研究计划（ZIA BC010763）和基于细胞的癌症免疫治疗的内NCI癌症月射计划的支持。

1. 在小鼠胚胎纤维细胞（MEF）上培养人类iPSC（hiPSC）
注：也可以使用培养 hiPSC 的替代方法，包括但不限于：在 6 孔板上播种，预涂有明胶、胶状蛋白混合物、重组层蛋白 511，或用于 hiPSC 扩展的任何其他细胞外基质，以及使用专为人类多能干细胞培养而配制的定明介质培养。
<ol><li>
栽培 MEF
	<ol>
<li>涂上4 mL 0.1%明胶的10厘米细胞培养培养培养皿，在37°C下孵育30分钟。</li>
		<li>将一小瓶4 x 106辐照MEF快速解冻至10 mL的37°C MEF介质（DMEM = 10% FBS = 1x青霉素-链霉素 = 1x L-谷氨酰胺补充剂）。在 300 x g下在 4°C 下离心 5 分钟。吸出上清液，在MEF介质的9 mL中重新悬浮细胞颗粒。</li>
		<li>从培养箱中取出明胶涂层的盘子。吸气明胶，并添加7 mL的MEF介质。将 MEF 悬架的 3 mL 板（从步骤 1.1.2）板到明胶涂层盘上。从侧面和前后摇动菜，确保 MEF 在盘子上均匀分布。在37°C孵育8-36小时。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
在 MEF 上传递 hiPSC 注：数据是使用从长期培养的黑色素瘤TIL中提取的MART-1 iPSC生成的，该类型在HLA-A_02：01上下文中专门识别MART-1肽，如前所述18。<ol>
<li>当菌落直径在 0.8 - 1.2 mm 之间时，通过 hiPSC。在通过之前，在立体显微镜中检查hiPSC菌落，并使用200 μL尖端的塑料边缘去除培养体的任何分化区域。</li>
		<li>吸气废介质，并添加10 mL hiPSC介质（人类ES培养基 [材料表]= 10纳克/mL 人类基本成纤维细胞生长因子[hbFGF]）辅以10μM ROCK抑制剂。</li>
		<li>一手握住细胞培养皿，将一次性细胞传递工具卷过整个盘子，朝一个方向。施加足够的压力，使整个滚轮叶片接触培养皿，并在滚动操作过程中保持均匀的压力。</li>
		<li>旋转培养皿 90°并重复步骤 1.2.3。在显微镜中查看板，以目视确认对菌落的正确切割，这些菌落应呈方格。使用 200 μL 移液器通过温和的机械冲洗分离切割菌落。 注：用滚筒切割菌落后，必须立即通过机械冲洗分离切割菌落，因为 3 分钟后，切割菌落将开始重新连接到盘子，并且很难通过冲洗分离同质大小的菌落。</li>
		<li>将 350 - 600 团切割菌落转移到新的 10 厘米的 MEF 盘中（在 hiPSC 传化前 8 - 36 小时）与 10 mL 的新鲜 hiPSC 介质辅以 10 μM ROCK 抑制剂。在37°C孵育。 注：600团表示约1.0 x 106 MART-1 iPSC，将在第35天产生0.5-1.0 x 106 DP细胞。但是，预期数量将因起始细胞系的效力和培养条件而异。</li>
		<li>第二天，吸气废介质并添加 10 mL 的新鲜 hiPSC 介质。根据 hiPSC 增长率，每 1-2 天更换一次 hiPSC 介质。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 制备OP9/DLL1细胞，用于与hiPSC共培养
<ol><li>OP9培养基中[最小必需介质（β-MEM）+20%胎儿牛血清（FBS）+1x青霉素-链霉素]中的培养蛋白在37°C下。当OP9/DLL1细胞达到汇合时，吸气培养基用5mL的1x镁、钙和无苯酚无红磷酸盐缓冲盐水（PBS）。洗涤一次。</li>
	<li>吸气PBS，并添加2 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA。 在37°C下孵育5分钟。然后，加入4 mL的OP9介质，通过移液机械分离细胞层，使单细胞悬浮。</li>
	<li>通过100μm细胞过滤器将细胞悬浮液转移到50 mL锥形管中，以避免细胞团块。在 300 x g下在 4°C 下离心 5 分钟。吸出上清液，并在 OP9 介质的 12 mL 中重新悬浮。</li>
	<li>在 6 个新的 10 厘米细胞培养培养皿中，每增加 8 mL 的 OP9 介质。从步骤 2.3 到每个新的 10 厘米盘的 OP9/DLL1 细胞悬浮液的板 2 mL。从正面到背面摇动菜，以确保 OP9/DLL1 在盘上均匀分布。</li>
	<li>在37°C孵育。当细胞到达汇合时，每2-3天重复一次。 注：制作足够的OP9/DLL1细胞冷冻库存，每4-6周解冻一次新股票，这一点很重要。</li>
</ol>3. 在体外分化高PSC到CD8+++单正（SP）T细胞
<ol><li>在与 hiPSC 共同培养前一周准备明胶化 OP9/DLL1 菜肴。要制备0.1%明胶溶液，将5mL室温（RT）组织级库存明胶溶液加入500 mL的PBS中。
