Name: using human induced pluripotent stem cells for the generation of tumor antigen-specific t cells
Uploaded: 2019-10-24T13:00:00
Duration: 10 min 57 s
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हम एलन बी Hoofring और Erina एच धन्यवाद वह आलेखी सहायता के लिए। इस शोध राष्ट्रीय कैंसर संस्थान के Intramural अनुसंधान कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था (जियाई BC010763) और सेल आधारित कैंसर इम्यूनोथेरेपी के लिए Intramural NCI कैंसर Moonshot पहल.

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लेखकों कोई खुलासे नहीं है.

OP9 murine stromal कोशिकाओं की सह संस्कृति HSPCs और pluripotent स्टेम कोशिकाओं से लिम्फोसाइटों (यानी, एनके, बी, और टी कोशिकाओं) के इन विट्रो पीढ़ी के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित प्रणाली है। पायदान संकेतन टी वंश प्रतिबद्धता प्रेरित करने के लिए आवश्यक है और पायदान ligand DLL1 या DLL4, जो टी सेल पीढ़ी1के लिए तुलनीय प्रभावकारिता है की अस्थानिक अभिव्यक्ति द्वारा पूरा किया जा सकता है. इसलिए, OP9/DLL1 सह-संस्कृति प्रणाली इन विट्रो में टी कोशिकाओं के उत्पादन के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि बन गया है।  इसके अलावा, इस विधि कई प्रकार और मानव कोशिकाओं के स्रोतों के साथ उपयोग के लिए लागू है, गर्भनाल रक्त सहित, अस्थि मज्जा HSPCs और ESCs.  तथापि, इन स्त्रोतों से टी कोशिकाओं का उत्पादन या तो स्रोत कोशिकाओं की अपर्याप्त पुनर्प्राप्ति द्वारा अथवा टी कोशिकाओं1में अक्षम विभेद द्वारा सीमित है। साथ ही, एक एकल TCR पुनर्संयोजन के साथ एक T सेल उत्पाद इन खुले प्रदर्शनों संग्रह स्रोत से उत्पन्न नहीं किया जा सकता है। पुनर्योजी चिकित्सा तकनीकों, अर्थात् प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSC) प्रौद्योगिकी का उपयोग करके, यह सेल आधारित चिकित्सा15में उपयोग के लिए प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं की भारी संख्या का उत्पादन करने के लिए संभव हो सकता है।
hiPSCs आत्म-नवीनीकरण, असीम विस्तार, और शरीर में किसी भी प्रकार के दैहिक सेल में अंतर करने की क्षमता के लिए अपनी क्षमता में pluripotent ESCs के समान हैं; हालांकि, वे नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए भ्रूण मूल के उत्पादों के उपयोग के आसपास नैतिक चिंताओं की कमी है. इसके अलावा, hiPSCs व्यक्तिगत दवा के लिए सेल उत्पादों के विकास की अनुमति, किसी भी दैहिक सेल से उत्पादन किया जा सकता है। पिछली रिपोर्टों में, hiPSCs मानव टी कोशिकाओं से पूरे परिधीय मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं का उपयोग कर उत्पादन किया गया है, CD3+ कोशिकाओं, या अलग साइटोटॉक्सिक टी लिम्फोसाइटों (CTLs) एक स्रोत के रूप में18,19,22, 26जब hiPSCs एक टी सेल स्रोत (T-iPSCs) से उत्पन्न कर रहे हैं, मूल TCR जीन पुनर्व्यवस्थित विरासत में मिला है. इसलिए, रोगी टी-iPSC व्युत्पन्न टी कोशिकाओं एक मरीज के अलग कैंसर प्रतिजनों को लक्षित करके व्यक्तिगत अधिनियम उपचार के लिए एक मॉडल प्रदान कर सकते हैं।
मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं के टी वंश कोशिकाओं में भेदभाव दो चरणों में विभाजित है: hematopoietic जनक कोशिकाओं की पीढ़ी (HPCs)27 और टी वंश कोशिकाओं में उनके आगे भेदभाव21. दोनों चरणों OP9/DLL1 सह संस्कृति प्रणाली का उपयोग कर पूरा किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि ओपी 9/डीएलएल1 फीडर सेल की गुणवत्ता टी सेल भेदभाव की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है। चूंकि OP9/DLL1 कोशिकाओं एक अमर समरूप सेल लाइन नहीं हैं, FBS और संस्कृति की स्थिति की गुणवत्ता HIPSC भेदभाव का समर्थन करने की क्षमता खोने के बिना अपने विस्तार को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण हैं. इसलिए, यह FBS और मार्ग के बहुत से पूर्व मूल्यांकन करने के लिए सिफारिश की है लगातार जब सेल से सेल कोशिका द्रव्यीय संपर्क होने के लिए शुरू होता है, ताकि सेल भेदभाव और जीर्णता को रोकने के लिए. ध्यान में रखने के लिए एक बिंदु यह है कि सेल से सेल संपर्क चरण कंट्रास्ट और माइक्रोस्कोप के आवर्धन के आधार पर पृष्ठभूमि से अविवेच्य प्रकट कर सकते हैं. हमारे अनुभव में, सबसे OP9/DLL1 व्यंजन 80% confluent जब पारित करने के लिए तैयार दिखाई देगा.
