Name: using human induced pluripotent stem cells for the generation of tumor antigen-specific t cells
Uploaded: 2019-10-24T13:00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells at JoVE.com

Nous remercions Alan B. Hoofring et Erina H. Il pour l'assistance graphique. Cette recherche a été appuyée par le Programme de recherche intra-muros du National Cancer Institute (ZIA BC010763) et l'Intramural NCI Cancer Cancer Moonshot Initiative for Cell-based Cancer Immunotherapy.

1. Culturing Human iPSCs (hiPSCs) on Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF)
REMARQUE: D'autres méthodes de culture des hiPSC peuvent également être utilisées, y compris, mais sans s'y limiter: l'ensemencement sur une plaque de 6 puits pré-enrobé de gélatine, un mélange de protéines gélatineuses, la lamininine recombinante 511, ou toute autre matrice extracellulaire utilisée dans l'expansion hiPSC, et cultivés à l'aide de médias définis spécialement formulés pour la culture humaine de cellules souches pluripotentes.
<ol><li>
Cultiver LE MEF
	<ol>
<li>Enrober un plat Petri de culture cellulaire de 10 cm de 4 ml de gélatine de 0,1 % et incuber pendant 30 min à 37 oC.</li>
		<li>Décongeler rapidement une fiole de 4 x 106 MEF irradiée en 10 ml de 37 degrés Celsius de media MEF (DMEM - 10 % FBS - 1x pénicilline-streptomycine - 1x Supplément de L-glutamine). Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min à 4 oC. Aspirez le supernatant et suspendez la pastille cellulaire en 9 ml de media MEF.</li>
		<li>Retirer le plat recouvert de gélatine de l'incubateur. Aspirez la gélatine et ajoutez 7 mL de supports MEF. Assiette 3 mL de suspension MEF (à partir de l'étape 1.1.2) sur le plat recouvert de gélatine. Basculer le plat d'un côté à l'autre et d'avant en arrière pour assurer une distribution uniforme de MEF sur le plat. Incuber à 37 oC de 8 à 36 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Passer hiPSC sur LE MEF REMARQUE : Les données ont été générées à l'aide de MART-1 iPSC dérivés du mélanome de culture à long terme TIL, qui reconnaissent spécifiquement le peptide MART-1 dans le contexte de HLA-A-02:01, comme décrit précédemment18.<ol>
<li>Les hiPSC de passage lorsque les colonies ont entre 0,8 et 1,2 mm de diamètre. Avant de passer, vérifiez les colonies hiPSC dans un stéréo-microscope et supprimez toutes les zones de différenciation de la culture à l'aide du bord en plastique d'une pointe de 200 l.</li>
		<li>Aspirate a dépensé les médias et ajouter 10 mL de médias hiPSC (médias de culture ES humains[Tableau des matériaux] - 10 ng/mL facteur de croissance de base du fibroblaste humain [hbFGF]) complété par 10 inhibiteurs ROCK M.</li>
		<li>Tenez le plat de culture cellulaire dans une main et roulez un outil de passaging de cellules jetables à travers le plat entier dans une direction. Appliquer suffisamment de pression pour que la lame de rouleau entière touche le plat de culture et maintenir une pression uniforme pendant l'action de roulement.</li>
		<li>Faites pivoter le plat de culture à 90 degrés et répétez l'étape 1.2.3. Voir la plaque dans le microscope pour confirmer visuellement la coupe appropriée des colonies, qui devrait apparaître à carreaux. Détachez les colonies coupées par un rinçage mécanique doux à l'aide d'une pipette de 200 l. REMARQUE: Le détachement des colonies coupées par rinçage mécanique doit être fait immédiatement après la coupe des colonies avec le rouleau, parce qu'après 3 min les colonies coupées commenceront à se rattacher au plat, et il deviendra difficile de détacher des colonies de taille homogène par rinçage.</li>
		<li>Transférer 350 à 600 amas de colonies coupées sur un nouveau plat de 10 cm de MEF (plaqué 8 à 36 h avant le passage du HIPSC) avec 10 ml de amas hiPSC frais complétés par un inhibiteur de 10 M ROCK. Incuber à 37 oC. REMARQUE : 600 amas représentent environ 1,0 x 106 IPSC MART-1 et donneront 0,5 à 1,0 x 106 cellules DP le jour 35. Cependant, les nombres attendus varieront en fonction de la puissance de la ligne cellulaire de départ et des conditions de culture.</li>
		<li>Le lendemain, aspirez les médias dépensés et ajoutez 10 ml de nouveaux médias hiPSC. Changez les médias hiPSC tous les 1-2 jours en fonction du taux de croissance hiPSC.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Préparation des cellules OP9/DLL1 pour la co-culture avec hiPSCs
<ol><li>Culture Cellules OP9/DLL1 dans les milieux OP9 [milieu essentiel minimum (MEM) - sérum bovin fœtal de 20 % (FBS) et 1x pénicilline-streptomycine] à 37 oC. Lorsque les cellules OP9/DLL1 atteignent la confluence, aspirez les médias et lavez une fois avec 5 ml de 1x magnésium, calcium et phénol phosphate sans rouge salin (PBS).</li>
	<li>Aspirez PBS et ajoutez 2 mL de 0,05 % trypsin-EDTA.  Incuber pendant 5 min à 37 oC. Ensuite, ajoutez 4 mL de support OP9 et dissocier mécaniquement la couche cellulaire par pipetting pour faire une suspension à une cellule.</li>
	<li>Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 ml à travers une passoire cellulaire de 100 m pour éviter les amas cellulaires. Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min à 4 oC. Aspirer le supernatant et resuspendre dans 12 mL de médias OP9.</li>
	<li>Ajouter 8 mL de support OP9 à chacun des six nouveaux plats Petri de culture cellulaire de 10 cm. Plaque 2 mL de suspension de cellules OP9/DLL1 à partir de l'étape 2.3 sur chaque nouveau plat de 10 cm. Basculer le plat d'un côté à l'autre, puis d'avant en arrière pour assurer une distribution uniforme de L'OP9/DLL1 sur le plat.</li>
	<li>Incuber à 37 oC. Répétez le passage tous les 2 à 3 jours lorsque les cellules atteignent la confluence. REMARQUE: Il est important de faire suffisamment de bouillon congelé de cellules OP9/DLL1 et de décongeler un nouveau stock toutes les 4-6 semaines.</li>
</ol>3. Différenciation in vitro des hiPSCs enCD8MD - Single Positive (SP) T Cells
<ol><li>Préparer des plats OP9/DLL1 gélatinisés une semaine avant la co-culture avec les hiPSC. Pour préparer une solution de gélatine de 0,1 %, ajouter 5 ml de solution de gélatine de teneur tissulaire à 500 ml de PBS.
	<ol>
<li>Enrober 3 nouveaux plats Petri de culture cellulaire de 10 cm en ajoutant 4 ml par plat de gélatine de 0,1 %.  Incuber 30 min à 37 oC.</li>
		<li>Aspirez la gélatine et ajoutez 8 ml de support OP9 à chaque plat. Passer un plat confluent d'OP9/DLL1 (comme c'est le cas dans la section 2 ci-dessus) à trois plats pré-enrobés de gélatine.</li>
	</ol></li>
	<li>Après 4 jours, ajouter 10 ml de support OP9 à chaque plat de 10 cm d'OP9/DLL1 sur gélatine, pour un total de 20 ml de support par plat.</li>
	<li>Après 7 à 8 jours, commencez la co-culture hiPSC sur les plats de confluent OP9/DLL1 (différenciation jour 0).
	<ol>
<li>Aspirate a passé les médias à partir de 10 cm de plat de hiPSCs sur MEF. Ajouter 10 mL de supports OP9. Couper et détacher les colonies hiPSC à l'aide d'un outil de passaging cellulaire jetable comme cela se fait dans les étapes 1.2.3 et 1.2.4.</li>
		<li>Transférer 350 à 600 amas de colonies coupées sur un plat OP9/DLL1 prégélatinisé de 10 cm (étape 3.1) avec 10 ml de supports OP9 frais à l'aide d'une pipette de 200 lL. Rock le plat de culture d'un côté à l'autre, puis d'avant en arrière pour assurer une distribution uniforme des colonies. REMARQUE : Alternativement, des corps embryonnaires hiPSC préformés (EB) ou une petite suspension à touffe peuvent être utilisés.  Cependant, l'utilisation d'un outil jetable de passaging de cellules ou d'un système de formation d'EB est préférée pour produire des amas de hiPSC de taille uniforme.</li>
