Name: using human induced pluripotent stem cells for the generation of tumor antigen-specific t cells
Uploaded: 2019-10-24T13:00:00
Duration: 10 min 57 s
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Wir danken Alan B. Hoofring und Erina H. Er für grafische Unterstützung. Diese Forschung wurde durch das Intramural Research Program des National Cancer Institute (ZIA BC010763) und die Intramural NCI Cancer Moonshot Initiative for Cell-based Cancer Immunotherapy unterstützt.

1. Culturing Human iPSCs (hiPSCs) auf Maus embryonalen Fibroblasten (MEF)
HINWEIS: Alternative Methoden zur Kultivierung von HiPSCs können auch verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf: Aussaat auf einer 6-Well-Platte, die mit Gelatine vorbeschichtet ist, einer gelatinösen Proteinmischung, rekombinantem Laminin 511 oder einer anderen extrazellulären Matrix, die bei der HiPSC-Erweiterung verwendet wird, und mit definierten Medien kultiviert, die speziell für die menschliche pluripotente Stammzellkultur formuliert wurden.
<ol><li>
Culturing MEF
	<ol>
<li>Eine 10 cm Zellkultur Petrischale mit 4 ml 0,1% Gelatine beschichten und 30 min bei 37 °C inkubieren.</li>
		<li>Eine Durchstechflasche mit 4 x 106 bestrahltem MEF schnell in 10 ml 37 °C MEF-Medien (DMEM + 10% FBS + 1x Penicillin-Streptomycin + 1x L-Glutamin-Ergänzung) auftauen. Zentrifuge bei 300 x g für 5 min bei 4 °C. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in 9 ml MEF-Medien wieder aus.</li>
		<li>Entfernen Sie die mit Gelatine beschichtete Schale aus dem Inkubator. Anspirieren Sie Gelatine und fügen Sie 7 ml MEF-Medien hinzu. Platte 3 ml MEF Suspension (ab Schritt 1.1.2) auf die gelatinebeschichtete Schale. Rockdien Sie die Schale nebeneinander und von vorne nach hinten, um eine gleichmäßige Verteilung von MEF über das Gericht zu gewährleisten. Bei 37 °C für 8-36 h inkubieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Passaging hiPSC auf MEF HINWEIS: Die Daten wurden mit MART-1 iPSC aus dem Langzeitkulturmelanom TIL generiert, das MART-1-Peptid im Kontext von HLA-A*02:01, wie zuvor beschrieben18,spezifisch erkennt.<ol>
<li>Passage hiPSCs, wenn Kolonien zwischen 0,8 - 1,2 mm im Durchmesser sind. Überprüfen Sie vor dem Passieren hiPSC-Kolonien in einem Stereomikroskop und entfernen Sie alle Bereiche der Differenzierung von der Kultur mit der Kunststoffkante einer 200-L-Spitze.</li>
		<li>Aspirat verbrauchte Medien und fügen Sie 10 ml hiPSC Medien (menschliche ES-Kulturmedien [Tabelle der Materialien] + 10 ng/ml menschlichen grundlegenden Fibroblasten-Wachstumsfaktor [hbFGF]) mit 10 'M ROCK-Hemmer.</li>
		<li>Halten Sie die Zellkulturschale in einer Hand und rollen Sie ein Einweg-Zell-Passaging-Werkzeug über die gesamte Schale in eine Richtung. Tragen Sie genügend Druck auf, damit die gesamte Walzenklinge die Kulturschale berührt und während der Walzaktion einen gleichmäßigen Druck aufrecht erhält.</li>
		<li>Drehen Sie die Kulturschale um 90° und wiederholen Sie Schritt 1.2.3. Sehen Sie sich die Platte im Mikroskop an, um das richtige Schneiden der Kolonien, die kariert erscheinen sollten, visuell zu bestätigen. Trennen Sie Kolonien durch sanfte mechanische Spülung mit einer 200-L-Pipette. HINWEIS: Die Ablösung der geschnittenen Kolonien durch mechanische Spülung muss unmittelbar nach dem Schneiden der Kolonien mit der Walze erfolgen, denn nach 3 min beginnen die geschnittenen Kolonien wieder an der Schale zu befestigen, und es wird schwierig werden, Kolonien von homogener Größe durch Spülen zu lösen.</li>
		<li>Übertragen Sie 350 - 600 Klumpen geschnittener Kolonien auf eine neue 10 cm Schale MEF (vergoldet 8 - 36 h vor hiPSC-Passaging) mit 10 ml frischen hiPSC-Medien, ergänzt mit 10 M ROCK-Hemmern. Bei 37 °C inkubieren. HINWEIS: 600 Klumpen stellen ungefähr 1,0 x 106 MART-1 iPSC dar und ergeben 0,5-1,0 x 106 DP-Zellen an Tag 35. Die erwarteten Zahlen variieren jedoch je nach Potenz der Startzellenlinie und den Kulturbedingungen.</li>
		<li>Am nächsten Tag, Aspirat verbrachte Medien und fügen Sie 10 ml frische hiPSC Medien. Ändern Sie hiPSC-Medien alle 1-2 Tage, abhängig von der hiPSC-Wachstumsrate.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Vorbereitung von OP9/DLL1-Zellen für die Co-Kultur mit HiPSCs
<ol><li>Kultur OP9/DLL1-Zellen in OP9-Medien [-Minimum essential medium ('-MEM) + 20% fetales Rinderserum (FBS) + 1x Penicillin-Streptomycin] bei 37 °C. Wenn OP9/DLL1-Zellen die Koninfluenza erreichen, aspirieren Medien und waschen einmal mit 5 ml 1x Magnesium, Calcium und Phenol rot-freier Phosphat gepufferte Saline (PBS).</li>
	<li>Aspirieren PbS und fügen Sie 2 ml von 0.05% Trypsin-EDTA.  5 min bei 37 °C inkubieren. Fügen Sie dann 4 ml OP9-Medien hinzu und distanzieren Sie die Zellschicht mechanisch durch Pipettieren, um eine einzellige Suspension zu machen.</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellsuspension durch ein 100 m Zellsieb in ein 50 ml konisches Rohr, um Zellklumpen zu vermeiden. Zentrifuge bei 300 x g für 5 min bei 4 °C. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie in 12 ml OP9-Medien.</li>
	<li>Fügen Sie 8 ml OP9-Medien zu jedem der sechs neuen 10 cm Zellkultur Petrischalen hinzu. Platte 2 ml OP9/DLL1 Zellsuspension ab Schritt 2.3 auf jede neue 10 cm Schale. Rockdien Sie die Schale von Seite zu Seite und dann von vorne nach hinten, um eine gleichmäßige Verteilung von OP9/DLL1 über die Schale zu gewährleisten.</li>
	<li>Bei 37 °C inkubieren. Wiederholen Sie die Passage alle 2 - 3 Tage, wenn Zellen die Koninfluenza erreichen. HINWEIS: Es ist wichtig, genügend gefrorene Bestände an OP9/DLL1-Zellen zu machen und alle 4-6 Wochen einen neuen Bestand aufzutauen.</li>
</ol>3. In Vitro Differenzierung von hiPSCs inCD8- + Single Positive (SP) T-Zellen
<ol><li>Bereiten Sie gelatinierte OP9/DLL1 Gerichte eine Woche vor der Co-Kultur mit hiPSCs zu. Um 0,1% Gelatinelösung vorzubereiten, fügen Sie 5 ml Raumtemperatur (RT) Gewebe-Grade-Stammgelatinelösung zu 500 ml PBS hinzu.
	<ol>
<li>Mantel 3 neue 10 cm Zellkultur Petrischalen durch Zugabe von 4 ml pro Gericht von 0,1% Gelatine.  30 min bei 37 °C inkubieren.</li>
		<li>Anspirieren Sie Gelatine und fügen Sie 8 ml OP9-Medien zu jedem Gericht hinzu. Durchgang eine konfluente Schale von OP9/DLL1 (wie in Abschnitt 2 oben) zu drei gelatinevorbeschichteten Gerichten.</li>
	</ol></li>
	<li>Nach 4 Tagen 10 ml OP9-Medien zu jeder 10 cm Schale OP9/DLL1 auf Gelatine hinzufügen, für insgesamt 20 ml Medien pro Schale.</li>
	<li>Nach 7 - 8 Tagen beginnen Sie die hiPSC-Kokultur auf OP9/DLL1 Konfluent-Gerichten (Differenzierungstag 0).
	<ol>
<li>Aspirate verbrauchtE Medien aus konfluenten 10 cm Schale von hiPSCs auf MEF. Fügen Sie 10 ml OP9-Medien hinzu. Schneiden und lösen Sie hiPSC-Kolonien mit einem Einweg-Zell-Passaging-Tool, wie in den Schritten 1.2.3 und 1.2.4 getan.</li>
		<li>350 - 600 Klumpen geschnittener Kolonien auf eine 10 cm vorgelatinierte OP9/DLL1-Schale (Schritt 3.1) mit 10 ml frischen OP9-Medien mit einer 200-L-Pipette übertragen. Rock die Kulturschale Seite an Seite dann von vorne nach hinten, um eine gleichmäßige Verteilung der Kolonien zu gewährleisten. HINWEIS: Alternativ können vorgeformte hiPSC embryoid Körper (EBs) oder kleine Klumpensuspensionen verwendet werden.  Die Verwendung eines Einweg-Zellpassaging-Werkzeugs oder EB-Formationssystems wird jedoch bevorzugt, um HiPSC-Klumpen von einheitlicher Größe zu erzeugen.</li>