यह दिखाया गया है कि OP9/DLL1 सह-संस्कृति द्वारा टी-आई पी एस सी से उत्पन्न अलग-अलग टी वंश कोशिकाओं उत्तेजना18,19पर CD8+ एसपी टी कोशिकाओं का उत्पादन कर सकते हैं। तथापि, पुनरुज्जीवित CD8+ SP T कोशिकाएं सहज-जैसे CD8 की प्राप्ति करती हैं - होमोडीमर22,28, जो TCR संकेत29के लिए एक अप्रभावी सह-ग्राही है।  इसके अतिरिक्त, इन पुनर्जीवित CD8+ एसपी टी कोशिकाओं मजबूत TCR स्वतंत्र cytotoxicity दिखाया है, इन कोशिकाओं नैदानिक उपयोग के लिए प्रतिकूल बना30. यह प्रोटोकॉल हाल ही की एक विधि का वर्णन करता है जिसमें शुद्ध CD4+CD8+ डीपी कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए एक अधिक पारंपरिक फीनोटाइप और बेहतर प्रतिजन-विशिष्ट साइटोटॉक्सिसिटी22के साथ CD8 ]+ एसपी टी कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए एक हाल ही की विधि का वर्णन करता है। हालांकि माध्यमिक टीआरआर के कारण प्रतिजन विशिष्टता की हानि - एलीलिक पुनर्व्यवस्थित लंबे समय तक लंबी अवधि की संस्कृति के बाद डीपी चरण में होती है, यह टी-आईपीएससी31में जीनोम संपादन द्वारा दूर किया जा सकता है।  हमारे अनुभव में, HIPSC व्युत्पन्न डीपी सेल संस्कृति के 30 - 35 दिन पर प्रदर्शित करने के लिए शुरू, और इन नव उत्पन्न डीपी कोशिकाओं अभी तक माध्यमिक TCR] पुनर्व्यवस्था नहीं आया है. इसलिए, दिन पर सबसे अधिक डीपी कोशिकाओं 35 प्रतिजन विशिष्टता बनाए रखने और प्रतिजन-विशिष्ट CD8]+ एसपी टी कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
मानव विरोधी CD3 और विरोधी CD28 उत्तेजना से पहले दिन 35, CD4-CD8- डीएन कोशिकाओं को संस्कृति से हटा दिया जाना चाहिए, के रूप में इन CD4 + CD8+डीपी कोशिकाओं उत्तेजना22के बाद प्रत्यक्ष हत्या का कारण प्रदर्शन किया गया है . CD4 चुंबकीय मनका संवर्धन का उपयोग करना (चरण 3.10) डीपी और CD4+CD8- मध्यवर्ती एकल सकारात्मक (आईएसपी) कोशिकाओं1,जो हम कोई नकारात्मक प्रभाव22है दिखाया गया है के लिए समृद्ध होगा. वैकल्पिक रूप से, प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा फ्लोरोसेंट-सक्रिय सेल छँटाई डीपी कोशिकाओं को अलग करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, चुंबकीय मनका जुदाई पसंद किया जाता है क्योंकि यह प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा प्रेरित यांत्रिक तनाव से बचा जाता है।
सीडी8 की पीढ़ी+ एसपी टी कोशिकाओं मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं से सक्रियण के बिना मध्यस्थता एगोनिस्ट चयन बाद में 3 डी murine stromal सेल संस्कृति32के उपयोग से प्रदर्शन किया गया है. तथापि, शारीरिक सकारात्मक चयन स्व-पेप्टाइड-एमएचसी परिसरों के साथ टीसीआर की अन्योन्यक्रिया पर निर्भर करता है, जो विशिष्ट रूप से संसाधित होते हैं और थाइमिक कॉर्टिकल उपकला कोशिकाओं द्वारा प्रस्तुत किए जातेहैं। इसके अलावा, चयन पेप्टाइड्स के लिए टीसीआर आत्मीयता परिपक्व CD8 के बाद कार्यात्मक क्षमताओं का निर्धारण करने के लिए दिखाया गया है] + एसपी टी कोशिकाओं34.  वर्तमान में, वहाँ कोई सबूत नहीं है सुझाव है कि एक पायदान stromal सेल आधारित सह संस्कृति प्रणाली परिभाषित चयन पेप्टाइड और MHC जटिल शारीरिक सकारात्मक चयन के लिए आवश्यक प्रदान कर सकते हैं.
यह पहले एक murine मॉडल में सूचित किया गया है कि टी वंश कोशिकाओं ट्यूमर प्रतिजन-विशिष्ट टी सेल व्युत्पन्न hiPSCs से उत्पन्न OP9/DLL1 अकेले पारंपरिक परिपक्वता का अनुभव करने में विफल. तथापि, ओपी 9/DLL1 प्रणाली द्वारा उत्पन्न iPSC व्युत्पन्न अपरिपक्व टी कोशिकाओं को 3 डी संस्कृति प्रणाली 28,35में आगे शारीरिक थाइमिक शिक्षा द्वारा भोली-जैसे टी कोशिकाओं में परिपक्व हो सकता है। इसलिए, IPSC व्युत्पन्न अपरिपक्व टी कोशिकाओं OP9/DLL1 प्रणाली द्वारा उत्पन्न उत्पादन करने के लिए यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल के साथ vivo में लंबी अवधि के हठ में सक्षम वास्तविक मानव ट्यूमर प्रतिजन-विशिष्ट पोस्ट-थाइमिक टी कोशिकाओं उत्पन्न करने के लिए आगे के प्रयासों के लिए महत्वपूर्ण है स्थापित संवहनी ट्यूमर का इलाज करने के लिए दक्षता।