	</ol></li>
	<li>Le jour 1, aspirez les médias dépensés et remplacez par 20 ml de nouveaux médias OP9. les amas hiPSC co-cultivés sur OP9/DLL1 pendant 1 jour apparaîtront comme de petites colonies rondes de monocouches (figure 1).</li>
	<li>Le jour 5, aspirez 10 ml de supports usés et ajoutez 10 ml de nouveaux médias OP9. les colonies hiPSC commenceront à se différencier en mesoderm primitif, qui se caractérise par un centre sombre multicouches.</li>
	<li>Le jour 9, aspirez 10 ml de supports usés et ajoutez 10 ml de nouveaux médias OP9. À ce stade, les structures de centre multicouches évolueront en formes en forme de dôme, et une zone périphérique en forme de réseau commencera à devenir évidente.</li>
	<li>Le jour 13, récoltez les cellules hématopoïétiques progénitrices (CHP) (figure 1). Les structures dérivées de hiPSC le jour 13 sont caractérisées par un organoïde central foncé entouré d'un réseau de zones en forme de dôme, représentatif des zones hématopoïétiques (HZ) précédemment rapportées pour enfermer les progéniteurs hématopoïétiques dérivés de cellules souches embryonnaires humaines 21. REMARQUE : La présence des structures en forme de dôme indique un processus réussi même en l'absence de centres sombres. L'incapacité de produire des HPC peut être due à la mauvaise qualité de l'OP9/DLL1, à la qualité du lot FBS, à la confluration des amas iPSC ensemencés sur OP9/DLL1 (350-600 amas est optimal), et/ou à des variations dans la puissance des lignes iPSC pour produire des précurseurs hématopoïétiques.<ol>
<li>Aspirate a passé le média et laver 1x avec 5 ml de 1x phenol rouge-libre Hanks' solution de sel équilibrée modifiée avec du calcium et du magnésium (HBSS).</li>
		<li>Aspirez HBSS et ajoutez 250 l de 5000 unités/mL de collagène IV en 10 mL de HBSS. Incuber à 37 oC pendant 45 min. Aspirate HBSS avec collagène IV et laver une fois avec 5 ml de PBS.</li>
		<li>Aspirez PBS et ajoutez 5 ml de 0,25% Trypsin-EDTA. Incuber à 37 oC pendant 20 min. Ensuite, ajoutez 4 mL de support OP9 et dissocier la couche cellulaire par pipetting pour faire une suspension à une cellule.</li>
		<li>Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 ml à travers une passoire cellulaire de 100 m.  Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min à 4 oC. Aspirer le supernatant et resuspendre dans 10 mL de médias OP9.</li>
		<li>Suspension des cellules de plaque sur un nouveau plat Petri gélatinisé de 10 cm de culture cellulaire (voir les étapes 3.1.1 et 3.1.2). Incuber à 37 oC pendant 45 min. Ensuite, recueillir les cellules non adhérentes par pipetage doux.</li>
		<li>Transférer la suspension des cellules collectées dans un tube conique de 50 ml à travers une passoire cellulaire de 100 m.  Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min à 4 oC. Aspirez le supernatant et resuspend dans 10 mL de médias de différenciation [OP9 médias avec 5 ng/mL facteur de cellules souches humaines (hSCF), 5 ng/mL humain Flt3 ligand (hFLT3L), et 5 ng/mL interleukin humain 7 (hIL-7)].</li>
		<li>Déposer la suspension cellulaire sur un nouveau plat de confluent OP9/DLL1 de 10 cm.</li>
	</ol></li>
	<li>Le jour 16, passage des cellules.
	<ol>
<li>Détachez mécaniquement les cellules non adhérentes par une pipetilisation douce et filtrez à travers une passoire cellulaire de 100 m. Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min à 4 oC. Aspirer le supernatant et resuspendre dans 10 mL de médias de différenciation.</li>
		<li>Déposer la suspension cellulaire sur un nouveau plat de confluent OP9/DLL1 de 10 cm.</li>
	</ol></li>
	<li>Continuer à transmettre les cellules non adhérentes tous les 5-7 jours par la suite en répétant l'étape 3.8.</li>
	<li>Le jour 35, enrichissez la population de CD4etde CD8et stimulez la production de cellules CD8MDet SP T (figure 2).
	<ol>
<li>Détachez mécaniquement les cellules non adhérentes par une pipetilisation douce et filtrez à travers une passoire cellulaire de 100 m pour enlever les amas cellulaires. Enrichir la population de cD4et de cellules par l'isolement de perles magnétiques CD4 selon le protocole du fabricant. REMARQUE: La raison d'être de l'utilisation de perles magnétiques CD4 est d'enlever CD4-CD8- cellules DN de la culture, car ceux-ci ont été démontrés pour causer l'abattage direct de CD4-CD8- cellules DP après stimulation22.</li>
		<li>Comptez les cellules enrichies de CD4 en direct à l'aide d'un hémocytomètre Neubauer et d'un colorant bleu Trypan.  Suspendre dans les médias OP9 à concentration totale de 0,5 x 106 cellules/mL. Aliquot 1 ml de la suspension cellulaire (0,5 x 106 cellules) dans chaque puits d'une culture tissulaire à fond plat 24 plaque de puits de confluent OP9/DLL1.</li>
		<li>Ajoutez 100 interleukines humaines IU 2 (hIL-2), 5 ng/mL hIL-7, 500 ng/mL anticorps anti-humains CD3, et 2 anticorps cD28 anti-humains, puis la culture à 37 oC.</li>
		<li>Le jour 4 - 7 après la stimulation, recueillir des cellules pour l'analyse moléculaire (Figure 3) ou la co-culture avec des cellules de présentation d'antigènes pulsés au peptide (APC).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Mesurer la spécificité de l'antigène des cellules CD8 MDDD dérivées de hiPSC
REMARQUE: Le type d'APC à utiliser pour cette experiement dépend de la restriction MHC des lymphocytes T dérivés de hiPSC. Ici, la lignée cellulaire T2 est utilisée, qui est un hybride de lignées lymphoblastoïdes T et B. Les cellules T2 expriment HLA-A-02:0123, qui est reconnu par les cellules JKF6 à partir de laquelle MART1-iPSC a été dérivé18. Cette lignée cellulaire T2 peut être élargie en RPMI 1640 - 20% FBS - 1x pénicilline-streptomycine et est adoptée lorsque les cellules atteignent une densité de 5 x 105 cellules/mL.
<ol><li>Comptez en direct HLA-A-02:01- T-B cellules lymphoblastoïdes hybrides T2 à l'aide d'un hémocytomètre Neubauer et Trypan colorant bleu. Incuber les APC dans 24 plaques de culture de tissus de puits avec 1 peptide MART-1 de 1 g/mL pendant 2 h à 37 oC. REMARQUE: La concentration optimale de peptides est variable, selon la ligne cellulaire et la spécificité de l'antigène.</li>
	<li>Recueillir les APC et laver 2x avec 10 ml de PBS pour enlever tout peptide supplémentaire.</li>
	<li>Comptez les APC et suspendez-les à 2 à 5 x 105 cellules/mL dans les médias OP9 avec 100 UI IL-2 et 5 ng/mL IL-7. Aliquot 100 l de suspension cellulaire (2-5 x 104 cellules) dans chaque puits d'une plaque de puits U 96 très faible ou directement dans une plaque ELISpot pré-enduite.</li>
	<li>Trier les cellules CD8MD dérivées de hiPSC (1 semaine après la stimulation antihumaine des anticorps CD3/CD28) à l'aide d'un trieur cellulaire et suspendre à 1 x 106 cellules/mL dans les médias OP9 avec 100 IU IL-2 et 5 ng/mL IL-7. Aliquot 100 l de suspension cellulaire (1 x 105 cellules) dans chaque puits d'APC et de culture pendant 16 à 20 h à 37 oC.</li>
	<li>Après 16 - 20 h, analyser le profil de sécrétion de cytokine par eliSpot analyse selon le protocole du fabricant (Figure 4).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brauer, P. M., Singh, J., Xhiku, S., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cell+Genesis:+In+Vitro+Veritas+Est.">T Cell Genesis: In Vitro Veritas Est.</a> Trends in Immunology. 37 (12), 889-901 (2016).</li><li>Rosenberg, S. A., Restifo, N. 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Les auteurs n'ont pas de divulgations.