	<ol>
<li>涂层 3 新的 10 厘米细胞培养培养培养皿，每道菜加入 4 mL 0.1% 明胶。 在37°C下孵育30分钟。</li>
		<li>吸气明胶，并在每道菜中加入8 mL的OP9介质。将 OP9/DLL1 的一个汇盘中（如上文第 2 节所示）移至三道明胶预涂盘。</li>
	</ol></li>
	<li>4天后，在明胶上每 10 厘米的 OP9/DLL1 盘中添加 10 mL 的 OP9 介质，每道菜共 20 mL 的介质。</li>
	<li>7 - 8天后，开始对OP9/DLL1汇盘（分化日0）进行hiPSC共培养。
	<ol>
<li>吸气花费媒体从融合 10 厘米盘的 hiPSC 在 MEF.添加 10 mL 的 OP9 介质。使用一次性细胞通过工具切割和分离 hiPSC 菌落，如步骤 1.2.3 和 1.2.4 中所做的那样。</li>
		<li>使用 200 μL 移液器将 350 - 600 团切割菌落转移到 10 厘米预明胶化 OP9/DLL1 盘（步骤 3.1）上，使用 10 mL 的新鲜 OP9 介质。从正面到背面摇动文化菜，以确保菌落的均匀分布。 注： 或者，可以使用预成型的 hiPSC 胚胎体 （IB） 或小团块悬浮液。 然而，使用一次性细胞传递工具或EB形成系统是首选产生统一大小的hiPSC团块。</li>
	</ol></li>
	<li>在第 1 天，吸气废旧介质，并替换为 20 mL 的新鲜 OP9 介质。在OP9/DLL1上共同培养1天的hiPSC团群将显示为小圆单层菌落（图1）。</li>
	<li>第 5 天，吸出 10 mL 的废介质，并添加 10 mL 的新鲜 OP9 介质。hiPSC菌落将开始分化成原始中皮，其特点是多层黑暗中心。</li>
	<li>第 9 天，吸出 10 mL 的废介质，并添加 10 mL 的新鲜 OP9 介质。此时，多层中心结构将演化为圆顶状形状，外围网络状区域将开始变得明显。</li>
	<li>第13天，收获造血祖细胞（HPCs）（图1）。第13天HiPSC衍生结构的特点是一个黑暗的中央器官，周围是圆顶状区域网络，代表先前报告包围人类胚胎干细胞衍生造血祖体的造血区（HZs）21. 注：在没有暗中心的情况下，圆顶状结构的存在表明过程是成功的。无法生产 HPC 可能是由于 OP9/DLL1 质量差、FBS 批次质量低、种子到 OP9/DLL1 上的 iPSC 团块的汇合（350-600 团群是最佳），以及/或 iPSC 管路效力的变化以产生造血前体。<ol>
<li>吸气废介质和洗涤1x与5mL的1x苯酚无红汉克斯的平衡盐溶液与钙和镁（HBSS）修饰。</li>
		<li>吸气HBSS，在10 mL的HBSS中加入250μL的5000单位/mL胶原酶IV。在37°C孵育45分钟。用胶原酶IV吸脂HBSS，用5mL的PBS洗涤一次。</li>
		<li>吸气PBS，并加入5 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA。在37°C孵育20分钟。然后，加入4 mL的OP9介质，通过移液分离细胞层，使单细胞悬浮。</li>
		<li>通过100μm细胞过滤器将细胞悬浮液转移到50 mL锥形管中。 在 300 x g下在 4°C 下离心 5 分钟。吸出上清液，并在 OP9 介质的 10 mL 中重新悬浮。</li>
		<li>板细胞悬浮到新的明胶10厘米细胞培养培养皿（见步骤3.1.1和3.1.2）。在37°C孵育45分钟。然后，通过温和的移液收集非粘附细胞。</li>
		<li>通过100μm细胞过滤器将收集的细胞悬浮液转移到50mL锥形管中。 在 300 x g下在 4°C 下离心 5 分钟。在10 mL的分化介质中吸出上清液并重新悬浮[OP9介质，具有5纳克/mL人类干细胞因子（hSCF）、5纳克/mL人FLT3配体（hFLT3L）和5纳克/mL人类白细胞介素7（hIL-7）]。</li>
		<li>将细胞悬架盘到新的 10 厘米 OP9/DLL1 汇盘中。</li>
	</ol></li>
	<li>第16天，通过细胞。
	<ol>
<li>通过温和的移液和过滤100μm细胞过滤器，机械地分离非粘附细胞。在 300 x g下在 4°C 下离心 5 分钟。吸出上清液，并在10 mL分化介质中重新悬浮。</li>
		<li>将细胞悬架盘到新的 10 厘米 OP9/DLL1 汇盘中。</li>
	</ol></li>
	<li>之后每5-7天通过重复步骤3.8继续传递非粘附细胞。</li>
	<li>在第35天，丰富CD4+CD8+双阳性（DP）总体，刺激产生CD8+++SP T细胞（图2）。 
	<ol>
<li>通过温和的移液和过滤100μm细胞过滤器，机械地分离非粘附细胞，以去除细胞团块。根据制造商的协议，通过CD4磁珠隔离来丰富CD4+细胞群。 注：使用CD4磁珠的原理是从培养基中去除CD4-CD8-DN细胞，因为已经证明这些细胞在刺激后会导致CD4+CD8+DP细胞的直接杀伤。</li>