शारीरिक लाभ के अलावा, टी कोशिकाओं कई संभावित चिकित्सीय अनुप्रयोगों है. इन विट्रो में टी कोशिकाओं की पीढ़ी और विस्तार रोग मॉडलिंग और चिकित्सीय सत्यापन के साथ-साथ वंशानुगत और प्राप्त इम्यूनोडेफिशियेंसी राज्यों के लिए उपचार का एक स्रोत के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (यानी, वायरल इम्यूनोडिब्लियोब्लियोब्लियोब्लियोब्लियोफिकेशन और लिम्फोडेफिकेशन माध्यमिक करने के लिए रसायन चिकित्सा या प्रत्यारोपण) और कैंसर के उन्मूलन के लिए. यह बाद की गुणवत्ता उन्नत कैंसर1के साथ रोगियों के उपचार के लिए दत्तक टी सेल हस्तांतरण (ACT) के विकास के लिए प्रेरित किया है.
अधिनियम एक रोगी के ट्यूमर resecting के होते हैं, ट्यूमर घुसपैठ लिम्फोसाइटों (TILs) निकालने, TILs पूर्व vivo का विस्तार, तो रोगी2में विस्तारित कोशिकाओं reinfusing. यह मेटास्टैटिक कैंसर के साथ कुछ रोगियों के लिए एक प्रभावी उपचार मोडलिटी होना दिखाया गया है.  दुर्भाग्य से, नहीं सभी रोगियों को इस चिकित्सा का जवाब. पिछली रिपोर्टों से पता चला है कि स्थानांतरित कोशिकाओं3,4,5,6,7,8,9, बड़ी संख्या के उपयोग की विभेदक स्थिति अत्यधिक समृद्ध कैंसर प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओंकी 10, और हस्तांतरण के बाद टी कोशिकाओं के हठ11,12 सभी अधिक टिकाऊ प्रतिक्रियाओं के साथ सहसंबद्ध हैं13,14. इसलिए, जब अधिनियम एक विरोधी ट्यूमर प्रतिक्रिया प्राप्त करने में विफल रहता है, यह भाग में कैंसर प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं की कम उपज के कारण हो सकता है, अक्षम ex vivo विस्तार थकावट और प्रतिक्रियाशील क्लोन की हानि के लिए अग्रणी, या हस्तांतरण के बाद हठ की कमी4 . यह माना गया है कि इन बाधाओं को इन बाधाओं को इन विट्रो15,16में कम विभेदित कैंसर प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं की बड़ी संख्या से दूर किया जा सकता है .
Hematopoietic स्टेम / जनक कोशिकाओं (HSPCs) इन विट्रो टी सेल पीढ़ी के लिए एक पारंपरिक स्रोत हैं, हालांकि इस विधि एक एकल दाता1से बरामद करने में सक्षम कोशिकाओं की छोटी संख्या द्वारा सीमित है. भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ESCs) भी टी कोशिकाओं का उत्पादन करने के लिए दिखाया गया है, लेकिन कम उपज के साथ17, यह नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए अक्षम बना रही है. इसके अलावा, के बाद से टी वंश कोशिकाओं प्रारंभिक विकासात्मक चरणों में अपने टी सेल रिसेप्टर्स (टीआरसी) के stochastic आनुवंशिक पुनर्संयोजन का अनुभव, यह आगे जीनोमिक बिना प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं की एक शुद्ध आबादी उत्पन्न करने के लिए HSPCs या ESCs का उपयोग करने के लिए संभव नहीं है टीसीआर जीन ट्रांसडक्शन जैसे संशोधन।
इन गुफाओं पर काबू पाने के लिए एक दृष्टिकोण मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs) के लिए TILs reprogram है, जो इन विट्रो टी सेल पीढ़ी के लिए एक असीम स्रोत प्रदान कर सकते हैं. यह दिखाया गया है कि कैंसर प्रतिजन-विशिष्ट TILs hiPSCs में reprogrammed किया जा सकता है और टी सेल वंश है, जो मूल टी सेल18,19के रूप में एक ही टी सेल रिसेप्टर (TCR) जीन पुनर्व्यवस्थित बरकरार रखता है के लिए फिर से अलग .  इस विस्तार अधिनियम के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि व्यक्तिगत रोगी ट्यूमर अद्वितीय उत्परिवर्तन प्रोफाइल है, और बहुत कुछ कैंसर प्रतिजनों के रोगियों के बीच साझा करने के लिए दिखाया गया है20. इसलिए, HIPSC व्युत्पन्न टी कोशिकाओं के इन विट्रो पीढ़ी के लिए एक स्रोत के रूप में कैंसर प्रतिजन-विशिष्ट TILs का उपयोग मेटास्टैटिक कैंसर के साथ रोगियों के व्यक्तिगत उपचार के लिए एक नई रणनीति प्रदान कर सकते हैं.
यहाँ विस्तार से प्रस्तुत OP9/DLL1 सह-संस्कृति प्रणाली का उपयोग करके कार्यांकित प्रतिजन-विशिष्टCD8] + एकल धनात्मक (एसपी) टी कोशिकाओं में hiPSC व्युत्पन्न टी वंश कोशिकाओं को विभेदित करने के लिए एक प्रोटोकॉल है। इस विधि hiPSCs के इन विट्रो टी सेल भेदभाव के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है, hematopoietic संतान, और भ्रूण स्टेम कोशिकाओं, साथ ही पुनर्योजी चिकित्सा और सेल आधारित चिकित्सा में उनके आगे अनुप्रयोगों.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >10 cm dish</td>
			<td >Corning, Inc.&#160;</td>
