Name: using human induced pluripotent stem cells for the generation of tumor antigen-specific t cells
Uploaded: 2019-10-24T13:00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells at JoVE.com

Vi takker Alan B. Hoofring og Erina H. Han for grafisk assistanse. Denne forskningen ble støttet av intramural Research program ved National Cancer Institute (ZIA BC010763) og intramural NCI Cancer Moonshot Initiative for Cell-baserte Cancer immunterapi.

1. dyrking Human iPSCs (hiPSCs) på Mouse embryonale fibroblaster (MEF)
Merk: Alternative metoder for dyrking hiPSCs kan også brukes, inkludert men ikke begrenset til: seeding på en 6 brønn plate pre-belagt med gelatin, en geléaktige protein blanding, rekombinant laminin 511, eller noen annen ekstracellulære matrise brukes i hiPSC ekspansjon, og kultivert ved hjelp av definerte medier spesielt formulert for humant pluripotent Stamcelle kultur.
<ol><li>
Dyrking MEF
	<ol>
<li>Coat en 10 cm cellekultur Petri parabolen med 4 mL 0,1% gelatin og ruge i 30 min ved 37 ° c.</li>
		<li>Tin et hetteglass med 4 x 106 bestrålt MEF raskt inn i 10 ml 37 ° c MEF Media (DMEM + 10% FBS + 1x penicillin-Streptomycin + 1x L-glutamin supplement). Sentrifuger ved 300 x g for 5 min ved 4 ° c. Aspirer supernatanten og resuspend celle pellet i 9 mL MEF Media.</li>
		<li>Fjern gelatin-belagt parabolen fra inkubator. Aspirer gelatin og tilsett 7 mL MEF Media. Plate 3 mL MEF suspensjon (fra trinn 1.1.2) på gelatin-belagt parabolen. Rock parabolen side-til-side og front-to-back for å sikre jevn fordeling av MEF over parabolen. Ruge ved 37 ° c for 8-36 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Passaging hiPSC på MEF Merk: dataene ble generert ved hjelp av Mart-1 IPSC avledet fra langsiktige kultivert MELANOM til, som spesifikt ANERKJENNER Mart-1 peptid i sammenheng med HLA-A * 02:01, som tidligere beskrevet18.<ol>
<li>Passage hiPSCs når koloniene er mellom 0,8-1,2 mm i diameter. Før passaging, sjekk hiPSC kolonier i et stereo-mikroskop og fjerne eventuelle områder av differensiering fra kulturen ved hjelp av plast kanten av en 200 μL spissen.</li>
		<li>Aspirer tilbrakte medier og legge til 10 mL hiPSC Media (human ES kultur Media [tabell av materialer] + 10 ng/ml Human Basic Fibroblast vekstfaktor [hbFGF]) supplert med 10 μM rock inhibitor.</li>
		<li>Hold cellen kultur parabolen i den ene hånden og rull en en gangs celle passaging verktøy over hele fatet i én retning. Påfør nok trykk slik at hele valse bladet berører kultur fatet og opprettholde et jevnt trykk under rullende handling.</li>
		<li>Roter kultur parabolen 90 ° og gjenta trinn 1.2.3. Se platen i mikroskopet for å visuelt bekrefte riktig skjæring av koloniene, som skal vises rutete. Løsne snitt koloniene med skånsom mekanisk spyling ved hjelp av en 200 μL pipetter. Merk: Avløsning av skjære kolonier ved mekanisk spyling må gjøres umiddelbart etter kutte kolonier med valsen, fordi etter 3 min kuttet koloniene vil begynne å feste til parabolen, og det vil bli vanskelig å løsne kolonier av homogen størrelse ved Flushing.</li>