La co-culture des cellules stromales murines OP9 est un système bien établi pour la génération in vitro de lymphocytes (c.-à-d., NK, B, et lymphocytes T) des HSPC et des cellules souches pluripotentes. La signalisation d'entaille est exigée pour induire l'engagement de lignée de T et peut être accomplie par l'expression ectopique de Ligand dL1 ou DLL4 de Notch, qui ont l'efficacité comparable pour la génération de cellule T1. Par conséquent, le système de co-culture OP9/DLL1 est devenu une méthode largement utilisée pour produire des lymphocytes T in vitro.  En outre, cette méthode est applicable pour une utilisation avec plusieurs types et sources de cellules humaines, y compris le sang de cordon, la moelle osseuse HSPc et ESC.  Cependant, la génération de lymphocytes T à partir de ces sources est limitée soit par une récupération insuffisante des cellules sources, soit par une différenciation inefficace des lymphocytes T1. En outre, un produit de cellule T avec une seule recombinaison TCR ne peut pas être généré à partir de ces sources de répertoire ouvert. En utilisant des techniques de médecine régénérative, à savoir la technologie induite des cellules souches pluripotentes (iPSC), il peut être possible de produire un nombre massif de lymphocytes T spécifiques à l'antigène pour une utilisation dans la thérapeutique à base cellulaire15.
les HIPSC sont semblables aux ESC pluripotents dans leur capacité pour l'auto-renouvellement, l'expansion illimitée, et le potentiel de différencier à n'importe quel type de cellule somatique dans le corps ; cependant, ils n'ont pas les préoccupations éthiques entourant l'utilisation de produits d'origine embryonnaire pour des applications cliniques. En outre, les hiPSC peuvent être produits à partir de n'importe quelle cellule somatique, permettant le développement de produits cellulaires pour la médecine personnalisée. Dans les rapports précédents, les hiPSCont ont été produits à partir de lymphocytes T humains utilisant des cellules mononucléaires périphériques entières, descellules CD3, ou des lymphocytes T cytotoxiques isolés (CTL) comme source18,19,22, 26. Lorsque les hiPSC sont générés à partir d'une source de lymphocytes T (T-iPSC), le réarrangement génétique TCR original est héréditaire. Par conséquent, les lymphocytes T t t t dérivés de T-iPSC patients peuvent fournir un modèle pour le traitement personnalisé d'ACT en ciblant les antigènes distincts de cancer d'un patient.
La différenciation des cellules souches pluripotentes humaines en cellules de lignée T est divisée en deux étapes : la génération de cellules progénitrices hématopoïétiques (CHP)27 et leur différenciation en cellules de lignée T21. Les deux étapes peuvent être accomplies à l'aide du système de co-culture OP9/DLL1. Fait important, la qualité des cellules d'alimentation OP9/DLL1 est essentielle au succès de la différenciation des lymphocytes T. Puisque les cellules OP9/DLL1 ne sont pas une lignée cellulaire homogène immortalisée, la qualité du FBS et des conditions de culture est essentielle au maintien de leur expansion sans perdre la capacité de soutenir la différenciation hiPSC. Par conséquent, il est recommandé de pré-évaluer le sort de FBS et le passage de façon cohérente lorsque le contact cytoplasmique de cellule à cellule commence à se produire, afin d'empêcher la différenciation cellulaire et la sénescence. Un point à prendre en considération est que le contact de cellule à cellule peut sembler indiscernable de l'arrière-plan en fonction du contraste de phase et du grossissement du microscope. D'après notre expérience, la plupart des plats OP9/DLL1 semblent être des confluents à 80 % lorsqu'ils sont prêts à être adoptés.
Il a été démontré que les cellules de lignée T redifférenciées générées à partir des T-iPSC par la co-culture OP9/DLL1 peuvent produire des cellules CD8et SP T à la stimulation18,19. Cependant, les cellules CD8et SP T régénérées acquièrent le CD8 inné-comme homodimer22,28, qui est un co-récepteur inefficace pour la signalisation TCR29.  En outre, ces cellules Régénérées CD8et SP T ont montré une cytotoxicité tCR-indépendante forte, rendant ces cellules défavorables pour l'usage clinique30. Ce protocole décrit une méthode récente impliquant la stimulation des cellules CD4purifiées deCD4 et de DP pour produire des cellules CD8MD- SP T avec un phénotype plus conventionnel et une cytotoxicité antigène-spécifique améliorée22. Bien que la perte de spécificité de l'antigène due à la réarrangement allélique TCR secondaire se produise dans le stade DP après une culture prolongée à long terme, cela peut être surmonté par l'édition du génome dans T-iPSCs31.  D'après notre expérience, les cellules DP dérivées de hiPSC commencent à apparaître au jour 30 - 35 de la culture, et ces cellules DP nouvellement générées n'ont pas encore subi de réarrangement secondaire de TCRMD. Par conséquent, la plupart des cellules DP le jour 35 conservent la spécificité de l'antigène et peuvent être utilisées pour générer des cellules CD8MDST spécifiques à l'antigène.
Avant la stimulation humaine anti-CD3 et anti-CD28 le jour 35, CD4-CD8- Les cellules DN doivent être retirées de la culture, car il a été démontré qu'elles causent l'abattage direct des cellules CD4etCD8 après stimulation22. L'utilisation de l'enrichissement de perles magnétiques CD4 (étape 3.10) s'enrichira pour les deux DP et CD4-CD8- intermédiaires unique positif (ISP) cellules1, dont il a été montré qu'il n'a pas d'effets négatifs22. Alternativement, le tri des cellules activée par fluorescence par cytométrie d'écoulement peut être effectué pour isoler les cellules DP. Cependant, la séparation magnétique de perle est préférée car elle évite le stress mécanique induit par la cytométrie d'écoulement.
La génération de lymphocytes TCD8MD-SP à partir de cellules souches pluripotentes humaines sans sélection agoniste à médiation activation a par la suite été démontrée par l'utilisation de la culture stromale stromale murine3D 32. Cependant, la sélection positive physiologique dépend de l'interaction de TCR avec les complexes d'auto-peptide-MHC, qui sont traités de façon unique et présentés par les cellules épithéliales corticales thymiques33. En outre, l'affinité de TCR pour des peptides de sélection a été montrée pour déterminer les capacités fonctionnelles suivantes des cellules mûres deCD8MD - SP T34.  À l'heure actuelle, rien n'indique qu'un système de coculture à base de cellules stromales Notch puisse fournir le peptide de sélection défini et le complexe MHC requis pour la sélection physiologique positive.
Il a été précédemment rapporté dans un modèle de murine que les cellules de lignée de T produites des hiPSCts T-dérivés d'antigène-spécifiques de tumeur utilisant OP9/DLL1 seuls ne parviennent pas à éprouver la maturation conventionnelle. Cependant, les lymphocytes T immatures dérivés de l'iPSC générés par le système OP9/DLL1 peuvent mûrir en lymphocytes T naïfs par une éducation thymique physiologique plus poussée dans un système de culture 3D 28,35. Par conséquent, le protocole présenté ici pour produire des lymphocytes T immatures dérivés de l'iPSC générés par le système OP9/DLL1 est essentiel pour d'autres tentatives de générer de véritables cellules T post-thymiques post-thymiques spécifiques à l'antigène humain capables de la persistance in vivo à long terme avec l'efficacité pour traiter les tumeurs vascularisées établies.