			<td >353003</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD3, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 561812, RRID:AB_1089628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD34, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >Cat# 348791, RRID:AB_400381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD4, human</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td>Cat# 344612, RRID:AB_2028479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD43, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >Cat# 560198, RRID:AB_1645460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD7, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 555361, RRID:AB_395764</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD8a, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 555369, RRID:AB_398595</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD8b, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >Cat# 641057, RRID:AB_1645747</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-TCRb, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >Cat# 555548, RRID:AB_395932</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD28 human monoclonal antibody (15E8), pure functional grade</td>
			<td >Miltenyl Biotec</td>
			<td>130-093-375</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD3 human monoclonal antibody (OKT3), pure functional grade</td>
			<td >Miltenyl Biotec</td>
			<td>130-093-387</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD4 Microbeads, human</td>
			<td >Miltenyl Biotec</td>
			<td >130-045-101</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell strainer 100 um</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >22-363-549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td >Gemini</td>
			<td >100-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Flt-3 ligand</td>
			<td >R&#38;D Systems</td>
			<td >427-FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gelatin Solution 2%&#160;</td>
			<td>SIGMA-Aldritch</td>
			<td>G1393-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GlutaMAX (100X)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >35050-061</td>
			<td >L-Glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HBSS Mg+Ca+ Phenol-Red Free</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Interleukin-2</td>
			<td >R&#38;D Systems</td>
			<td >202-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Interleukin-7</td>
			<td >R&#38;D Systems</td>
			<td >407-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >iTAG MHC Tetramer HLA-A*0201 Mart1 Tetramer -ELAGIGILTV</td>
			<td >MBL</td>
			<td >Cat#TB-0009-2</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mart1-hiPSC</td>
			<td >Vizcardo et al., Cell Stem Cell 2013</td>
			<td >RIKEN-IMS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Melan-A, MART 1 (26-35)</td>
			<td >InnoPep</td>
			<td >3146-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#945;MEM powder</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >61100061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C57BL/6 MEF MITC-TREATED 4M EACH; A34962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >OP9/N-DLL1</td>
			<td >Riken Bioresource center</td>
			<td >Cat# RCB2927; RRID:CVCL_B220</td>
			<td >OP9/DLL1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/streptomycin</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate buffered saline pH 7.4 (1x)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primate ES Cell Medium</td>
			<td >Reprocell</td>
			<td >RCHEMD001</td>
			<td >Human ESC Culture Media</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rhok inhibitor (Y-27632 dihydrochloride)</td>
			<td >Tocris</td>
			<td >1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RPMI 1640</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td >R&#38;D Systems</td>
			<td >455-MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >StemPro</td>
			<td >EZPassage</td>
			<td >23181-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T2-tumor</td>
			<td >ATCC</td>
			<td>T2 (174 x CEM.T2) (ATCC&#174; CRL-1992&#8482;)&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red&#160;</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red&#160;</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >U Bottom 96 well plate</td>
			<td >Corning, Inc.&#160;</td>
			<td >3799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using human induced pluripotent stem cells for the generation of tumor antigen-specific t cells