		<li>Transfer 350-600 klumper av skjære kolonier på en ny 10 cm rett av MEF (belagt 8-36 h før hiPSC passaging) med 10 mL fersk hiPSC Media supplert med 10 μM ROCK inhibitor. Ruge ved 37 ° c. Merk: 600 klumper representerer ca 1,0 x 106 Mart-1 IPSC og vil gi 0,5-1,0 x 106 DP celler på dag 35. Forventet antall vil imidlertid variere avhengig av styrken på Start cellelinjen og kultur forholdene.</li>
		<li>Dagen etter brukte aspirer Media og tilsett 10 mL fersk hiPSC Media. Endre hiPSC medier hver 1-2 dager avhengig av hiPSC vekstrate.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. utarbeidelse av OP9/DLL1 celler for co-kultur med hiPSCs
<ol><li>Kultur OP9/DLL1 celler i OP9 Media [α-minimum essensielle medium (α-MEM) + 20% fosterets storfe serum (FBS) + 1x penicillin-Streptomycin] ved 37 ° c. Når OP9/DLL1 celler nå confluency, aspirer Media og vask en gang med 5 mL 1x magnesium, kalsium, og fenol rød-fri fosfat bufret saltvann (PBS).</li>
	<li>Aspirer PBS og tilsett 2 mL 0,05% Trypsin-EDTA.  Ruge for 5 min ved 37 ° c. Deretter legger du til 4 mL OP9 Media og mekanisk distansere celle laget ved pipettering å gjøre en enkelt celle suspensjon.</li>
	<li>Overfør celle fjæringen til et 50 mL konisk rør gjennom et 100 μm celle sil for å unngå celle klumper. Sentrifuger ved 300 x g for 5 min ved 4 ° c. Aspirer supernatanten og resuspend i 12 mL OP9 medium.</li>
	<li>Tilsett 8 mL OP9 Media til hver av seks nye 10 cm cellekultur Petri retter. Tallerken 2 mL OP9/DLL1 celle fjæring fra trinn 2,3 på hver nye 10 cm rett. Rock parabolen side til side deretter front-to-back for å sikre jevn fordeling av OP9/DLL1 over parabolen.</li>
	<li>Ruge ved 37 ° c. Gjenta passasje hver 2-3 dager når cellene nå confluency. Merk: Det er viktig å gjøre nok frosset lager av OP9/DLL1 celler og tine et nytt lager hver 4-6 uker.</li>
</ol>3. in vitro differensiering av hiPSCs i CD8αβ+ single positive (SP) T celler
<ol><li>Forbered gelatinized OP9/DLL1 retter en uke før co-kultur med hiPSCs. For å forberede 0,1% gelatin løsning, tilsett 5 mL romtemperatur (RT) tissue-grade lager gelatin løsning til 500 mL PBS.
	<ol>
<li>Coat 3 nye 10 cm cellekultur Petri retter ved å legge til 4 mL per tallerken med 0,1% gelatin.  Ruge 30 min ved 37 ° c.</li>
		<li>Aspirer gelatin og tilsett 8 mL OP9 medium til hver tallerken. Passage en confluent parabolen av OP9/DLL1 (som gjort i § 2 ovenfor) til tre gelatin pre-belagt retter.</li>
	</ol></li>
	<li>Etter 4 dager, tilsett 10 mL OP9 Media til hver 10 cm rett av OP9/DLL1 på gelatin, for totalt 20 mL Media per tallerken.</li>
	<li>Etter 7-8 dager, begynner hiPSC co-kulturen på OP9/DLL1 confluent retter (differensiering dag 0).