En plus des avantages physiologiques, les lymphocytes T ont de nombreuses applications thérapeutiques potentielles. La génération et l'expansion des lymphocytes T in vitro peuvent être utilisées pour la modélisation de la maladie et la validation thérapeutique ainsi qu'une source de traitement pour les états d'immunodéficience héréditaire et acquise (c.-à-d. immunodéficiences virales et lymphodeplée secondaire à chimiothérapie ou transplantation) et pour l'éradication du cancer. Cette dernière qualité a conduit au développement du transfert adoptif de lymphocytes T (ACT) pour le traitement des patients atteints d'un cancer avancé1.
ACT consiste à réséquer la tumeur d'un patient, à extraire les lymphocytes infiltrants tutules (TILs), à élargir les TIL ex vivo, puis à réinfuser les cellules élargies dans le patient2. Il s'est avéré être une modalité efficace de traitement pour quelques patients présentant le cancer métastatique.  Malheureusement, tous les patients ne répondent pas à cette thérapie. Les rapports précédents ont montré que l'état de différenciation des cellules transférées3,4,5,6,7,8,9, l'utilisation de grands nombres des cellules T fortement enrichies d'antigène de cancer-spécifiques10,et la persistance des cellules de T après transfert11,12 sont tous corrélés avec des réponses plus durables13,14. Par conséquent, quand l'ACT ne parvient pas à obtenir une réponse antitumorale, il peut en partie être dû à un faible rendement des cellules T antigènes spécifiques au cancer, à l'expansion ex vivo inefficace conduisant à l'épuisement et à la perte de clones réactifs, ou à un manque de persistance après le transfert4 . Il a été postulé que ces obstacles peuvent être surmontés par la génération d'un grand nombre de cellules T moins différenciées spécifiques à l'antigène du cancer in vitro15,16.
Les cellules hématopoïétiques de tige/progénitrice (HSPC) sont une source conventionnelle pour la génération in vitro de cellules T, bien que cette méthode soit limitée par le petit nombre de cellules pouvant être récupérées d'un seul donneur1. Il a également été démontré que les cellules souches embryonnaires (ESC) produisent des lymphocytes T, mais avec un faible rendementde 17,ce qui les rend inefficaces pour des applications cliniques. De plus, étant donné que les cellules de lignée T subissent une recombinaison génétique stochastique de leurs récepteurs des lymphocytes T (TCR) aux premiers stades de développement, il n'est pas possible d'utiliser des HSPC ou des ESC pour générer une population pure de lymphocytes T spécifiques à l'antigène sans modifications comme la transduction des gènes TCR.
Une approche pour surmonter ces mises en garde est de reprogrammer les TIL aux cellules souches pluripotentes induites par l'homme (hiPSCs), qui peuvent fournir une source illimitée pour la génération in vitro de lymphocytes T. Il a été démontré que les TIL spécifiques à l'antigène cancéreux peuvent être reprogrammés en hiPSCs et redifférenciés à la lignée des lymphocytes T, qui conserve le même réarrangement du gène des récepteurs des lymphocytes T (TCR) que la cellule T originale18,19.  Ce détail est important pour ACT parce que les tumeurs individuelles de patient ont des profils mutationnels uniques, et très peu d'antigènes de cancer ont été montrés pour être partagés entre les patients20. Par conséquent, l'utilisation des TIL spécifiques à l'antigène du cancer comme source de génération in vitro de lymphocytes T dérivés de l'hiPSC peut fournir une nouvelle stratégie pour le traitement personnalisé des patients atteints d'un cancer métastatique.
Présenté ici en détail est un protocole pour différencier les cellules de lignée T dérivées de hiPSC en cellules T spécifiques à l'antigène fonctionnelleCD8MD - un seul système de co-culture positive (SP) utilisant le système de co-culture OP9/DLL1. Cette méthode est un outil puissant pour la différenciation in vitro des lymphocytes T des hiPSCs, des progéniteurs hématopoïétiques et des cellules souches embryonnaires, ainsi que leurs autres applications dans la médecine régénérative et les thérapies cellulaires.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >10 cm dish</td>
			<td >Corning, Inc.&#160;</td>
			<td >353003</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD3, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 561812, RRID:AB_1089628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD34, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >Cat# 348791, RRID:AB_400381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD4, human</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td>Cat# 344612, RRID:AB_2028479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD43, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >Cat# 560198, RRID:AB_1645460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD7, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 555361, RRID:AB_395764</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD8a, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 555369, RRID:AB_398595</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD8b, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >Cat# 641057, RRID:AB_1645747</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-TCRb, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >Cat# 555548, RRID:AB_395932</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD28 human monoclonal antibody (15E8), pure functional grade</td>
			<td >Miltenyl Biotec</td>
			<td>130-093-375</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD3 human monoclonal antibody (OKT3), pure functional grade</td>
			<td >Miltenyl Biotec</td>
			<td>130-093-387</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD4 Microbeads, human</td>
			<td >Miltenyl Biotec</td>
			<td >130-045-101</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell strainer 100 um</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >22-363-549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td >Gemini</td>
			<td >100-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Flt-3 ligand</td>
			<td >R&#38;D Systems</td>
			<td >427-FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gelatin Solution 2%&#160;</td>
			<td>SIGMA-Aldritch</td>
			<td>G1393-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GlutaMAX (100X)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >35050-061</td>
			<td >L-Glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HBSS Mg+Ca+ Phenol-Red Free</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Interleukin-2</td>
			<td >R&#38;D Systems</td>
			<td >202-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Interleukin-7</td>
			<td >R&#38;D Systems</td>
			<td >407-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >iTAG MHC Tetramer HLA-A*0201 Mart1 Tetramer -ELAGIGILTV</td>
			<td >MBL</td>
			<td >Cat#TB-0009-2</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mart1-hiPSC</td>
			<td >Vizcardo et al., Cell Stem Cell 2013</td>
			<td >RIKEN-IMS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Melan-A, MART 1 (26-35)</td>
			<td >InnoPep</td>
			<td >3146-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#945;MEM powder</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >61100061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C57BL/6 MEF MITC-TREATED 4M EACH; A34962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >OP9/N-DLL1</td>
			<td >Riken Bioresource center</td>
			<td >Cat# RCB2927; RRID:CVCL_B220</td>
			<td >OP9/DLL1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/streptomycin</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate buffered saline pH 7.4 (1x)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primate ES Cell Medium</td>
			<td >Reprocell</td>
			<td >RCHEMD001</td>
			<td >Human ESC Culture Media</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rhok inhibitor (Y-27632 dihydrochloride)</td>
			<td >Tocris</td>
			<td >1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RPMI 1640</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td >R&#38;D Systems</td>
			<td >455-MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >StemPro</td>
			<td >EZPassage</td>
			<td >23181-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T2-tumor</td>
			<td >ATCC</td>
			<td>T2 (174 x CEM.T2) (ATCC&#174; CRL-1992&#8482;)&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red&#160;</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red&#160;</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >U Bottom 96 well plate</td>
			<td >Corning, Inc.&#160;</td>
			<td >3799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using human induced pluripotent stem cells for the generation of tumor antigen-specific t cells