		<li>使用 Neubauer 血细胞计和 Trypan 蓝色染料计数活 CD4 富集细胞。 以总浓度 0.5 x 106细胞/mL 悬浮在 OP9 介质中。将1 mL的细胞悬浮液（0.5 x 106细胞）放入每个孔的组织培养平底24孔板的汇合OP9/DLL1。</li>
		<li>加入100 IU人白莱素2（hIL-2），5纳克/mL hIL-7，500纳克/mL抗人CD3抗体，2μg/mL抗人CD28抗体，然后在37°C培养。</li>
		<li>在刺激后第4-7天，收集细胞进行分子分析（图3）或与肽脉冲抗原呈现细胞（APC）共培养。</li>
	</ol></li>
</ol>4. 测量hiPSC衍生CD8+++SP T细胞的抗原特异性
注：用于此测试的 APC 类型取决于 hiPSC 衍生 T 细胞的 MHC 限制。在这里，使用T2细胞系，这是T和B淋巴细胞系的杂交。T2细胞表达HLA-A_02：0123，这是由JKF6细胞识别，其中MART1-iPSC派生18。此 T2 细胞系可在 RPMI 1640 + 20% FBS + 1x 青霉素-链霉素中扩展，当细胞密度达到 5 x 105细胞/mL 时，可通过。
<ol><li>使用 Neubauer 血细胞测定仪和锥形蓝色染料计数实时 HLA-A_02：01= T-B 混合淋巴细胞 T2 细胞。在24孔组织培养板中孵育APC，在37°C下用1μg/mL MART-1肽孵育2小时。 注：最佳肽浓度是可变的，取决于细胞系和抗原特异性。</li>
	<li>收集APC，用10 mL的PBS洗涤2倍，以去除任何额外的肽。</li>
	<li>在 OP9 介质中计数 APC 并悬浮在 2 × 5 x 105个单元/mL，介质中具有 100 IU IL-2 和 5 纳克/mL IL-7。将100 μL的细胞悬浮液（2-5 x 104细胞）放入超低附件U底部96孔板的每个孔中，或直接放入预涂的ELISpot板中。</li>
	<li>使用细胞分拣机对HIPSC衍生的CD8++++SP T细胞（抗人CD3/CD28抗体刺激后1周）进行分类，并在100 IU IL-2和5 ng/mL IL-7的OP9介质中悬浮在1 x 106细胞/mL。将100μL的细胞悬浮液（1 x 105细胞）到APC的每口井中，在37°C下培养16-20小时。</li>
	<li>16-20小时后，根据制造商的协议（图4）通过ELISpot测定分析细胞因子分泌配置文件。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brauer, P. M., Singh, J., Xhiku, S., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cell+Genesis:+In+Vitro+Veritas+Est.">T Cell Genesis: In Vitro Veritas Est.</a> Trends in Immunology. 37 (12), 889-901 (2016).</li><li>Rosenberg, S. A., Restifo, N. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Durable+complete+responses+in+heavily+pretreated+patients+with+metastatic+melanoma+using+T-cell+transfer+immunotherapy.">Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T-cell transfer immunotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).</li><li>Crompton, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+relationship+of+CD8(+)+T+cell+subsets+is+revealed+by+progressive+changes+in+the+epigenetic+landscape.">Lineage relationship of CD8(+) T cell subsets is revealed by progressive changes in the epigenetic landscape.</a> Cellular and Molecular Immunology. 13 (4), 502-513 (2016).</li><li>Henning, A. N., Klebanoff, C. A., Restifo, N. 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作者没有披露。