	<ol>
<li>Aspirer tilbrakte medier fra confluent 10 cm rett av hiPSCs på MEF. Tilsett 10 mL OP9 medium. Klipp ut og løsne hiPSC kolonier ved hjelp av en en gangs celle passaging verktøy som gjort i trinn 1.2.3 og 1.2.4.</li>
		<li>Overfør 350-600 klumper av snitt kolonier til en 10 cm pre-gelatinized OP9/DLL1-tallerken (trinn 3,1) med 10 mL fersk OP9-medium ved hjelp av en 200 μL-pipette. Rock kulturen parabolen side-til-side deretter front-to-back for å sikre jevn fordeling av kolonier. Merk: Alternativt kan pre-formet hiPSC embryoid organer (EBs) eller liten klump suspensjon brukes.  Men bruken av en en gangs celle passaging verktøy eller EB formasjon systemet foretrekkes å produsere hiPSC klumper av uniform størrelse.</li>
	</ol></li>
	<li>På dag 1, aspirer brukt Media og erstatte med 20 mL fersk OP9 Media. hiPSC klumper co-kultivert på OP9/DLL1 for 1 dag vises som små runde monolag kolonier (figur 1).</li>
	<li>På dag 5, aspirer 10 mL brukte medier og tilsett 10 mL fersk OP9 Media. hiPSC kolonier vil begynne å differensiere til primitive mesoderm, som er preget av en flerlags mørkt senter.</li>
	<li>På dag 9, aspirer 10 mL brukte medier og tilsett 10 mL fersk OP9 Media. På dette punktet, flerlags sentrum strukturer vil utvikle seg til kuppel-lignende former, og en perifer nettverk-lignende område vil begynne å bli tydelig.</li>
	<li>På dag 13, høste blodkreft stamceller (HPCs) (figur 1). hiPSC-avledet strukturer på dag 13 er preget av en mørk sentral organoid omgitt av et nettverk av kuppel-lignende områder, representant for blodkreft soner (HZs) tidligere rapportert å legge menneskelige embryonale Stamcelle-avledet blodkreft forfedre 21i denne. Merk: tilstedeværelsen av kuppelen-lignende strukturer indikerer en vellykket prosess selv i fravær av mørke sentre. Manglende evne til å produsere HPCs kan skyldes dårlig kvalitet på OP9/DLL1, kvaliteten på FBS mye, confluency av iPSC klumper seeded på OP9/DLL1 (350-600 klumper er optimal), og/eller variasjoner i styrken av iPSC linjer for å produsere blodkreft forløpere.<ol>
<li>Aspirer tilbrakte Media og vask 1x med 5 mL av 1x fenol rød-fri Hanks ' balansert saltløsning modifisert med kalsium og magnesium (HBSS).</li>
		<li>Aspirer HBSS og tilsett 250 μL av 5000 enheter/mL kollagenase IV i 10 mL HBSS. Ruge ved 37 ° c for 45 min. aspirer HBSS med kollagenase IV og vask en gang med 5 mL PBS.</li>
		<li>Aspirer PBS og tilsett 5 mL 0,25% Trypsin-EDTA. Ruge ved 37 ° c i 20 min. Deretter legger du til 4 mL OP9 Media og distansere celle laget ved pipettering å gjøre en enkelt celle suspensjon.</li>
		<li>Overfør celle fjæringen til et 50 mL konisk rør gjennom en celle sil på 100 μm.  Sentrifuger ved 300 x g i 5 min ved 4 ° c. Aspirer supernatanten og resuspend i 10 mL OP9 medium.</li>
		<li>Plate celle suspensjon på en ny gelatinized 10 cm celle-kultur Petri parabolen (se trinn 3.1.1 og 3.1.2). Ruge ved 37 ° c for 45 min. Deretter samler ikke-tilhenger celler ved milde pipettering.</li>
		<li>Overfør innsamlet celle suspensjon til et 50 mL konisk rør gjennom en 100 μm celle sil.  Sentrifuger ved 300 x g i 5 min ved 4 ° c. Aspirer den supernatanten og resuspend i 10 mL differensiering Media [OP9 Media med 5 ng/mL Human Stem Cell Factor (hSCF), 5 ng/mL Human Flt3 ligand (hFLT3L), og 5 ng/mL Human interleukin 7 (hIL-7)].</li>
		<li>Plate cellen suspensjon på en ny 10 cm OP9/DLL1 confluent parabolen.</li>
	</ol></li>
	<li>På dag 16, passasje cellene.