La génération et l'expansion des lymphocytes T fonctionnels in vitro peuvent conduire à un large éventail d'applications cliniques. Une telle utilisation est pour le traitement des patients atteints d'un cancer avancé. Le transfert adoptif de cellule T (ACT) des cellules T fortement enrichies d'antigène-spécifique de tumeur a été montré pour causer la régression durable du cancer métastatique dans quelques patients. Cependant, pendant l'expansion, ces cellules peuvent devenir épuisées ou sénescentes, limitant leur fonction effectrice et leur persistance in vivo. La technologie induite de cellules souches pluripotentes (iPSC) peut surmonter ces obstacles en menant à la génération in vitro d'un grand nombre de cellules T moins différenciées d'antigène de tumeur-spécifiques. L'iPSC humain (hiPSC) a la capacité de se différencier en n'importe quel type de cellule somatique, y compris les lymphocytes, qui conservent le réarrangement génomique original de récepteur de cellule T (TCR) quand une cellule T est employée comme cellule de départ. Par conséquent, la reprogrammation des cellules T antigène-spécifiques de tumeur humaine à hiPSC suivie de la redifférenciation à la lignée de cellules De a le potentiel de produire les cellules T antigène-spécifiques rajeunies de tumeur. Décrit ici est une méthode pour produire la tumeur antigène-spécifique CD8- unique positif (SP) lymphocytes T de hiPSC utilisant le système de co-culture OP9/DLL1. Cette méthode est un outil puissant pour la génération in vitro de lignée de cellules T et facilitera le développement des lymphocytes T dérivés in vitro pour une utilisation dans la médecine régénérative et les thérapies cellulaires.