इन विट्रो में कार्यात्मक टी कोशिकाओं की पीढ़ी और विस्तार नैदानिक अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। ऐसा ही एक प्रयोग उन्नत कैंसर वाले रोगियों के उपचार के लिए है। अत्यधिक समृद्ध ट्यूमर प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं के दत्तक टी सेल स्थानांतरण (ACT) कुछ रोगियों में मेटास्टैटिक कैंसर के टिकाऊ प्रतिगमन के कारण दिखाया गया है. हालांकि, विस्तार के दौरान, इन कोशिकाओं को समाप्त हो सकता है या sencentcent, उनके effector समारोह और vivo में दृढ़ता सीमित. प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSC) प्रौद्योगिकी कम विभेदित ट्यूमर प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं की बड़ी संख्या के इन विट्रो पीढ़ी में अग्रणी द्वारा इन बाधाओं को दूर कर सकते हैं. मानव iPSC (hiPSC) एक टी सेल एक प्रारंभिक सेल के रूप में प्रयोग किया जाता है जब मूल टी सेल रिसेप्टर (टीसीआर) जीनोमिक पुनर्व्यवस्था बनाए रखने, जो लिम्फोसाइटों सहित दैहिक सेल के किसी भी प्रकार में अंतर करने की क्षमता है। इसलिए, मानव ट्यूमर प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं के hiPSC करने के लिए reprogramming टी सेल वंश के लिए redifferentiation के बाद कायाकल्प ट्यूमर प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं का उत्पादन करने की क्षमता है. यहाँ वर्णित OP9/DLL1 सह संस्कृति प्रणाली का उपयोग कर HIPSC से ट्यूमर प्रतिजन-विशिष्ट CD8 ]+ एकल सकारात्मक (एसपी) टी कोशिकाओं पैदा करने के लिए एक विधि है। इस विधि इन विट्रो टी सेल वंश पीढ़ी के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है और इन विट्रो व्युत्पन्न टी कोशिकाओं के विकास की सुविधा के लिए पुनर्योजी चिकित्सा और सेल आधारित चिकित्सा में उपयोग के लिए होगा.