	<ol>
<li>Mekanisk løsne ikke-tilhenger celler ved milde pipettering og filter gjennom en 100 μm celle sil. Sentrifuger ved 300 x g for 5 min ved 4 ° c. Aspirer supernatanten og resuspend i 10 mL differensiering Media.</li>
		<li>Plate cellen suspensjon på en ny 10 cm OP9/DLL1 confluent parabolen.</li>
	</ol></li>
	<li>Fortsett passaging ikke-tilhenger celler hver 5-7 dager etterpå ved å gjenta trinn 3,8.</li>
	<li>På dag 35, beriker CD4+CD8+ Double positive (DP) befolkning og stimulere til å produsere CD8αβ+ SP T celler (figur 2).
	<ol>
<li>Mekanisk løsne ikke-tilhenger celler ved milde pipettering og Filtrer gjennom en 100 μm celle sil for å fjerne celle klumper. Berike CD4+ celle BEFOLKNINGEN ved CD4 magnetisk perle isolert i henhold til produsentens protokoll. Merk: begrunnelsen for å bruke CD4 magnetiske perler er å fjerne CD4-CD8- DN celler fra kulturen, da disse har blitt demonstrert for å forårsake direkte drap av CD4+CD8+ DP celler etter stimulering22.</li>
		<li>Count Live CD4 beriket celler ved hjelp av en Neubauer hemocytometer og Trypan blå farge.  Suspendere i OP9 medier ved total konsentrasjon 0,5 x 106 celler/ml. Alikvot 1 mL av celle suspensjonen (0,5 x 106 celler) i hver brønn av en vev kultur flat bunn 24 brønn plate av confluent OP9/DLL1.</li>
		<li>Legg 100 IE humant interleukin 2 (hIL-2), 5 ng/mL hIL-7, 500 ng/mL anti-humant CD3 antistoff, og 2 μg/mL anti-humant CD28 antistoff, deretter kultur ved 37 ° c.</li>
		<li>På dag 4-7 etter stimulering, samle celler for molekylær analyse (Figur 3) eller co-kultur med peptid-pulserende antigen presentere celler (APCs).</li>
	</ol></li>
</ol>4. måler antigen spesifisitet av hiPSC avledet CD8αβ+ SP T celler
Merk: Typen APCs som skal brukes for denne experiement, er avhengig av MHC-begrensningen for hiPSC-avledede T-celler. Her brukes T2 cellelinje, som er en hybrid av T og B lymphoblastoid cellelinjer. T2 celler uttrykke HLA-A * 02:0123, som er ANERKJENT av JKF6 celler som MART1-IPSC ble avledet18. Denne T2 cellelinjen kan utvides i RPMI 1640 + 20% FBS + 1x penicillin-Streptomycin og er passert når cellene når en tetthet på 5 x 105 celler/ml.
<ol><li>Count Live HLA-A * 02:01+ T-B hybrid lymphoblastoid T2 celler ved hjelp av en Neubauer Hemocytometer og Trypan blå fargestoff. Ruge APCs i 24 brønn vev kultur plate med 1 μg/mL MART-1 peptid for 2 t ved 37 ° c. Merk: Optimal peptid konsentrasjon er variabel, avhengig av cellelinje og antigen spesifisitet.</li>
	<li>Samle APCs og vask 2x med 10 mL PBS å fjerne eventuelle ekstra peptid.</li>
	<li>Count APCs og suspendere ved 2-5 x 105 celler/ml i OP9 media med 100 IU Il-2 og 5 ng/ml Il-7. Alikvot 100 μL av celle suspensjon (2-5 x 104 celler) i hver brønn av en ultra-lav vedlegg U bunnen 96 brønn plate eller direkte inn i en pre-belagt ELISpot plate.</li>
	<li>Sorter hiPSC-avledet CD8αβ+ SP T Cells (1 uke etter anti-humant CD3/CD28 antistoff stimulering) ved hjelp av en celle Sorter og suspendere ved 1 x 106 celler/ml i OP9 medier med 100 IU Il-2 og 5 ng/ml Il-7. Alikvot 100 μL av celle fjæring (1 x 105 celler) i hver brønn av APCs og kultur for 16-20 h ved 37 ° c.</li>
	<li>Etter 16-20 h, analysere cytokin sekresjon profil ved ELISpot analysen per produsentens protokoll (Figur 4).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brauer, P. M., Singh, J., Xhiku, S., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cell+Genesis:+In+Vitro+Veritas+Est.">T Cell Genesis: In Vitro Veritas Est.</a> Trends in Immunology. 37 (12), 889-901 (2016).</li><li>Rosenberg, S. A., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+cell+transfer+as+personalized+immunotherapy+for+human+cancer.">Adoptive cell transfer as personalized immunotherapy for human cancer.</a> Science. 348 (6230), 62-68 (2015).