Après 13 jours hiPSCs co-culture avec OP9/DLL1, CD34-CD43- cellules progénitricehétopoïétique est apparu (Figure 1). Après 22 jours supplémentaires de culture sur OP9/DLL1 non gélatinisé en présence de hSCF, hFLT3L, et hIL-7, progéniteurs hématopoïétiques différenciés en CD3-CD7-CD4-CD8- double-positive (DP) T cellules de lignée, le majorité de ceux qui ont exprimé tCR spécifique à l'épitope MART-1 (tétramer) (figure 2).
Il a déjà été démontré que les lymphocytes T CD8et SP peuvent être induits à partir de CD4,CD8- DP T cellules par la signalisation TCR par l'intermédiaire de peptide agoniste ou de stimulation TCR à l'anticorps24,25. Par conséquent, le jour 35 de la culture, les cellules CD4dérivéesde hiPSC ont été stimulées avec des anticorps CD3 anti-humains et anti-humains CD28 en présence de hIL-7 et hIL-2.  Quatre jours après la stimulation, le nombre de cellules CD3etCD8MD a augmenté de façon spectaculaire et est demeuré spécifique à l'épitope MART-1, confirmant ainsi la préservation de leur spécificité héréditaire en matière d'antigène (figure 3).
On a analysé les propriétés fonctionnelles des cellules CD8MD, l'activation dépendante de l'antigène et la sécrétion de gamma d'interféron (IFN-MD) dérivées de l'iDEPsC. Après stimulation avec des anticorps CD3 anti-humains Et anti-humains CD28 pendant 1 semaine, les cellules CD8MD dérivées de hiPSC ont été isolées à l'aide d'un trieur cellulaire et co-cultivées avec la lignée cellulaire T2 exprimant HLA-A-02:01 avec ou sans cognate MART1 peptide pendant 16 - 20 h. L'étude ELISpot a révélé que les cellules CD8MDet SP T dérivées de hiPSC sécrètent des quantités plus élevées d'IFN- par rapport aux cellules CD8MDT, lorsqu'elles sont cultivées en présence de peptide MART-1. L'expression IFN-MD était nulle pour les lymphocytes T et les APC seulement, ce qui démontre que les lymphocytes T dérivés du T-iPSC sont spécifiques à l'antigène et fonctionnels (figure 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59997/59997fig1.jpg"> Figure 1: Génération de cellules hématopoïétiques dérivées de hiPSC. (A) Aperçu schématique de la différenciation des hiPSCs à la lignée hématopoïétique utilisant la co-culture OP9/DLL1. (B) Apparition de structures dérivées de hiPSC les jours 1 (en haut à gauche), 3 (en haut à droite), 7 (en bas à gauche) et 13 (en bas à droite). Barres d'échelle de 100 m. (C) Analyse cytométrique de flux des cellules d'ancêtre dérivées de l'hiPSC CD34etCD43le jour 13. Les données sont représentatives de six expériences indépendantes (n '1 à 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59997/59997fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59997/59997fig2.jpg"> Figure 2 : différenciation hiPSC en cellules Mart1et CD4, CD8MDet DP T. (A) Aperçu schématique de la différenciation de la lignée hématopoïétique dérivée de hiPSC aux cellules T immatures utilisant la co-culture OP9/DLL1. (B) Analyse cytométrique de flux de CD4 vs CD8, CD3 vs CD8MD, et mart-1 expression tétramer dans les lymphocytes T dérivés de hiPSC le jour 35. Gated sur les lymphocytes, les cellules simples, PI né gatif. Les données sont représentatives de trois expériences indépendantes (n ' 3 - 8). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59997/59997fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59997/59997fig3.jpg"> Figure 3 : Induction du phénotype des cellules TCD8MD . Analyse cytométrique de flux des cellules T dérivées de l'hiPSC 4 jours après la stimulation humaine anti-CD3 et la stimulation actionnelle anti-CD28 humaine. Gated sur les lymphocytes, les cellules simples, PI négatif (n ' 4).   <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59997/59997fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59997/59997fig4.jpg"> Figure 4: Spécificité antigène des cellules CD8 MDDDd- SP T dérivéesdehiPSC. IFN-Sécrétion par ELISpot assay de HiPSC dérivé CD8MD - SP, CD8MD- SP, et les lymphocytes T en vrac après 20 h co-culture avec ou sans cellules T2 pulsé (ou non) avec mart-1 peptide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59997/59997fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