OP9鼠位细胞的共同培养是一个完善的系统，用于从HSPC和多能干细胞体外生成淋巴细胞（即NK、B和T细胞）。Notch信号是诱导T系承承诺的，可以通过Notch配体DLL1或DLL4的异位表达来完成，后者对T细胞生成1具有可比的疗效。因此，OP9/DLL1共培养系统已成为在体外产生T细胞的广泛使用方法。 此外，该方法适用于多种类型和来源的人体细胞，包括脐带血、骨髓HSPC和ESCs。 然而，从这些源中产生T细胞受到来源细胞检索不足或对T细胞1的低效分化的限制。此外，具有单个 TCR 重组的 T 单元产品不能从这些开放式剧目源生成。通过使用再生医学技术，即诱导多能干细胞（iPSC）技术，有可能产生大量抗原特异性T细胞，用于基于细胞的治疗15。
hiPSC 与多能 ESC 类似，其自我更新、无限扩张和能够区分体内任何类型的体细胞的能力;然而，他们缺乏关于使用胚胎源产品用于临床应用的道德问题。此外，hiPSC可以从任何体细胞生产，允许开发个性化药物的细胞产品。在以前的报告中，hiPSC是从人类T细胞中产生的，使用全外周单核细胞、CD3+细胞或分离的细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）作为来源18，19，22， 26.当HiPSC从T细胞源（T-iPSCs）生成时，原始TCR基因重新排列被继承。因此，患者T-iPSC衍生T细胞可以通过靶向患者独特的癌症抗原，为个性化的ACT治疗提供模型。
人类多能干细胞分化为T系细胞分为两个步骤：造血祖细胞（HPCs）27及其进一步分化为T系细胞21。这两个步骤都可以使用 OP9/DLL1 共区域性系统完成。重要的是，OP9/DLL1进纸细胞的质量对T细胞分化的成功至关重要。由于OP9/DLL1细胞不是不朽的同质细胞系，FBS质量和培养条件对于保持其扩张而不丧失支持hiPSC分化的能力至关重要。因此，建议在细胞与细胞质接触开始发生时，一致地预先评估FBS的批次和通道，以防止细胞分化和衰老。需要考虑的一点是，根据显微镜的相位对比度和放大倍率，细胞与细胞接触可能与背景无法区分。根据我们的经验，大多数 OP9/DLL1 菜肴在准备通过时看起来有 80% 的康收。
研究表明，OP9/DLL1共培养从T-iPSC产生的重新分化的T系系细胞在刺激18、19时可产生CD8+SP T细胞。然而，再生CD8+SP T细胞获得先天状CD8+homodimer22，28，这是TCR信号29的无效共受体。 此外，这些再生的CD8+SP T细胞表现出强烈的TCR无关细胞毒性，使这些细胞不利于临床使用30。该协议描述了最近一种方法，涉及刺激纯化CD4+ CD8+ DP细胞，以产生CD8++ SP T细胞与更传统的表型和改进抗原特异性细胞毒性22。虽然由于继发性TR®等位重排引起的抗原特异性损失是在长期培养后的DP阶段，但可以通过T-iPSCs31中的基因组编辑来克服。 根据我们的经验，hiPSC衍生的DP细胞开始出现在培养的第30-35天，这些新生成的DP细胞尚未经历二次TCR+重排。因此，第35天的大多数DP细胞保留抗原特异性，可用于生成抗原特异性CD8+++SP T细胞。
在人类抗CD3和反CD28刺激之前，CD4-CD8-DN细胞必须从培养基中取出，因为这些细胞已被证明在刺激后导致CD4+CD8+DP细胞直接杀伤。使用CD4磁珠富集（步骤3.10）将丰富DP和CD4+CD8-中间单阳性（ISP）细胞1，我们已经证明没有负面影响22。或者，通过流式细胞测量对荧光激活细胞进行分类，以分离DP细胞。然而，磁珠分离是首选，因为它避免了流动细胞学引起的机械应力。
CD8+++SP T细胞从人类多能干细胞生成，无需活化介导的激动剂选择，随后通过使用3D鼠位细胞培养32来证明。然而，生理阳性选择取决于TCR与自肽-MHC复合物的相互作用，这些复合物由胸腺皮质上皮细胞33进行独特的处理和呈现。此外，TCR对选择肽的亲和力已被证明确定成熟CD8+++SP T细胞34的后续功能。 目前，没有证据表明，基于Notch基质细胞的共培养系统可以提供生理阳性选择所需的定义选择肽和MHC复合物。
此前，在一个小鼠模型中，仅使用OP9/DLL1就从肿瘤抗原特异性T细胞衍生的HiPSCs产生的T系质细胞未能经历常规成熟。然而，由OP9/DLL1系统产生的iPSC衍生的不成熟T细胞可以通过在3D培养系统中进一步进行生理胸腺教育，成熟成天真的T细胞。因此，这里提出的生产由OP9/DLL1系统产生的iPSC衍生的不成熟T细胞的协议对于进一步尝试产生真正的人类肿瘤抗原特异性后胸肌T细胞至关重要，这些细胞能够在体内长期持久。治疗已建立的血管化肿瘤的效率。