	</ol></li>
	<li>Am ersten Tag verbrachte Aspirat Medien und ersetzen durch 20 ml frische OP9-Medien. hiPSC-Klumpen, die 1 Tag lang auf OP9/DLL1 mitkultiviert wurden, erscheinen als kleine runde Monolayer-Kolonien (Abbildung 1).</li>
	<li>An Tag 5, aspirieren 10 ml verbrauchte Medien und fügen Sie 10 ml frische OP9-Medien. hiPSC Kolonien werden beginnen, in primitives Mesoderm zu differenzieren, das durch ein vielschichtiges dunkles Zentrum gekennzeichnet ist.</li>
	<li>An Tag 9, aspirieren 10 ml verbrauchte Medien und fügen Sie 10 ml frische OP9-Medien. An diesem Punkt werden sich mehrschichtige Mittelstrukturen zu kuppelartigen Formen entwickeln, und ein peripherer netzwerkähnlicher Bereich wird sich zeigen.</li>
	<li>Ernte hämatopoetische Vorläuferzellen (HPCs) am 13. Tag (Abbildung 1). hiPSC-abgeleitete Strukturen an Tag 13 sind durch ein dunkles zentrales Organoid gekennzeichnet, das von einem Netzwerk von kuppelartigen Bereichen umgeben ist, die für hämatopoetische Zonen (HZs) repräsentativ sind, die zuvor berichtet wurden, um menschliche embryonale Stammzell-abgeleitete hämatopoetische Vorläufer zu umschließen. 21. HINWEIS: Das Vorhandensein der kuppelartigen Strukturen deutet auf einen erfolgreichen Prozess hin, selbst wenn dunkle Zentren fehlen. Die Unfähigkeit, HPCs zu produzieren, kann auf eine schlechte Qualität von OP9/DLL1, die Qualität der FBS-Partie, die Konfluenkeinheit von iPSC-Klumpen zurückzuführen sein, die auf OP9/DLL1 (350-600 Klumpen ist optimal) gesät werden, und/oder Variationen in der Wirksamkeit von iPSC-Linien zur Herstellung hämatpoetischer Vorläufer.<ol>
<li>Aspirieren Sie Medien und waschen Sie 1x mit 5 ml 1x phenolrot-freier Hanks' ausgewogene Salzlösung modifiziert mit Calcium und Magnesium (HBSS).</li>
		<li>ASpirieren Sie HBSS und fügen Sie 250 l von 5000 Einheiten/ml Kollagennase IV in 10 ml HBSS hinzu. Bei 37 °C für 45 min inkubieren. HBSS mit Kollagenase IV aspirieren und einmal mit 5 ml PBS waschen.</li>
		<li>Aspirieren PbS und fügen Sie 5 ml von 0.25% Trypsin-EDTA. Bei 37 °C für 20 min inkubieren. Fügen Sie dann 4 ml OP9-Medien hinzu und distanzieren Sie die Zellschicht durch Pipettieren, um eine Einzelzellsuspension zu bilden.</li>
		<li>Übertragen Sie die Zellsuspension durch ein 100 m Zellsieb in ein 50 ml konisches Rohr.  Zentrifuge bei 300 x g für 5 min bei 4 °C. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie in 10 ml OP9-Medien.</li>
		<li>Plattenzellsuspension auf eine neue gelatinierte 10 cm Zellkultur Petrischale (siehe Schritte 3.1.1 und 3.1.2). Bei 37 °C für 45 min inkubieren. Sammeln Sie dann nicht-haftende Zellen durch sanftepipettierende.</li>
		<li>Übertragen Sie die gesammelte Zellsuspension durch ein 100 m Zellsieb in ein 50 ml konisches Rohr.  Zentrifuge bei 300 x g für 5 min bei 4 °C. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie in 10 ml Differenzierungsmedien [OP9-Medien mit 5 ng/ml humanem Stammzellfaktor (hSCF), 5 ng/ml humanem Flt3-Ligand (hFLT3L) und 5 ng/mL humanem Interleukin 7 (hIL-7)].</li>
		<li>Die Zellsuspension auf eine neue 10 cm OP9/DLL1 Konverflussschale aufteilen.</li>
	</ol></li>
	<li>Am 16. Tag durchdie endiele die Zellen.
	<ol>
<li>Lösen Sie nicht haftende Zellen mechanisch durch sanftes Pipetieren und filtern Sie durch ein 100-m-Zellsieb. Zentrifuge bei 300 x g für 5 min bei 4 °C. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie in 10 ml Differenzierungsmedien.</li>
		<li>Die Zellsuspension auf eine neue 10 cm OP9/DLL1 Konverflussschale aufteilen.</li>
	</ol></li>
	<li>Fahren Sie danach alle 5-7 Tage mit der Passierung nicht anhaftender Zellen fort, indem Sie Schritt 3.8 wiederholen.</li>
	<li>An Tag 35 cd4+CD8+ doppelt positive (DP) Population anreichern und stimulieren, CD8- + SP T-Zellen zu produzieren (Abbildung 2).
	<ol>
<li>Lösen Sie nicht haftende Zellen mechanisch durch sanftes Pipetieren und filtern Sie durch ein 100 m großes Zellsieb, um Zellklumpen zu entfernen. Anreichern CD4+ Zellpopulation durch CD4 magnetische Perle Isolierung nach dem Hersteller-Protokoll. HINWEIS: Die Begründung für die Verwendung von CD4-Magnetperlen ist, CD4-CD8- DN-Zellen aus der Kultur zu entfernen, da diese nachweislich eine direkte Tötung von CD4+CD8+ DP-Zellen nach Stimulation22verursachen.</li>
		<li>Zählen Sie lebende CD4-angereicherte Zellen mit einem Neubauer Hämozytometer und Trypan-Blaufarbstoff.  Suspend in OP9-Medien bei Gesamtkonzentration 0,5 x 106 Zellen/ml. Aliquot 1 ml der Zellsuspension (0,5 x 106 Zellen) in jeden Brunnen einer Gewebekultur flachen Boden 24 Wellplatte der konfluenten OP9/DLL1.</li>
		<li>Fügen Sie 100 I.E. humanes Interleukin 2 (hIL-2), 5 ng/ml hIL-7, 500 ng/ml antihumanen CD3-Antikörper und 2 g/ml Anti-Human-CD28-Antikörper hinzu, dann Kultur bei 37 °C.</li>
		<li>Am Tag 4 - 7 nach der Stimulation sammeln Sie Zellen für die molekulare Analyse (Abbildung 3) oder Co-Kultur mit peptidgepulten Antigen-präsentierenden Zellen (APCs).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Messung der Antigen-Spezifität von hiPSC derived CD8- + SP T-Zellen
HINWEIS: Die Art der APCs, die für dieses Experiement verwendet werden sollen, hängt von der MHC-Beschränkung von hiPSC-abgeleiteten T-Zellen ab. Hier wird T2-Zelllinie verwendet, die eine Hybride von T- und B-Lymphoblastoid-Zelllinien ist. T2-Zellen exprimieren HLA-A*02:0123, die von JKF6-Zellen erkannt wird, von denen MART1-iPSC abgeleitet wurde18. Diese T2-Zelllinie kann in RPMI 1640 + 20% FBS + 1x Penicillin-Streptomycin erweitert werden und wird durchdrungen, wenn Zellen eine Dichte von 5 x 105 Zellen/ml erreichen.
<ol><li>Zählen Sie live HLA-A*02:01+ T-B Hybrid-Lymphoblastoid T2-Zellen mit einem Neubauer Hämozytometer und Trypan blauer Farbstoff. Inkubieren Sie APCs in 24 Brunnengewebekulturplatten mit 1 g/ml MART-1-Peptid für 2 h bei 37 °C. HINWEIS: Die optimale Peptidkonzentration ist variabel, abhängig von der Zelllinie und der Antigenspezifität.</li>
	<li>Sammeln Sie APCs und waschen Sie 2x mit 10 ml PBS, um zusätzlichePeptid zu entfernen.</li>
	<li>Zählen Sie APCs und setzen Sie bei 2 – 5 x 105 Zellen/ml in OP9-Medien mit 100 I.E. IL-2 und 5 ng/ml IL-7 aus. Aliquot 100 l Zellsuspension (2-5 x 104 Zellen) in jeden Brunnen einer ultra-niedrigen Befestigung U bottom 96 WellPlatte oder direkt in eine vorbeschichtete ELISpot Platte.</li>
	<li>Sortieren Sie hiPSC-abgeleiteteCD8- + SP-T-Zellen (1 Woche nach der antihumanen CD3/CD28-Antikörperstimulation) mit einem Zellsortierer und suspendieren Sie bei 1 x 106 Zellen/ml in OP9-Medien mit 100 I.E. IL-2 und 5 ng/ml IL-7. Aliquot 100 l Zellsuspension (1 x 105 Zellen) in jeden Brunnen von APCs und Kultur für 16 - 20 h bei 37 °C.</li>
	<li>Analysieren Sie nach 16 - 20 h das Cytokin-Sekretionsprofil durch ELISpot-Assay gemäß dem Herstellerprotokoll (Abbildung 4).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brauer, P. M., Singh, J., Xhiku, S., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cell+Genesis:+In+Vitro+Veritas+Est.">T Cell Genesis: In Vitro Veritas Est.</a> Trends in Immunology. 37 (12), 889-901 (2016).</li><li>Rosenberg, S. A., Restifo, N. 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Die Autoren haben keine Angaben.