13 दिनों के बाद HIPSCs OP9/DLL1, CD34+CD43+ hematopoietic जनक कोशिकाओं के साथ सह-रचना दिखाई दिया (चित्र 1) . एचएससीएफ, एचएएलटी3एल, और आईएल-7 की उपस्थिति में गैर-जेलेटिनाइज्ड OP9/DLL1 पर संस्कृति के एक अतिरिक्त 22 दिनों के बाद, हीमाटोपोइटिक संतति सीडी 3 + सीडी7+सीडी 4+सीडी 4+सीडी 8+ डबल सकारात्मक (डीपी) टी वंश कोशिकाओं, जिनमें से अधिकांश ने एम.टी.आर. को एम.टी.-1 एपिटोप (टेट्रामर) के लिए विशिष्ट व्यक्त किया (चित्र 2)।
यह पहले से पता चला है कि CD8+ एसपी टी कोशिकाओं CD4 से प्रेरित किया जा सकताहै +CD8+ डीपी टी कोशिकाओं टीसीआर एगोनिस्ट पेप्टाइड या एंटीबॉडी चालित TCR उत्तेजना के माध्यम से संकेत द्वारा24,25. इसलिए, संस्कृति के 35 दिन, hiPSC व्युत्पन्न CD4+CD8+ डी पी टी कोशिकाओं विरोधी मानव CD3 और विरोधी मानव CD28 एंटीबॉडी के साथ हिसिल-7 और आईएल-2 की उपस्थिति में प्रेरित किया गया.  उत्तेजना के चार दिनों के बाद, CD3 की संख्या+CD8] + सपा कोशिकाओं नाटकीय रूप से वृद्धि हुई है और MART-1 epitope के लिए विशिष्ट बने रहे, उनके विरासत में मिला प्रतिजन विशिष्टता के संरक्षण की पुष्टि ( चित्र3).
HIPSC व्युत्पन्न CD8 के कार्यात्मक गुणों का निर्धारण करने के लिए+ SP T कोशिकाओं, प्रतिजन पर निर्भर सक्रियण और इंटरफेरॉन गामा के स्राव (IFN-जेड) का विश्लेषण किया गया था। 1 सप्ताह के लिए विरोधी मानव CD3 और विरोधी मानव CD28 एंटीबॉडी के साथ उत्तेजना के बाद, hiPSC व्युत्पन्न CD8]+ एसपी टी कोशिकाओं एक सेल सॉर्टर का उपयोग कर अलग कर रहे थे और सह T2 सेल लाइन के साथ खेती HLA-A * 02:01 के साथ या बिना cognate MART1 पेप्टाइड के लिए 16 - 20 एच. ELISpot परख से पता चला है कि HIPSC व्युत्पन्न CD8] + एसपी टी कोशिकाओं की तुलना में IFN-जेड की उच्च मात्रा स्रावित, जब MART-1 पेप्टाइड की उपस्थिति में सुसंस्कृत. IFN-जेड अभिव्यक्ति केवल टी कोशिकाओं और APCs के लिए शून्य था, यह दर्शाता है कि मानव टी-iPSC व्युत्पन्न टी कोशिकाओं प्रतिजन-विशिष्ट और कार्यात्मक हैं (चित्र 4)।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59997/59997fig1.jpg"> चित्र 1: HIPSC व्युत्पन्न हेमेटोपोएटिक जनक कोशिकाओं का उत्पादन। (ए) ओपी 9/DLL1 सह-संस्कृति का उपयोग करते हुए हेमेटोपोइटिक वंश के लिए HIPSCs के भेदभाव का योजनाबद्ध अवलोकन। (बी)दिन 1 (ऊपर बाएं), 3 (ऊपर दाएं), 7 (नीचे बाएं), और 13 (नीचे दाएं) पर HIPSC व्युत्पन्न संरचनाओं की उपस्थिति। स्केल बार्स ] 100 डिग्री मी. (सी) प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण hiPSC व्युत्पन्न CD34+CD43+ hematopoietic जनक कोशिकाओं पर दिन 13. डेटा छह स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं (द $ 1 से 2)। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59997/59997fig1large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59997/59997fig2.jpg"> चित्र 2: HIPSC भेद में Mart1+ CD4+CD8 ]+ डी पी टी टी कोशिकाओं| (ए) ओपी 9/DLL1 सह-संस्कृति का उपयोग करके अपरिपक्व टी कोशिकाओं के लिए HIPSC व्युत्पन्न हेमेटोपोइटिक वंश के भेदभाव का योजनाबद्ध अवलोकन। (B)सीडी 4 बनाम सीडी8 जेड, सीडी 3 बनाम सीडी 8 जेड, और HIPSC व्युत्पन्न टी कोशिकाओं में MART-1 टेट्रामर अभिव्यक्ति का प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण 35 दिन। लिम्फोसाइटों, एकल कोशिकाओं, पीआई नकारात्मक पर gated. डेटा तीन स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं (द $ 3 - 8)। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59997/59997fig2large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59997/59997fig3.jpg"> चित्र 3: सीडी8 का प्रेरण़ ़ ़ ़ SP T सेल फीनोटाइप| CD4 के प्रवाह cytometric विश्लेषण- hiPSC व्युत्पन्न टी कोशिकाओं 4 दिन मानव विरोधी CD3 और मानव विरोधी CD28 एंटीबॉडी संचालित उत्तेजना के बाद. लिम्फोसाइटों, एकल कोशिकाओं, पीआई ऋणात्मक (द ] 4) पर गेट किया गया।   <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59997/59997fig3large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59997/59997fig4.jpg"> चित्र 4: HIPSC व्युत्पन्न CD8की एंटीजन विशिष्टता ]+ SP T कोशिकाओं| आईएफएन-जेड स्राव HIPSC व्युत्पन्न CD8 की परखद्वारा + SP, CD8] + SP, और थोक टी कोशिकाओं के बाद 20 h सह-संस्कृति के साथ या बिना T2 कोशिकाओं स्पंदित (या नहीं) MART-1 पेप्टाइड के साथ। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59997/59997fig4large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>