除了生理优势，T细胞还有许多潜在的治疗应用。体外T细胞的产生和扩展可用于疾病建模和治疗验证，以及遗传和后天免疫缺陷状态的治疗来源（即病毒免疫缺陷和淋巴性继发性化疗或移植），以及根除癌症。后一种质量已导致采用T细胞转移（ACT）用于治疗晚期癌症患者1的发展。
ACT包括切除病人的肿瘤，提取肿瘤渗透淋巴细胞（TLL），扩大TiLs前体内，然后重新注入扩大的细胞到患者2。它已被证明是一种有效的治疗方式，为一些转移性癌症患者。 不幸的是，并非所有患者都对这种疗法有反应。以前的报告已经表明，转移细胞的分化状态3，4，5，6，7，8，9，使用大数高富集的癌症抗原特异性T细胞10，和持续T细胞转移11，12所有与更持久的反应13，14相关。因此，当ACT未能引起抗肿瘤反应时，部分原因可能是癌症抗原特异性T细胞产量低，低效率的外体扩张导致反应性克隆的耗尽和丧失，或转移后缺乏持久性4.据推测，这些障碍可以通过在体外产生大量分化性较差的癌症抗原特异性T细胞来克服。
造血干细胞/祖细胞（HSPCs）是体外T细胞生成的常规来源，尽管这种方法受到可以从单个供体1中恢复的少量细胞的限制。胚胎干细胞（ESCs）也已被证明能产生T细胞，但产量低17，因此在临床应用中效率很低。此外，由于T系细胞在早期发育阶段经历其T细胞受体（TDR）的随机基因重组，如果不进一步基因组，就不可能使用HSPC或ESCs来生成纯抗原特异性T细胞群修改，如TCR基因转导。
克服这些警告的一种方法是重新编程TILs到人类诱导多能干细胞（hiPSCs），这可能为体外T细胞生成提供无限的来源。已经表明，癌症抗原特异性TILs可以重新编程到hiPSC，并重新分化为T细胞谱系，这保留了与原始T细胞18、19相同的T细胞受体（TCR）基因重新排列。 这个细节对ACT很重要，因为单个患者肿瘤具有独特的突变谱，并且很少癌症抗原被证明在患者之间共享20。因此，利用癌症抗原特异性TiLs作为体外产生hiPSC衍生T细胞的来源，可以为转移性癌症患者的个性化治疗提供一种新的策略。
此处详细介绍了使用 OP9/DLL1 共培养系统将 hiPSC 衍生的 T 系质细胞区分为功能抗原特异性 CD8++单阳性 （SP） T 细胞的协议。该方法是体外T细胞分化的hiPSC，造血祖体，胚胎干细胞，以及其进一步应用于再生医学和基于细胞的治疗的有力工具。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >10 cm dish</td>
			<td >Corning, Inc.&#160;</td>
			<td >353003</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD3, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 561812, RRID:AB_1089628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD34, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >Cat# 348791, RRID:AB_400381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD4, human</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td>Cat# 344612, RRID:AB_2028479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD43, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >Cat# 560198, RRID:AB_1645460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD7, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 555361, RRID:AB_395764</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD8a, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 555369, RRID:AB_398595</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD8b, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >Cat# 641057, RRID:AB_1645747</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-TCRb, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >Cat# 555548, RRID:AB_395932</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD28 human monoclonal antibody (15E8), pure functional grade</td>
			<td >Miltenyl Biotec</td>
			<td>130-093-375</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD3 human monoclonal antibody (OKT3), pure functional grade</td>
			<td >Miltenyl Biotec</td>
			<td>130-093-387</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD4 Microbeads, human</td>
			<td >Miltenyl Biotec</td>
			<td >130-045-101</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell strainer 100 um</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >22-363-549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td >Gemini</td>
			<td >100-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Flt-3 ligand</td>
			<td >R&#38;D Systems</td>
			<td >427-FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gelatin Solution 2%&#160;</td>
			<td>SIGMA-Aldritch</td>
			<td>G1393-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GlutaMAX (100X)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >35050-061</td>
			<td >L-Glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HBSS Mg+Ca+ Phenol-Red Free</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Interleukin-2</td>
			<td >R&#38;D Systems</td>
			<td >202-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Interleukin-7</td>
			<td >R&#38;D Systems</td>
			<td >407-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >iTAG MHC Tetramer HLA-A*0201 Mart1 Tetramer -ELAGIGILTV</td>
			<td >MBL</td>
			<td >Cat#TB-0009-2</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mart1-hiPSC</td>
			<td >Vizcardo et al., Cell Stem Cell 2013</td>
			<td >RIKEN-IMS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Melan-A, MART 1 (26-35)</td>
			<td >InnoPep</td>
			<td >3146-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#945;MEM powder</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >61100061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C57BL/6 MEF MITC-TREATED 4M EACH; A34962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >OP9/N-DLL1</td>
			<td >Riken Bioresource center</td>
			<td >Cat# RCB2927; RRID:CVCL_B220</td>
			<td >OP9/DLL1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/streptomycin</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate buffered saline pH 7.4 (1x)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primate ES Cell Medium</td>
			<td >Reprocell</td>
			<td >RCHEMD001</td>
			<td >Human ESC Culture Media</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rhok inhibitor (Y-27632 dihydrochloride)</td>
			<td >Tocris</td>
			<td >1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RPMI 1640</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td >R&#38;D Systems</td>
			<td >455-MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >StemPro</td>
			<td >EZPassage</td>
			<td >23181-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T2-tumor</td>
			<td >ATCC</td>
			<td>T2 (174 x CEM.T2) (ATCC&#174; CRL-1992&#8482;)&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red&#160;</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red&#160;</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >U Bottom 96 well plate</td>
			<td >Corning, Inc.&#160;</td>
			<td >3799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using human induced pluripotent stem cells for the generation of tumor antigen-specific t cells