Die Kokultur von OP9 murinen Stromalzellen ist ein etabliertes System zur In-vitro-Generierung von Lymphozyten (d. h. NK-, B- und T-Zellen) aus HSPCs und pluripotenten Stammzellen. Notch-Signalisierung ist erforderlich, um T-Lineage-Verpflichtung zu induzieren und kann durch die ektopische Expression von Notch Ligand DLL1 oder DLL4 erreicht werden, die eine vergleichbare Wirksamkeit für T-Zell-Generation1haben. Daher ist das OP9/DLL1-Kokultursystem zu einer weit verbreiteten Methode zur Herstellung von T-Zellen in vitro geworden.  Darüber hinaus ist diese Methode für die Verwendung mit verschiedenen Arten und Quellen menschlicher Zellen anwendbar, einschließlich Nabelschnurblut, Knochenmark-HSPCs und ESCs.  Die Generierung von T-Zellen aus diesen Quellen ist jedoch entweder durch unzureichendes Abrufen von Quellzellen oder durch ineffiziente Differenzierung zu T-Zellen1begrenzt. Darüber hinaus kann aus diesen offenen Repertoirequellen kein T-Zellprodukt mit einer einzigen TCR-Rekombination generiert werden. Durch den Einsatz regenerativer Medizintechniken, nämlich der induzierten pluripotenten Stammzelltechnologie (iPSC), kann es möglich sein, eine große Anzahl antigenspezifischer T-Zellen für den Einsatz in zellbasierten Therapeutika zu produzieren15.
hiPSCs ähneln pluripotenten ESCs in ihrer Fähigkeit zur Selbsterneuerung, grenzenlosen Expansion und dem Potenzial, sich von jeder Art von somatischem Zelle im Körper zu unterscheiden; ihnen fehlen jedoch die ethischen Bedenken hinsichtlich der Verwendung von Produkten embryonalen Ursprungs für klinische Anwendungen. Darüber hinaus können hiPSCs aus jeder somatomatischen Zelle hergestellt werden, was die Entwicklung von Zellprodukten für die personalisierte Medizin ermöglicht. In früheren Berichten wurden hiPSCs aus menschlichen T-Zellen unter Verwendung ganzer peripherer mononuklenulogischer Zellen, CD3+ Zellen oder isolierter zytotoxischer T-Lymphozyten (CTLs) als Quelle18,19,22, 26. Wenn hiPSCs aus einer T-Zellquelle (T-iPSCs) erzeugt werden, wird die ursprüngliche TCR-Gen-Rearrangement vererbt. Daher können T-iPSC-abgeleitete T-Zellen des Patienten ein Modell für eine personalisierte ACT-Behandlung darstellen, indem sie auf die unterschiedlichen Krebsantigene eines Patienten abzielen.
Die Differenzierung menschlicher pluripotenter Stammzellen in T-Linienzellen ist in zwei Schritte unterteilt: die Erzeugung hämatopoetischer Vorläuferzellen (HPCs)27 und ihre weitere Differenzierung in T-Linienzellen21. Beide Schritte können mit dem OP9/DLL1-Kokultursystem durchgeführt werden. Wichtig ist, dass die Qualität der OP9/DLL1-Feederzellen entscheidend für den Erfolg der T-Zelldifferenzierung ist. Da OP9/DLL1-Zellen keine verewigte homogene Zelllinie sind, ist die Qualität der FBS- und Kulturbedingungen entscheidend für die Aufrechterhaltung ihrer Expansion, ohne die Fähigkeit zu verlieren, die hiPSC-Differenzierung zu unterstützen. Daher wird empfohlen, die Menge der FBS und die Passage konsequent zu bewerten, wenn der zell-zellige zytoplasmatische Kontakt beginnt, um Zelldifferenzierung und Seneszenz zu verhindern. Ein zu berücksichtigender Punkt ist, dass der Zell-zu-Zell-Kontakt je nach Phasenkontrast und Vergrößerung des Mikroskops nicht vom Hintergrund zu unterscheiden sein kann. Unserer Erfahrung nach werden die meisten OP9/DLL1-Gerichte 80% konfluent erscheinen, wenn sie bereit sind, durchzufahren.
Es hat sich gezeigt, dass die neu differenzierten T-Linienzellen, die von DerOP9/DLL1-Cokultur aus T-iPSCs erzeugt werden, CD8+ SP-T-Zellen nach Stimulation18,19erzeugen können. Regenerierte CD8+ SP T-Zellen erhalten jedoch den angeborenen CD8-Homodimer22,28, der ein ineffektiver Co-Rezeptor für die TCR-Signalisierung29ist.  Darüber hinaus haben diese regenerierten CD8+ SP T-Zellen eine starke TCR-unabhängige Zytotoxizität gezeigt, was diese Zellen für den klinischen Einsatz ungünstig macht30. Dieses Protokoll beschreibt eine kürzlich durchgeführte Methode, bei der gereinigte CD4+CD8+ DP-Zellen zur Erzeugung von CD8-+ SP-T-Zellen mit einem konventionelleren Phänotyp und verbesserter antigenspezifischer Zytotoxizität22verwendet werden. Obwohl der Verlust der Antigenspezifität durch sekundäre TCR-Allel-Umlagerung im DP-Stadium nach längerer Langzeitkultur auftritt, kann dies durch Genombearbeitung in T-iPSCs31überwunden werden.  Nach unserer Erfahrung beginnen hiPSC-abgeleitete DP-Zellen an Tag 30 - 35 der Kultur zu erscheinen, und diese neu erzeugten DP-Zellen haben noch keine sekundäre TCR-Umlagerung durchlaufen. Daher behalten die meisten DP-Zellen an Tag 35 die Antigenspezifität bei und können verwendet werden, um antigenspezifischeCD8- + SP-T-Zellen zu erzeugen.
Vor der menschlichen Anti-CD3- und Anti-CD28-Stimulation am 35. Tag müssen CD4-CD8 -DN-Zellen aus der Kultur entfernt werden, da diese nachweislich eine direkte Tötung von CD4+CD8+ DP-Zellen nach Stimulation22verursachen. Mit CD4 magnetische Perle Anreicherung (Schritt 3.10) wird für DP und CD4+CD8anreichern - Zwischen-Einzel-positive (ISP) Zellen1, die wir haben nachweislich keine negativen Auswirkungen22. Alternativ kann die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung durch Durchflusszytometrie durchgeführt werden, um DP-Zellen zu isolieren. Die magnetische Perlentrennung wird jedoch bevorzugt, da sie die mechanische Belastung durch Durchflusszytometrie vermeidet.
Die Erzeugung vonCD8- + SP-T-Zellen aus humanen pluripotenten Stammzellen ohne Aktivierungs-vermittelte Agonistenauswahl wurde anschließend durch die Verwendung von 3D-murinen Stromalzellkultur32nachgewiesen. Die physiologische positive Selektion hängt jedoch von der Wechselwirkung von TCR mit Selbstpeptid-MHC-Komplexen ab, die von thymischen kortikalen Epithelzellen33eindeutig verarbeitet und präsentiert werden. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass die TCR-Affinität für Selektionspeptide die nachfolgenden funktionellen Fähigkeiten von ausgereiftenCD8- + SP-T-Zellen34bestimmt.  Derzeit gibt es keine Hinweise darauf, dass ein Notch stromal zellbasiertes Co-Kultur-System die definierte Selektion Peptid und MHC-Komplex für physiologische positive Selektion erforderlich liefern kann.
Es wurde zuvor in einem murinen Modell berichtet, dass T-Linienzellen, die aus Tumorantigen-spezifischen T-Zell-abgeleiteten HiPSCs mit OP9/DLL1 allein erzeugt wurden, keine konventionelle Reifung erfahren. IPSC-abgeleitete unreife T-Zellen, die vom OP9/DLL1-System erzeugt werden, können jedoch durch weitere physiologische thymische Bildung in einem 3D-Kultursystem zu naiven T-Zellen reifen 28,35. Daher ist das hier vorgestellte Protokoll zur Herstellung von iPSC-abgeleiteten unreifen T-Zellen, die vom OP9/DLL1-System erzeugt werden, von entscheidender Bedeutung für weitere Versuche, echte menschliche Tumorantigen-spezifische postthymische T-Zellen zu erzeugen, die in der Lage sind, eine langfristige Persistenz in vivo mit Effizienz zur Behandlung etablierter vaskularisierter Tumoren.