</li><li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquisition+of+full+effector+function+in+vitro+paradoxically+impairs+the+in+vivo+antitumor+efficacy+of+adoptively+transferred+CD8++T+cells.">Acquisition of full effector function in vitro paradoxically impairs the in vivo antitumor efficacy of adoptively transferred CD8+ T cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (6), 1616-1626 (2005).</li><li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Durable+complete+responses+in+heavily+pretreated+patients+with+metastatic+melanoma+using+T-cell+transfer+immunotherapy.">Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T-cell transfer immunotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).</li><li>Crompton, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+relationship+of+CD8(+)+T+cell+subsets+is+revealed+by+progressive+changes+in+the+epigenetic+landscape.">Lineage relationship of CD8(+) T cell subsets is revealed by progressive changes in the epigenetic landscape.</a> Cellular and Molecular Immunology. 13 (4), 502-513 (2016).</li><li>Henning, A. N., Klebanoff, C. A., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+stemness+in+T+cell+differentiation.">Silencing stemness in T cell differentiation.</a> Science. 359 (6372), 163-164 (2018).</li><li>Henning, A. N., Roychoudhuri, R., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+control+of+CD8(+)+T+cell+differentiation.">Epigenetic control of CD8(+) T cell differentiation.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (5), 340-356 (2018).</li><li>Vodnala, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+stemness+and+dysfunction+in+tumors+are+triggered+by+a+common+mechanism.">T cell stemness and dysfunction in tumors are triggered by a common mechanism.</a> Science. 363 (6434), (2019).</li><li>Restifo, N. P., Gattinoni, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+relationship+of+effector+and+memory+T+cells.">Lineage relationship of effector and memory T cells.</a> Current Opinion in Immunology. 25 (5), 556-563 (2013).</li><li>Tran, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunotherapy+based+on+mutation-specific+CD4++T+cells+in+a+patient+with+epithelial+cancer.">Cancer immunotherapy based on mutation-specific CD4+ T cells in a patient with epithelial cancer.</a> Science. 344 (6184), 641-645 (2014).</li><li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+arrests+effector+T+cell+differentiation+and+generates+CD8++memory+stem+cells.">Wnt signaling arrests effector T cell differentiation and generates CD8+ memory stem cells.</a> Nature Medicine. 15 (7), 808-813 (2009).</li><li>Gautam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+c-Myb+regulates+CD8(+)+T+cell+stemness+and+antitumor+immunity.">The transcription factor c-Myb regulates CD8(+) T cell stemness and antitumor immunity.</a> Nature Immunology. 20 (3), 337-349 (2019).</li><li>Klebanoff, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+successful+CD8++T-cell+adoptive+immunotherapy+for+large+established+tumors+in+mice.">Determinants of successful CD8+ T-cell adoptive immunotherapy for large established tumors in mice.</a> Clinical Cancer Research. 17 (16), 5343-5352 (2011).</li><li>Klebanoff, C. A., Gattinoni, L., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorting+through+subsets:+which+T-cell+populations+mediate+highly+effective+adoptive+immunotherapy.">Sorting through subsets: which T-cell populations mediate highly effective adoptive immunotherapy.</a> Journal of Immunotherapy. 35 (9), 651-660 (2012).</li><li>Crompton, J. G., Clever, D., Vizcardo, R., Rao, M., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+antitumor+immunity.">Reprogramming antitumor immunity.</a> Trends in Immunology. 35 (4), 178-185 (2014).</li><li>Crompton, J. G., Rao, M., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memoirs+of+a+reincarnated+T+cell.">Memoirs of a reincarnated T cell.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 6-8 (2013).