功能性T细胞在体外产生和扩展，可带来广泛的临床应用。其中一种用途是治疗晚期癌症患者。高富化肿瘤抗原特异性T细胞的采用T细胞转移（ACT）已被证明在一些患者中引起转移性癌症的持久回归。然而，在扩张过程中，这些细胞可能会耗尽或衰老，从而限制其作用和体内的持久性。诱导多能干细胞（iPSC）技术可以克服这些障碍，导致在体外产生大量分化程度较低的肿瘤抗原特异性T细胞。人类 iPSC （hiPSC） 有能力分化成任何类型的体细胞，包括淋巴细胞，当 T 细胞用作起始细胞时，这些细胞保留原始 T 细胞受体 （TCR） 基因组重排。因此，将人类肿瘤抗原特异性T细胞重新编程为hiPSC，然后再分化为T细胞系具有产生恢复性肿瘤抗原特异性T细胞的潜力。本文介绍的是一种使用OP9/DLL1共培养系统从hiPSC生成肿瘤抗原特异性CD8++单阳性（SP）T细胞的方法。该方法是体外T细胞系生成的有力工具，将促进体外衍生T细胞的发展，用于再生医学和基于细胞的治疗。

13天后hiPSCs与OP9/DLL1共同培养，CD34+CD43+造血祖细胞出现（图1）。在hSCF、hFLT3L和hIL-7的存在下，在非明胶化OP9/DLL1上再培养22天后，造血原代细胞分化成CD3+CD7+CD4+CD4+CD8+双阳性（DP）T系系细胞，其中大多数表示特定于 MART-1 表位 （四联体） 的 TCR （图 2）。
此前已经表明，CD8+ SP T细胞可以通过激动剂肽或抗体驱动的TCR刺激24、25从CD4+CD8+DPT细胞诱导。因此，在培养的第35天，hiPSC衍生的CD4+CD8+DP T细胞在hIL-7和hIL-2的存在下受到抗人CD3和反人类CD28抗体的刺激。 刺激四天后，CD3+CD8+ +SP细胞的数量急剧增加，并且对 MART-1 表位保持特异性，确认其遗传抗原特异性的保存（图3）。
为了确定hiPSC衍生CD8+++SP T细胞的功能特性，分析了干扰素伽马（IFN-+）的抗原依赖性活化和分泌。在用抗人CD3和抗人类CD28抗体刺激1周后，使用细胞分拣机分离出HIPSC衍生CD8++SP T细胞，并与T2细胞系共同培养，表达HLA-A_02：01，带或不带共理MART1肽16-20小时。ELISpot测定表明，当在MART-1肽存在的情况下培养时，hiPSC衍生的CD8+++-SP T细胞分泌的IFN-*与CD8+++和SP T细胞相比，分泌量更高。IFN-α的表达对于T细胞和APC来说是无效的，表明人类T-iPSC衍生的T细胞具有抗原特异性和功能性（图4）。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59997/59997fig1.jpg"> 图1：产生hiPSC衍生造血原细胞。（A） 使用 OP9/DLL1 共文化将 hiPSC 分化为造血系的原理概述。（B） 第 1 天（左上）、3（右上）、7（左下）和 13 日（右下角）出现 hiPSC 派生结构。刻度条 = 100 μm. （C） 在 13 日对 hiPSC 派生 CD34+CD43+造血祖细胞的流量细胞学分析。数据代表六个独立实验（n = 1 到 2）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59997/59997fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59997/59997fig2.jpg"> 图2：hiPSC分化为Mart1+ CD4+CD8++DPT细胞。 （A） 使用OP9/DLL1共培养的hiPSC衍生造血系与未成熟的T细胞分化的原理概述。（B） 第35天，CD4与CD8+、CD3与CD8+和MART-1四元体表达在hiPSC衍生T细胞中的流动细胞学分析。门在淋巴细胞，单细胞，PI阴性。数据代表三个独立实验（n = 3 - 8）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59997/59997fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59997/59997fig3.jpg"> 图3：CD8+++SP T细胞表型诱导。在人抗CD3和人体抗CD28抗体驱动刺激后4天对CD4- hiPSC衍生T细胞进行流细胞分析。门在淋巴细胞，单个细胞，PI负数（n = 4）。  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59997/59997fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59997/59997fig4.jpg"> 图4：hiPSC衍生CD8++SP T细胞的抗原特异性。 IFN-α 分泌通过ELISpot检测的hiPSC衍生CD8++ + SP，CD8+++SP，和散装T细胞后20小时共培养与或不T2细胞脉冲（或不）与MART-1肽。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59997/59997fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>