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Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Cet article décrit une méthode pour produire l'antigène fonctionnel induit par l'antigène-spécifique pluripotent cD8MD- cellules T positives uniques utilisant le système de co-culture D'OP9/DLL1.

Utilisation de cellules souches pluripotentes induites par l'homme pour la génération de lymphocytes T spécifiques à l'antigène tumoral

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Nous présentons une méthode pour générer des cellules T alpha bêta monopositives pluripotentes induites par l’homme en utilisant le système de co-culture OP9-Delta-1. Cette méthode est un outil puissant pour la génération in vitro de cellules T et facilitera le développement de cellules T in vitro pour une utilisation en médecine régénérative et en thérapies cellulaires. Il peut également être adapté pour la génération d’autres lymphocytes, comme les cellules NK.Lors de l’exécution de cette technique, il est important de pré-évaluer le lot de FBS et de passage OP9-Delta-1 cellules de façon cohérente lorsque le contact cytoplasmique cellule à cellule commencent à prévenir la différenciation cellulaire et la sénescence. La démonstration de l’intervention sera le Dr Meghan Good, un chercheur en oncologie chirurgicale de mon équipe. Commencez par vérifier les colonies humaines d’iPSC au microscope stéréo et éliminez toutes les zones de différenciation de la culture avec le bord en plastique d’une pointe de pipette de 200 microlitres.Lorsque les colonies atteignent 0,8 à 1,2 millimètre de diamètre, passer les iPSCs humains. Aspirer les médias usés, et ajouter 10 millilitres de médias iPSC humains complétés par un inhibiteur rock de 10 micromolaires. Roulez un outil de passage de cellules jetables sur l’ensemble du plat dans une direction, en vous assurant de maintenir une pression uniforme et que toute la lame de rouleau touche le plat de culture.Faites pivoter le plat de culture à 90 degrés et répétez le roulement. Confirmez visuellement la bonne coupe des colonies à l’aide d’un microscope. Ils devraient apparaître à la caisse.Ensuite, détachez les colonies coupées par une douce chasse d’eau mécanique avec une pipette de 200 microlitres. Estimer visuellement le nombre d’amas de colonies et transférer entre 350 et 600 touffes dans un nouveau plat de 10 centimètres de fibroblastes embryonnaires de souris avec 10 millilitres de médias iPSC humains frais complétés par un inhibiteur rock. Incuber le plat toute la nuit à 37 degrés Celsius.Le lendemain, aspirez les médias dépensés, et ajoutez 10 millilitres de médias humains frais d’iPSC. Changez les médias tous les un ou deux jours, selon le taux de croissance cellulaire. Culture des cellules OP9-Delta-1 dans les médias OP9 à 37 degrés Celsius.Quand ils atteignent la confluence, aspirent le média, et lavent les cellules une fois avec cinq millilitres de magnésium 1x, calcium, et phénol rouge-libre PBS. Aspirer le PBS, ajouter deux millilitres de 05% trypsine-EDTA, et incuber les cellules pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez quatre millilitres de supports OP9 et dissociez mécaniquement la couche cellulaire par pipetting.Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 millilitres à travers une passoire cellulaire de 100 micromètres et une centrifugeuse à 300 fois g à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Aspirer le supernatant, et resuspendre les cellules en 12 millilitres de médias OP9. Ajoutez huit millilitres de supports OP9 à chacun des six nouveaux plats de culture cellulaire et assiettez deux millilitres de la suspension cellulaire OP9-delta-1 sur chaque plat.Faire basculer le plat d’un côté à l’autre et d’avant en arrière pour assurer une distribution uniforme des cellules. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius, et répéter le passage lorsque les cellules atteignent la confluence. Préparez des plats OP9-Delta-1 gélatineux une semaine avant la co-culture avec les iPSCs humains.Ajouter quatre millilitres de 0,1% de gélatine à trois nouveaux plats de culture cellulaire, et les incuber pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, aspirer la gélatine et ajouter huit millilitres de supports OP9 à chaque plat. Passage d’un plat confluent de cellules OP9-Delta-1 à trois plats recouverts de gélatine.Après quatre jours, ajouter 10 millilitres de supports OP9 à chaque plat de cellules, pour un total de 20 millilitres de médias par plat. Commencez la co-culture de l’iPSC humain sur les plats confluents OP9-Delta-1 sept à huit jours après avoir passé les cellules. Aspirez les médias à partir d’un plat confluent d’iPSCs humains, et ajoutez 10 millilitres de médias OP9.Couper et détacher les colonies cellulaires à l’aide d’un outil de passage cellulaire jetable et transférer de 350 à 600 touffes de colonies coupées sur un plat OP9-Delta-1 prégélatinisé avec 10 millilitres de médias OP9 frais. Rock le plat de culture d’un côté à l’autre et d’avant en arrière pour assurer une distribution uniforme des colonies. Le lendemain, aspirez les médias dépensés et remplacez-les par 20 millilitres de nouveaux médias OP9.Les touffes humaines d’iPSC co-cultivés sur OP9-Delta-1 pendant une journée devraient apparaître comme de petites colonies rondes et monocouches. Le cinquième jour, aspirez 10 millilitres de médias usés et ajoutez 10 millilitres de nouveaux supports OP9. Les colonies commenceront à se différencier en mésoderm primitif, qui se caractérise par un centre sombre à plusieurs superpositions.Répétez ce processus le neuvième jour, à quel moment les structures du centre multicouche évolueront en formes en forme de dôme. Récoltez les cellules progénitrices hématopoïétiques le jour 13, à partir de laquelle les structures sont composées d’un organoïde central foncé entouré d’un réseau de zones en forme de dôme. Aspirez les médias et lavez les cellules une fois avec cinq millilitres de solution de sel équilibré hanks sans phénol sans rouge avec du calcium et du magnésium, ou HBSS.Après le lavage, ajouter 250 microlitres de 5000 unités par millilitre de collagène IV à 10 millilitres de HBSS. Ajouter le mélange aux cellules et les incuber à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes. Aspirez le mélange HBSS-collagène, et lavez les cellules une fois avec cinq millilitres de PBS.Après le lavage avec PBS, ajouter cinq millilitres de 0,25% trypsine-EDTA, et incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Ensuite, ajouter quatre millilitres de supports OP9, et dissocier la couche cellulaire par pipetting pour faire une suspension à cellule unique. Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 millilitres à travers une passoire de 100 micromètres et centrifuger le tube à 300 fois g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.Aspirer le supernatant, et resuspendre les cellules en 10 millilitres de médias OP9. Plaquez la suspension cellulaire sur un nouveau plat de culture cellulaire gélatinel de 10 centimètres et incubez-les à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes. Ensuite, recueillir toutes les cellules non adhérentes par pipetting doux.Transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 millilitres à travers une passoire et une centrifugeuse comme décrit précédemment. Ensuite, aspirez le supernatant, et résuspendez les cellules en 10 millilitres de médias de différenciation. Plaquez la suspension cellulaire sur un nouveau plat confluent OP9-Delta-1.Passez les cellules le jour 16 selon les instructions manuscrites, et continuez à passer les cellules non adhérentes tous les cinq à sept jours par la suite. Après 35 jours de différenciation, enrichir la population de cellules CD4 positives par l’isolement des perles magnétiques CD4 selon le protocole du fabricant. Ensuite, resuspendez les cellules dans les médias OP9, et plaquez un millilitre de suspension cellulaire dans chaque puits d’une culture tissulaire, à fond plat, plaque de 24 puits de confluent OP9-Delta-1.Stimulez les cellules en ajoutant 100 unités internationales d’IL-2 humain, cinq nanogrammes d’anticorps humains IL-7, 500 nanogrammes d’anticorps CD3 anti-humains et deux microgrammes d’anticorps anti-humains CD28 à chaque puits. Après quatre à sept jours, les cellules peuvent être collectées pour une analyse plus approfondie. Après la culture sur OP9-Delta-1 non gélatineux en présence du facteur humain de cellules souches, du FLT3-ligand humain, et de l’interleukin-7 humain, les progéniteurs hématopoïétiques se sont différenciés en CD3, CD7, CD4, et cd8 cellules doubles-positives de lignée de T, dont la majorité a exprimé des récepteurs de cellule T spécifiques à l’épitope de MART1.Lorsque les lymphocytes T CD4, CD8 double-positifs ont été stimulés avec des anticorps anti-humains CD3 et CD28 en présence d’interleukine humaine-7 et 2, le nombre de cellules CD3-positives cd8 alpha bêta mono-positive a augmenté et est resté spécifique pour l’épitope MART1, confirmant la préservation de leur spécificité héréditaire d’antigène. Un test ELISpot a révélé que lorsqu’elles sont cultivés en présence de peptide MART1, les lymphocytes T alpha bêta positifs d’iPSC sécrètent des quantités plus élevées d’interféron gamma par rapport aux lymphocytes T alpha alpha en vrac et en CD8 alpha. Aucune expression gamma d’interféron n’a été détectée pour les cellules T et les cellules présentant des antigènes seules, démontrant que les cellules T-iPSC-dérivées humaines sont antigène-spécifiques et fonctionnelles.Une étape importante dans cette méthode est l’enrichissement magnétique de perle de CD4 pour éliminer les cellules double-négatives cd8-négatives de CD4-négatives, qui peuvent causer la mise à mort directe des cellules double-positives sur la stimulation. Cette technique est applicable pour une utilisation avec plusieurs sources de cellules humaines, y compris les cellules souches hématopoïétiques et les cellules souches embryonnaires. Les cellules T immatures dérivées de l’iPSC générées par cette méthode pourraient être encore améliorées pour la génération de cellules T naïves spécifiques aux antigènes tumorales humaines matures pour un usage thérapeutique futur.Après avoir regardé cette vidéo, le spectateur doit comprendre comment générer des lymphocytes T alpha bêta-positifs CD8 dérivés de l’iPSC à l’aide du système de co-culture OP9-Delta-1.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Ostéosarcome utilisant le Syndrome de Li-Fraumeni cellules souches de pluripotentes induites Patient dérivé de modélisation