Neben physiologischen Vorteilen haben T-Zellen viele mögliche therapeutische Anwendungen. Die Erzeugung und Expansion von T-Zellen in vitro kann für die Krankheitsmodellierung und therapeutische Validierung sowie eine Behandlungsquelle für erbliche und erworbene Immunschwächezustände (d. h. virale Immundefekte und Lymphdejektion sekundär Chemotherapie oder Transplantation) und zur Ausrottung von Krebs. Diese letztgenannte Qualität hat zur Entwicklung eines Adoptiv-T-Zelltransfers (ACT) zur Behandlung von Patienten mit fortgeschrittenem Krebs geführt1.
ACT besteht darin, den Tumor eines Patienten zu resektieren, tumorinfiltrierende Lymphozyten (TILs) zu extrahieren, TILs ex vivo zu erweitern und dann die erweiterten Zellen wieder in den Patienten einzubauen2. Es hat sich gezeigt, dass eine wirksame Behandlungsmodalität für einige Patienten mit metastasierendem Krebs.  Leider reagieren nicht alle Patienten auf diese Therapie. Frühere Berichte haben gezeigt, dass der Differenzierungszustand der übertragenen Zellen3,4,5,6,7,8,9, Verwendung von großen Zahlen von hoch angereicherten Krebsantigen-spezifischen T-Zellen10, und Persistenz von T-Zellen nach Übertragung11,12 sind alle korreliert mit haltbareren Reaktionen13,14. Daher, wenn ACT keine Anti-Tumor-Reaktion hervorruft, kann es zum Teil auf eine geringe Ausbeute von Krebs antigenspezifischen T-Zellen, ineffiziente Ex-vivo-Expansion, die zur Erschöpfung und zum Verlust von reaktiven Klonen führt, oder mangelnde Persistenz nach Übertragung4 . Es wurde postuliert, dass diese Hindernisse durch die Erzeugung einer großen Anzahl von weniger differenzierten Krebsantigen-spezifischen T-Zellen in vitro15,16überwunden werden können.
Hämatopoetische Stamm-/Vorläuferzellen (HSPCs) sind eine konventionelle Quelle für die In-vitro-T-Zellgenerierung, obwohl diese Methode durch die geringe Anzahl von Zellen begrenzt ist, die von einem einzigen Spender zurückgewonnen werden können1. Embryonale Stammzellen (ESCs) haben auch gezeigt, dass T-Zellen produziert, aber mit geringer Ausbeute17, so dass es ineffizient für klinische Anwendungen. Da T-Linienzellen in frühen Entwicklungsstadien eine stochastische genetische Rekombination ihrer T-Zellrezeptoren (TCRs) erleben, ist es nicht möglich, HSPCs oder ESCs zu verwenden, um eine reine Population antigenspezifischer T-Zellen ohne weitere genomische Modifikationen wie TCR-Gentransduktion.
Ein Ansatz, um diese Vorbehalte zu überwinden, ist die Neuprogrammierung von TILs auf humaninduzierte pluripotente Stammzellen (hiPSCs), die eine unbegrenzte Quelle für die In-vitro-T-Zellgenerierung darstellen können. Es hat sich gezeigt, dass krebsantigenespezifische TILs in HiPSCs umprogrammiert und in T-Zell-Linien differenziert werden können, die die gleiche T-Zell-Rezeptor-Gen-Neuanordnung beibehalten wie die ursprüngliche T-Zelle18,19.  Dieses Detail ist wichtig für ACT, da einzelne Patiententumoren einzigartige Mutationsprofile haben und sehr wenige Krebsantigene nachweislich unter den Patienten geteilt werden20. Daher kann die Verwendung von krebsantigenspezifischen TILs als Quelle für die In-vitro-Generierung von hiPSC-abgeleiteten T-Zellen eine neue Strategie für die personalisierte Behandlung von Patienten mit metastasierendem Krebs bieten.
Hier wird im Detail ein Protokoll zur Unterscheidung von hiPSC-abgeleiteten T-Linienzellen in funktionelle antigenspezifischeCD8- + einzelne positive (SP) T-Zellen mit OP9/DLL1-Kokultursystem vorgestellt. Diese Methode ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur In-vitro-T-Zell-Differenzierung von HiPSCs, hämatopoetischen Vorläufern und embryonalen Stammzellen sowie deren weitere Anwendungen in der regenerativen Medizin und zellbasierten Therapien.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >10 cm dish</td>
			<td >Corning, Inc.&#160;</td>
			<td >353003</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD3, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 561812, RRID:AB_1089628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD34, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >Cat# 348791, RRID:AB_400381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD4, human</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td>Cat# 344612, RRID:AB_2028479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD43, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >Cat# 560198, RRID:AB_1645460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD7, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 555361, RRID:AB_395764</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD8a, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 555369, RRID:AB_398595</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD8b, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >Cat# 641057, RRID:AB_1645747</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-TCRb, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >Cat# 555548, RRID:AB_395932</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD28 human monoclonal antibody (15E8), pure functional grade</td>
			<td >Miltenyl Biotec</td>
			<td>130-093-375</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD3 human monoclonal antibody (OKT3), pure functional grade</td>
			<td >Miltenyl Biotec</td>
			<td>130-093-387</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD4 Microbeads, human</td>
			<td >Miltenyl Biotec</td>
			<td >130-045-101</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell strainer 100 um</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >22-363-549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td >Gemini</td>
			<td >100-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Flt-3 ligand</td>
			<td >R&#38;D Systems</td>
			<td >427-FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gelatin Solution 2%&#160;</td>
			<td>SIGMA-Aldritch</td>
			<td>G1393-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GlutaMAX (100X)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >35050-061</td>
			<td >L-Glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HBSS Mg+Ca+ Phenol-Red Free</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Interleukin-2</td>
			<td >R&#38;D Systems</td>
			<td >202-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Interleukin-7</td>
			<td >R&#38;D Systems</td>
			<td >407-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >iTAG MHC Tetramer HLA-A*0201 Mart1 Tetramer -ELAGIGILTV</td>
			<td >MBL</td>
			<td >Cat#TB-0009-2</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mart1-hiPSC</td>
			<td >Vizcardo et al., Cell Stem Cell 2013</td>
			<td >RIKEN-IMS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Melan-A, MART 1 (26-35)</td>
			<td >InnoPep</td>
			<td >3146-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#945;MEM powder</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >61100061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C57BL/6 MEF MITC-TREATED 4M EACH; A34962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >OP9/N-DLL1</td>
			<td >Riken Bioresource center</td>
			<td >Cat# RCB2927; RRID:CVCL_B220</td>
			<td >OP9/DLL1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/streptomycin</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate buffered saline pH 7.4 (1x)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primate ES Cell Medium</td>
			<td >Reprocell</td>
			<td >RCHEMD001</td>
			<td >Human ESC Culture Media</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rhok inhibitor (Y-27632 dihydrochloride)</td>
			<td >Tocris</td>
			<td >1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RPMI 1640</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td >R&#38;D Systems</td>
			<td >455-MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >StemPro</td>
			<td >EZPassage</td>
			<td >23181-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T2-tumor</td>
			<td >ATCC</td>
			<td>T2 (174 x CEM.T2) (ATCC&#174; CRL-1992&#8482;)&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red&#160;</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red&#160;</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >U Bottom 96 well plate</td>
			<td >Corning, Inc.&#160;</td>
			<td >3799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using human induced pluripotent stem cells for the generation of tumor antigen-specific t cells