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Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

本文介绍了一种利用OP9/DLL1共培养系统生成功能性肿瘤抗原特异性诱导多能干细胞衍生CD8++单阳性T细胞的方法。

利用人类诱导多能干细胞生成肿瘤抗原特异性T细胞

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

我们提出了一种利用OP9-Delta-1共培养系统产生人类诱导多能干细胞衍生肿瘤抗原特异性CD8αβ单阳性T细胞的方法。这种方法是体外T细胞生成的有力工具，将促进体外衍生T细胞的发展，用于再生医学和基于细胞的疗法。它也可以适应其他淋巴细胞的产生，如NK细胞。执行此技术时，当细胞对细胞细胞质接触开始防止细胞分化和衰老时，必须一致地预先评估 FBS 和通过 OP9-Delta-1 细胞的很多。演示手术将是梅甘古德博士，一个外科肿瘤学研究员从我的团队。首先在立体显微镜中检查人类 iPSC 菌落，并消除与 200 微升移液器尖端的塑料边缘从培养中区分的任何区域。当菌落达到0.8至1.2毫米的直径，通过人类的psCs。吸气的已花介质，并添加10毫升的人类 iPSC 介质辅以 10 微摩尔 ROCK 抑制剂。将一次性细胞传通工具在一个方向上滚动整个培养皿，确保保持均匀的压力，并且整个滚轮刀片接触培养皿。旋转培养皿 90 度，并重复滚动。用显微镜直观地确认菌落的正确切割。它们应显示为选中。然后，用200微升移液器轻轻的机械冲洗来分离切口菌落。目测地估计成分之块的数量，将350到600团转移到新的10厘米的小鼠胚胎成纤维细胞中，配以10毫升新鲜人类iPSC介质，并辅以 ROCK抑制剂。在37摄氏度下孵育一夜。第二天，吸进已花的介质，并添加10毫升的新鲜人类 iPSC 介质。根据细胞生长速率，每一两天更换一次介质。在37摄氏度的OP9介质中培养OP9-Delta-1细胞。当它们达到汇合时，吸气介质，用5毫升1倍镁、钙和苯酚无红色PBS清洗细胞一次。吸气PBS，加入两毫升05%的三辛-EDTA，并在37摄氏度下孵育细胞5分钟。然后，添加四毫升的OP9介质，通过移液机械分离细胞层。通过100微米细胞过滤器将悬浮液转移到50毫升锥形管中，并在4摄氏度下以300倍g离心5分钟。吸升液，并在OP9介质的12毫升中重新暂停细胞。在每个六个新的细胞培养皿中加入八毫升的OP9培养剂，并将OP9-delta-1细胞悬浮液的两毫升盘盘添加到每个培养皿上。将菜侧对边、从前摇到后面，确保细胞的均匀分布。在37摄氏度下孵育细胞，当细胞达到汇合时重复通过。在与人类 iPSCs 共同培养前一周准备明胶化 OP9-Delta-1 菜肴。在三个新的细胞培养皿中加入四毫升0.1%明胶，并在37摄氏度下孵育30分钟。孵育后，吸明胶，并在每道菜中加入8毫升OP9介质。将 OP9-Delta-1 细胞的一个汇合盘传递到三个明胶涂层的盘。四天后，在每盘细胞中加入10毫升OP9培养剂，每盘共20毫升的介质。在细胞经过7至8天后，开始人类在OP9-Delta-1汇合盘上共同培养。从人类 iPSC 的汇合盘中吸出介质，并添加 10 毫升 OP9 介质。使用一次性细胞传传工具切割和分离细胞菌落，将 350 至 600 团切菌落转移到含有 10 毫升新鲜 OP9 培养基的预凝胶化 OP9-Delta-1 培养皿上。将文化菜并排和正面到背面摇动，以确保殖民地的均匀分布。第二天，吸进已花的介质，代之以20毫升的新鲜OP9介质。在OP9-Delta-1上共同培养的人类 iPSC 团块应显示为小、圆形、单层菌落。第五天，吸气10毫升的已花介质，并添加10毫升的新鲜OP9介质。殖民地将开始分化成原始的中皮，其特点是多层黑暗中心。在第九天重复此过程，此时多层中心结构将演变为圆顶形状。在第13天收获造血前细胞，此时这些结构由一个黑暗的中央器官组成，周围环绕着一个圆顶状区域网络。吸气介质，用5毫升1x苯酚无红汉克斯的平衡盐溶液与钙和镁或HBSS洗涤细胞一次。洗涤后，加入250微升，每毫升5000单位胶原酶IV至10毫升HSSS。将混合物加入细胞中，在37摄氏度下孵育45分钟。吸气HSS-胶原酶混合物，用五毫升PBS洗涤细胞一次。用PBS洗涤后，加入5毫升0.25%的三辛-EDTA，并在37摄氏度下孵育细胞20分钟。然后，添加四毫升的OP9介质，通过移液分离细胞层，使单细胞悬浮。通过100微米过滤器将悬浮液转移到50毫升锥形管中，并在300倍g和4摄氏度下将管离心5分钟。吸上一道，并在OP9介质的10毫升中重新暂停细胞。将细胞悬浮液板在一个新的明胶化10厘米细胞培养盘上，并在37摄氏度下孵育45分钟。然后，通过温和移液收集任何非粘附细胞。将电池悬浮液通过过滤器转移到 50 毫升锥形管中，然后像前面所述的离心机。然后，吸升液，并在10毫升的分化介质中重新暂停细胞。