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Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

यह आलेख एक विधि का वर्णन करता है कार्यात्मक ट्यूमर प्रतिजन-विशिष्ट प्रेरित pluripotent स्टेम सेल व्युत्पन्न CD8 ]+ एक सकारात्मक टी कोशिकाओं OP9/DLL1 सह संस्कृति प्रणाली का उपयोग कर उत्पन्न करने के लिए.

ट्यूमर एंटीजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं की पीढ़ी के लिए मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल का उपयोग करना

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

ली-Fraumeni सिंड्रोम रोगी-व्युत्पंन प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल का उपयोग ऑस्टियो मॉडलिंग

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

एक तीन आयामी Thymic संस्कृति प्रणाली Murine प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल व्युत्पन्न ट्यूमर Antigen-विशिष्ट थाइमिक उत्प्रवासियों उत्पन्न करने के लिए

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

इन विट्रो में के वास्तविक समय का पता लगाने ट्यूमर सेल Apoptosis सीडी 8 द्वारा प्रेरित+ टी कोशिकाओं ट्यूमर घुसपैठ माइलॉयड कोशिकाओं की प्रतिरक्षा दमन कार्यों का अध्ययन करने के लिए

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

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दत्तक इम्यूनोथेरेपी के लिए विनिर्माण चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर (सीएआर) टी कोशिकाएं

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Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

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Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis

जेब्राफिश लार्वाल Xenografts और ट्यूमर व्यवहार विश्लेषण की पीढ़ी

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly ...

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चूहों में ट्यूमर-घुसपैठ सीडी 8 + टी कोशिकाओं की गतिशीलता का आकलन करने के लिए ट्यूमर प्रत्यारोपण

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

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Vivo में इम्युनोजेनेसिटी स्प्लेनिक टी कोशिकाओं के प्रवाह Cytometry द्वारा ट्यूमर व्युत्पन्न बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं की स्क्रीनिंग

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...