Die Erzeugung und Erweiterung funktioneller T-Zellen in vitro kann zu einer breiten Palette klinischer Anwendungen führen. Eine solche Anwendung ist für die Behandlung von Patienten mit fortgeschrittenem Krebs. Es hat sich gezeigt, dass der Adoptiv-T-Zelltransfer (ACT) hoch angereicherter Tumorantigen-spezifischer T-Zellen bei einigen Patienten eine dauerhafte Regression von metastasierendem Krebs verursacht. Während der Expansion können diese Zellen jedoch erschöpft oder seneszierend werden, was ihre Effektorfunktion und Persistenz in vivo einschränkt. Induzierte pluripotente Stammzelltechnologie (iPSC) kann diese Hindernisse überwinden, indem sie zur In-vitro-Generierung einer großen Anzahl weniger differenzierter Tumorantigen-spezifischer T-Zellen führt. Human es iPSC (hiPSC) haben die Fähigkeit, sich in jede Art von somatischer Zelle zu differenzieren, einschließlich Lymphozyten, die die ursprüngliche genomische Neuanordnung des T-Zellrezeptors (TCR) beibehalten, wenn eine T-Zelle als Ausgangszelle verwendet wird. Daher hat die Reprogrammierung menschlicher Tumorantigen-spezifische T-Zellen auf HiPSC gefolgt von einer Redifferenzierung auf T-Zell-Linie das Potenzial, verjüngte Tumorantigen-spezifische T-Zellen zu produzieren. Beschrieben hier ist eine Methode zur Erzeugung von Tumor-Antigen-spezifischen CD8+ einzelne positive (SP) T-Zellen aus hiPSC mit OP9/DLL1 Co-Kultursystem. Diese Methode ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die In-vitro-T-Zell-Linienbildung und wird die Entwicklung von in vitro abgeleiteten T-Zellen für den Einsatz in der regenerativen Medizin und zellbasierten Therapien erleichtern.