将细胞悬浮板到新的OP9-Delta-1汇合盘上。根据第16天根据手稿指示通过细胞，并在之后每5至7天继续通过非粘附细胞。经过35天的分化，根据制造商的协议，通过CD4磁珠分离来丰富CD4阳性细胞群体。然后，在OP9培养中重新悬浮细胞，将一毫升细胞悬浮液板入组织培养、平底、24井的汇合OP9-Delta-1的每个井中。通过添加100个国际单位的人类IL-2、5纳米的人类IL-7、500纳米的抗人CD3抗体和2微克的抗人CD28抗体来刺激细胞。四到七天后，可以收集细胞作进一步分析。在人类干细胞因子、人类FLT3配体和人类白细胞-7存在的情况下培养非凝胶化OP9-Delta-1后，造血干细胞分化成CD3、CD7、CD4和CD8双阳性T系细胞，其中大多数表示M细胞受体特异性MART1表皮。当CD4、CD8双阳性T细胞在人际白细胞-7和2存在的情况下用抗人CD3和CD28抗体刺激时，CD3阳性CD8αβ单阳性细胞的数量增加，并且仍然特定于MART1表位，确认其遗传抗原特异性的保存。ELISpot测定显示，当在MART1肽存在的情况下培养时，与散装细胞和CD8α阿尔法单阳性T细胞相比，人类ipSC衍生的CD8β单阳性T细胞分泌更多的干扰素伽马。未检测到T细胞和抗原呈现细胞的干扰素伽马表达，表明人类T-iPSC衍生T细胞具有抗原特异性和功能。这种方法的一个重要步骤是CD4磁珠富集，以消除CD4阴性，CD8阴性双阴性细胞，这可能会导致刺激时直接杀死双阳性细胞。该技术适用于多种人类细胞来源，包括造血干细胞和胚胎干细胞。该方法产生的 iPSC 衍生的未成熟 T 细胞可进一步改进，用于生成成熟人类肿瘤抗原特异性天真类 T 细胞，供将来治疗使用。观看此视频后，观看者应了解如何使用 OP9-Delta-1 共培养系统生成人类 iPSC 衍生 CD8 alpha β 单阳性 T 细胞。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

应用 Fraumeni 综合征诱导多潜能干细胞建模骨肉瘤

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

科研

癌症研究

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

生成毛因诱导多能干细胞衍生的肿瘤抗原特异性胸腺移民的三维胸腺培养系统

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

cd8+ t 细胞诱导体外肿瘤细胞凋亡的实时检测--研究肿瘤浸润髓内细胞的免疫抑制作用

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

制造用于采用免疫疗法的奇美抗原受体（CAR）T细胞

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment

细胞毒性细胞因子诱导的杀伤性T细胞的分离和扩张，用于癌症治疗

Adoptive cellular immunotherapy focuses on restoring cancer recognition via the immune system and improves effective tumor cell killing. Cytokine-induced ...

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

靶性抗原特异性治疗抗体的肿瘤及组织分布分析

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

肿瘤细胞外侧尾静脉注射后肺转移的病理分析

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis

斑马鱼拉瓦尔异种草和肿瘤行为分析的一代

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly ...

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

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肿瘤移植用于评估小鼠肿瘤浸润CD8 + T细胞的动力学

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

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体内 通过脾T细胞流式细胞术筛选肿瘤来源的细胞外囊泡的免疫原性

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...