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Recherche

Recherche en cancérologie

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

Un système de culture thymique tridimensionnel pour générer murine induite Pluripotent Stem Cell-dérivé Des émigrants thymiques spécifiques à l'antigène

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Détection en temps réel de dans l’apoptose des cellules tumorales in Vitro induite par CD8+ T Cells pour étudier les fonctions immunitaires de suppresseurs de tumeur-infiltration de cellules myéloïdes

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Fabrication de cellules T de récepteur d'antigène chimérique (CAR) pour l'immunothérapie adoptive

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment

Isolement et expansion des cellules T tueuses cytotoxiques induites par Cytokine pour le traitement du cancer

Adoptive cellular immunotherapy focuses on restoring cancer recognition via the immune system and improves effective tumor cell killing. Cytokine-induced ...

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Analyse de la distribution des tumeurs et des tissus de l’anticorps thérapeutique spécifique à l’antigène cible

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Analyse pathologique des métastases pulmonaires après injection latérale de cellules tumorales dans la veine caudale

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis

Génération de xénogreffes larvaires de poisson zèbre et analyse du comportement tumoral

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly ...

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Transplantation tumorale pour évaluer la dynamique des lymphocytes T CD8+ infiltrant la tumeur chez la souris

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In vivo Dépistage de l’immunogénicité des vésicules extracellulaires dérivées de tumeurs par cytométrie en flux de lymphocytes T spléniques

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...