Nach 13 Tagen erschienen hiPSCs co-culturing mit OP9/DLL1, CD34+CD43+ hämatopoetische Vorläuferzellen (Abbildung 1). Nach weiteren 22 Kulturtagen auf nicht gelatiniertem OP9/DLL1 in Gegenwart von hSCF, hFLT3L und hIL-7 differenzierten sich hämatopoetische Vorläufer in CD3+CD7+CD4 + CD8+CD8+ Doppelpositiv (DP) T Abstammungszellen, Mehrheit davon tCR spezifisch für das MART-1-Epitop (Tetramer) (Abbildung 2).
Es wurde bereits gezeigt, dass CD8+ SP T-Zellen aus CD4+CD8+ DP T-Zellen durch TCR-Signalisierung über agonistische Peptid- oder Antikörper-gesteuerte TCR-Stimulation24,25induziert werden können. Daher wurden am 35. Tag der Kultur hiPSC-abgeleitete CD4+CD8+ DP T-Zellen mit antihumanen CD3- und antihumanen CD28-Antikörpern in Gegenwart von hIL-7 und hIL-2 stimuliert.  Vier Tage nach der Stimulation nahm die Anzahl der CD3+CD8- + SP-Zellen dramatisch zu und blieb spezifisch für das MART-1-Epitop, was die Erhaltung ihrer vererbten Antigen-Spezifität bestätigte (Abbildung 3).
Um die funktionellen Eigenschaften von hiPSC-abgeleitetenCD8- + SP-T-Zellen zu bestimmen, wurde die antigenabhängige Aktivierung und Sekretion von Interferon-Gamma (IFN-) analysiert. Nach der Stimulation mit antihumanen CD3- und antihumanen CD28-Antikörpern für 1 Woche wurden hiPSC-abgeleitete CD8-+ SP-T-Zellen mit einem Zellsortierer isoliert und mit T2-Zelllinie exizipiert, die HLA-A*02:01 mit oder ohne Cognate MART1-Peptid für 16 - 20 h exibiliert. Der ELISpot-Assay ergab, dass hiPSC-abgeleitete CD8-+ SP-T-Zellen höhere Mengen an IFN-B im Vergleich zu CD8-+ SP-T-Zellen absondern, wenn sie in Gegenwart von MART-1-Peptid kultiviert werden. Die IFN-Expression war für T-Zellen und APCs allein null, was zeigt, dass menschliche T-iPSC-abgeleitete T-Zellen antigenspezifisch und funktionell sind (Abbildung 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59997/59997fig1.jpg"> Abbildung 1: Erzeugung von hiPSC-abgeleiteten hämatopoetischen Vorläuferzellen. (A) Schematische Übersicht über die Differenzierung von hiPSCs zu hämatopoetischer Abstammung unter Verwendung der OP9/DLL1-Kokultur. (B) Darstellung von hiPSC-abgeleiteten Strukturen an den Tagen 1 (oben links), 3 (oben rechts), 7 (unten links) und 13 (unten rechts). Skalenstäbe = 100 m . (C) Flow zytometrische Analyse von hiPSC abgeleitetCD34+CD43+ hämatopoetische Vorläuferzellen am Tag 13. Die Daten sind repräsentativ für sechs unabhängige Experimente (n = 1 bis 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59997/59997fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59997/59997fig2.jpg"> Abbildung 2: hiPSC-Differenzierung in Mart1+ CD4+CD8-+ DP-T-Zellen. (A) Schematische Übersicht über die Differenzierung der von hiPSC abgeleiteten hämatopoetischen Abstammung zu unreifen T-Zellen unter Verwendung der OP9/DLL1-Kokultur. (B) Flow-zytometrische Analyse von CD4 vs. CD8, CD3 vs. CD8- und MART-1-Tetramerexpression in hiPSC-abgeleiteten T-Zellen am 35. Tag. Gated auf Lymphozyten, einzelne Zellen, PI negativ. Die Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente (n = 3 - 8). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59997/59997fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59997/59997fig3.jpg"> Abbildung 3: Induktion desCD8- + SP-T-Zellphänotyps. Flow zytometrische Analyse von CD4- hiPSC-abgeleiteten T-Zellen 4 Tage nach humanem Anti-CD3 und menschlicher Anti-CD28-Antikörper-gesteuerter Stimulation. Gated auf Lymphozyten, einzelne Zellen, PI negativ (n = 4).   <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59997/59997fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59997/59997fig4.jpg"> Abbildung 4: Antigen-Spezifität von hiPSC-abgeleiteten CD8- + SP-T-Zellen. IFN--Sekretion durch ELISpot-Assay von hiPSC-abgeleitetenCD8- + SP-,CD8-+ SP- und Bulk-T-Zellen nach 20 h Kokultur mit oder ohne T2-Zellen, gepulst (oder nicht) mit MART-1-Peptid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59997/59997fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Erzeugung funktioneller Tumorantigen-spezifischer induzierter pluripotenter Stammzell-abgeleiteterCD8- + einzelner positiver T-Zellen mit OP9/DLL1-Kokultursystem.

Verwendung von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen zur Erzeugung von Tumorantigen-spezifischen T-Zellen

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Wir präsentieren eine Methode zur Erzeugung von humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Tumorantigen-spezifischen CD8 alpha beta single-positiven T-Zellen mit OP9-Delta-1 Kokultursystem. Diese Methode ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die In-vitro-T-Zellgenerierung und wird die Entwicklung von in vitro abgeleiteten T-Zellen für den Einsatz in der regenerativen Medizin und zellbasierten Therapien erleichtern. Es kann auch für die Erzeugung von anderen Lymphozyten angepasst werden, wie NK-Zellen.Bei der Durchführung dieser Technik ist es wichtig, die Menge der FBS- und Durchgangs-OP9-Delta-1-Zellen konsistent vorzubewerten, wenn der zell-zellige zytoplasmatische Kontakt beginnt, Zelldifferenzierung und Seneszenz zu verhindern. Demonstriert wird das Verfahren von Dr.Meghan Good, einer chirurgischen Onkologie-Stipendiatin aus meinem Team. Beginnen Sie mit der Überprüfung menschlicher iPSC-Kolonien in einem Stereomikroskop und entfernen Sie alle Bereiche der Differenzierung von der Kultur mit der Kunststoffkante einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze.Wenn die Kolonien einen Durchmesser von 0,8 bis 1,2 Millimetern erreichen, durchfahren Sie die menschlichen iPSCs. Aspirieren Sie die verbrauchten Medien, und fügen Sie 10 Milliliter humaner iPSC-Medien hinzu, die mit 10-Mikromolaren-ROCK-Hemmern ergänzt werden. Rollen Sie ein Einweg-Zell-Passaging-Werkzeug über die gesamte Schale in eine Richtung, um einen gleichmäßigen Druck zu halten und sicherzustellen, dass die gesamte Walzenklinge die Kulturschale berührt.Drehen Sie die Kulturschale um 90 Grad, und wiederholen Sie das Rollen. Bestätigen Sie visuell das richtige Schneiden der Kolonien mit einem Mikroskop. Sie sollten kariert erscheinen.Lösen Sie dann die geschnittenen Kolonien durch sanfte mechanische Spülung mit einer 200-Mikroliter-Pipette. Schätzen Sie visuell die Anzahl der Kolonieklumpen und übertragen Sie zwischen 350 und 600 Klumpen auf eine neue 10-Zentimeter-Schale von Mausembryonal-Fibroblasten mit 10 Millilitern frischer menschlicher iPSC-Medien, ergänzt mit ROCK-Hemmer. Inkubieren Sie das Gericht über Nacht bei 37 Grad Celsius.Am nächsten Tag, aspirieren Sie die verbrauchten Medien, und fügen Sie 10 Milliliter frische menschliche iPSC-Medien. Ändern Sie die Medien alle ein oder zwei Tage, abhängig von der Zellwachstumsrate. Kultur die OP9-Delta-1 Zellen in OP9 Medien bei 37 Grad Celsius.Wenn sie die Koninfluenza erreichen, die Medien ansaugen und die Zellen einmal mit fünf Millilitern 1x Magnesium, Kalzium und phenolrot-freiem PBS waschen. Aspirieren Sie die PBS, fügen Sie zwei Milliliter 05%trypsin-EDTA, und inkubieren Sie die Zellen für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius. Fügen Sie dann vier Milliliter OP9-Medien hinzu, und distanzieren Sie die Zellschicht mechanisch durch Pipettieren.Übertragen Sie die Zellsuspension durch ein 100-Mikrometer-Zellsieb auf ein 50-Milliliter-Konikonrohr und zentrifugieren Sie bei 300 mal g bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Aspirieren Sie den Überstand, und setzen Sie die Zellen in 12 Milliliter OP9-Medien wieder aus. Fügen Sie acht Milliliter OP9-Medien zu jedem der sechs neuen Zellkulturgerichte hinzu und platten Sie zwei Milliliter op9-delta-1 Zellsuspension auf jede Schale.Schaukeln Sie die Schale Seite an Seite und von vorne nach hinten, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius, und wiederholen Sie den Durchgang, wenn die Zellen die Koninfluenza erreichen. Bereiten Sie gelatinierte OP9-Delta-1 Gerichte eine Woche vor der Co-Kultur mit menschlichen iPSCs zu.Fügen Sie vier Milliliter 0,1% Gelatine zu drei neuen Zellkultur-Gerichten hinzu und bebrüten sie 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation die Gelatine ansaugen und acht Milliliter OP9-Medien zu jedem Gericht hinzufügen. Durchgang eine konfluente Schale op9-Delta-1 Zellen zu drei Gelatine-beschichteten Gerichten.Nach vier Tagen 10 Milliliter OP9-Medien zu jedem Zellgericht hinzufügen, für insgesamt 20 Milliliter Medien pro Schale. Beginnen Sie die menschliche iPSC-Kokultur auf OP9-Delta-1 konfluenten Gerichten sieben bis acht Tage nach dem Passieren der Zellen. Saugen Sie die Medien aus einer konfluenten Schale menschlicher iPSCs und fügen Sie 10 Milliliter OP9-Medien hinzu.Zellkolonien mit einem Einweg-Zellpassaging-Tool schneiden und ablösen und 350 bis 600 Klumpen geschnittener Kolonien auf eine vorgelatinierte OP9-Delta-1-Schale mit 10 Millilitern frischen OP9-Medien übertragen. Rock die KulturSchale Seite an Seite und von vorne nach hinten, um eine gleichmäßige Verteilung der Kolonien zu gewährleisten. Am nächsten Tag, aspirieren Sie die verbrauchten Medien, und ersetzen Sie es durch 20 Milliliter frische OP9-Medien.Die menschlichen iPSC-Klumpen, die einen Tag lang auf OP9-Delta-1 mitkultiviert wurden, sollten als kleine, runde Monolayer-Kolonien erscheinen. Am fünften Tag 10 Milliliter verbrauchte Medien ansaugen und 10 Milliliter frische OP9-Medien hinzufügen. Die Kolonien werden beginnen, sich in primitives Mesoderm zu differenzieren, das durch ein vielschichtiges dunkles Zentrum gekennzeichnet ist.Wiederholen Sie diesen Vorgang am neunten Tag, an dem sich die mehrschichtigen Mittelstrukturen zu kuppelartigen Formen entwickeln. Ernten Sie die hämatopoetischen Vorläuferzellen an Tag 13, an dem die Strukturen aus einem dunklen zentralen Organoid bestehen, das von einem Netzwerk von kuppelartigen Bereichen umgeben ist. Die Medien ansaugen und die Zellen einmal mit fünf Millilitern 1x phenolrot-freier Hanks'balanced Salzlösung mit Kalzium und Magnesium oder HBSS waschen.Nach dem Waschen 250 Mikroliter 5.000 Einheiten pro Milliliter Kollagenase IV zu 10 Milliliter HBSS hinzufügen. Fügen Sie die Mischung zu den Zellen, und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius für 45 Minuten. Die HBSS-Kollagenase-Mischung ansaugen und die Zellen einmal mit fünf Millilitern PBS waschen.Nach dem Waschen mit PBS fünf Milliliter 0,25%Trypsin-EDTA hinzufügen und die Zellen 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius bebrüten. Fügen Sie dann vier Milliliter OP9-Medien hinzu, und distanzieren Sie die Zellschicht durch Pipettieren, um eine Einzelzellensuspension zu erstellen. Übertragen Sie die Zellsuspension durch ein 100-Mikrometer-Sieb auf ein 50-Milliliter-Konikonrohr und zentrieren Sie das Rohr bei 300 mal g und vier Grad Celsius für fünf Minuten.Aspirieren Sie den Überstand, und setzen Sie die Zellen in 10 Milliliter OP9-Medien wieder aus. Die Zellsuspension auf eine neue gelatinierte 10-Zentimeter-Zellkulturschale aufsieben und 45 Minuten bei 37 Grad Celsius bebrüten. Sammeln Sie dann alle nicht haftenden Zellen durch sanftepipettierende.Übertragen Sie die Zellsuspension durch ein Sieb und eine Zentrifuge in ein 50-Milliliter-Konikonrohr. Dann, aspirieren Sie den Überstand, und resuspendieren Sie die Zellen in 10 Milliliter Differenzierung semedia. Die Zellsuspension auf eine neue OP9-Delta-1 Konfluentschale aufteilen.Passieren Sie die Zellen am 16. Tag gemäß den Manuskriptanweisungen und passieren Sie die nicht haftenden Zellen alle fünf bis sieben Tage danach. Bereichern Sie nach 35 Tagen Differenzierung die CD4-positive Zellpopulation durch CD4-Magnetperlenisolierung gemäß dem Herstellerprotokoll. Dann setzen Sie die Zellen in OP9-Medien wieder aus und platten einen Milliliter Zellsuspension in jeden Brunnen einer Gewebekultur, flach-boden, 24-Well-Platte von konfluentem OP9-Delta-1.Stimulieren Sie Zellen, indem Sie 100 internationale Einheiten des menschlichen IL-2, fünf Nanogramm menschlicher IL-7, 500 Nanogramm antihumaner CD3-Antikörper und zwei Mikrogramm antihumaner CD28-Antikörper zu jedem Brunnen hinzufügen. Nach vier bis sieben Tagen können Zellen zur weiteren Analyse gesammelt werden. Nach der Kultur auf nicht gelatinierten OP9-Delta-1 in Gegenwart von menschlichen Stammzellfaktor, humanem FLT3-Ligand und menschlichem Interleukin-7 unterschieden sich hämatopoetische Vorläufer in CD3, CD7, CD4 und CD8 doppelpositive T-Linienzellen, von denen die Mehrheit T-Zellrezeptoren spezifisch für das MART1-Epitop exprimierte.Als die CD4- CD8-Doppel-positiven T-Zellen mit humanen CD3- und CD28-Antikörpern in Gegenwart von humanem Interleukin-7 und 2 stimuliert wurden, nahm die Anzahl der CD3-positiven CD8-Alpha-Beta-Einzel-positiven Zellen zu und blieb spezifisch für das MART1-Epitop, was die Erhaltung ihrer vererbten Antigenspezifität bestätigte. Ein ELISpot-Test ergab, dass menschliche iPSC-abgeleitete CD8-Alpha-Beta-Beta-T-Zellen höhere Mengen an Interferon-Gamma im Vergleich zu Bulk- und CD8-Alpha-Alpha-Einzel-positiven T-Zellen absondern, wenn sie in Gegenwart von MART1-Peptid kultiviert werden. Für T-Zellen und Antigen-präsentierende Zellen wurde allein keine Interferon-Gamma-Expression nachgewiesen, was zeigt, dass menschliche T-iPSC-abgeleitete T-Zellen antigenspezifisch und funktionell sind.Ein wichtiger Schritt bei dieser Methode ist die CD4-Magnetperlenanreicherung zur Eliminierung von CD4-negativen, CD8-negativen Doppelnegativen Zellen, die bei Stimulation zu einer direkten Tötung von doppelpositiven Zellen führen können. Diese Technik ist für die Verwendung mit mehreren Quellen menschlicher Zellen anwendbar, einschließlich hämatopoetischer Stammzellen und embryonaler Stammzellen. iPSC-abgeleitete unreife T-Zellen, die mit dieser Methode erzeugt werden, könnten für die Erzeugung von reifen menschlichen Tumor-Antigen-spezifischen naiven T-Zellen für zukünftige therapeutische Anwendungen weiter verbessert werden.Nach dem Betrachten dieses Videos sollte der Betrachter verstehen, wie man menschliche iPSC-abgeleitete CD8-Alpha-Beta-Einzel-positive T-Zellen mit dem OP9-Delta-1-Kokultursystem generiert.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Modellierung von Osteosarkom mit Li-Fraumeni-Syndrom, die Patienten abgeleitet induzierten pluripotenten Stammzellen

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Forschung

Krebsforschung

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

Ein dreidimensionales thymisches Kultursystem zur Generierung von murine induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Tumor-Antigen-spezifischen thymischen Auswanderern

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Echtzeit-Erkennung von In Vitro Tumor Zelle Apoptose induziert durch CD8+ T-Zellen, unterdrückende Immunfunktionen Tumor infiltrieren myeloische Zellen zu studieren

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Herstellung von Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Zellen für die Adoptivimmuntherapie

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment

Isolierung und Erweiterung zytotoxischer Cytokin-induzierter Killer-T-Zellen zur Krebsbehandlung

Adoptive cellular immunotherapy focuses on restoring cancer recognition via the immune system and improves effective tumor cell killing. Cytokine-induced ...

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Analyse der Tumor- und Gewebeverteilung von Zielantigen-spezifischen therapeutischen Antikörpern

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Pathologische Analyse der Lungenmetastasierung nach lateraler Schwanzveneninjektion von Tumorzellen

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis

Generation von Zebrafischen Larval Xenografts und Tumorverhaltensanalyse

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly ...

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Tumortransplantation zur Beurteilung der Dynamik tumorinfiltrierender CD8+ T-Zellen in Mäusen

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

Im lebenden Organismus Immunogenitätsscreening von tumorabgeleiteten extrazellulären Vesikeln durch Durchflusszytometrie von Milz-T-Zellen

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...