</li><li>Kennedy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+lymphocyte+potential+marks+the+emergence+of+definitive+hematopoietic+progenitors+in+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+cultures.">T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures.</a> Cell Reports. 2 (6), 1722-1735 (2012).</li><li>Vizcardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+human+tumor+antigen-specific+T+cells+from+iPSCs+derived+from+mature+CD8(+)+T+cells.">Regeneration of human tumor antigen-specific T cells from iPSCs derived from mature CD8(+) T cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 31-36 (2013).</li><li>Nishimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+rejuvenated+antigen-specific+T+cells+by+reprogramming+to+pluripotency+and+redifferentiation.">Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 114-126 (2013).</li><li>Lo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+recognition+of+a+shared+p53+mutated+neoantigen+in+a+patient+with+metastatic+colorectal+cancer.">Immunologic recognition of a shared p53 mutated neoantigen in a patient with metastatic colorectal cancer.</a> Cancer Immunology Research. , (2019).</li><li>Timmermans, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+T+cells+from+human+embryonic+stem+cell-derived+hematopoietic+zones.">Generation of T cells from human embryonic stem cell-derived hematopoietic zones.</a> Journal of Immunology. 182 (11), 6879-6888 (2009).</li><li>Maeda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+CD8alphabeta+T+Cells+from+T-cell-Derived+iPSC+Imparts+Potent+Tumor+Antigen-Specific+Cytotoxicity.">Regeneration of CD8alphabeta T Cells from T-cell-Derived iPSC Imparts Potent Tumor Antigen-Specific Cytotoxicity.</a> Cancer Research. 76 (23), 6839-6850 (2016).</li><li>Salter, R. D., Howell, D. N., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+regulating+HLA+class+I+antigen+expression+in+T-B+lymphoblast+hybrids.">Genes regulating HLA class I antigen expression in T-B lymphoblast hybrids.</a> Immunogenetics. 21 (3), 235-246 (1985).</li><li>Snauwaert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+mature,+naive+antigen-specific+CD8(+)+T+cells+with+a+single+T-cell+receptor+by+agonist+selection.">In vitro generation of mature, naive antigen-specific CD8(+) T cells with a single T-cell receptor by agonist selection.</a> Leukemia. 28 (4), 830-841 (2014).</li><li>Takahama, Y., Suzuki, H., Katz, K. S., Grusby, M. J., Singer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+selection+of+CD4++T+cells+by+TCR+ligation+without+aggregation+even+in+the+absence+of+MHC.">Positive selection of CD4+ T cells by TCR ligation without aggregation even in the absence of MHC.</a> Nature. 371 (6492), 67-70 (1994).</li><li>Seki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+terminally+differentiated+circulating+T+cells.">Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (1), 11-14 (2010).</li><li>Vodyanik, M. A., Slukvin, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematoendothelial+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells.">Hematoendothelial differentiation of human embryonic stem cells.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2007).</li><li>Vizcardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Tumor+Antigen-Specific+iPSC-Derived+Thymic+Emigrants+Using+a+3D+Thymic+Culture+System.">Generation of Tumor Antigen-Specific iPSC-Derived Thymic Emigrants Using a 3D Thymic Culture System.</a> Cell Reports. 22 (12), 3175-3190 (2018).</li><li>McNicol, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8alpha/alpha+homodimers+fail+to+function+as+co-receptor+for+a+CD8-dependent+TCR.">CD8alpha/alpha homodimers fail to function as co-receptor for a CD8-dependent TCR.</a> European Journal of Immunology. 37 (6), 1634-1641 (2007).</li><li>Themeli, M., Riviere, I., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+cell+sources+for+T+cell+engineering+and+adoptive+immunotherapy.">New cell sources for T cell engineering and adoptive immunotherapy.</a> Cell Stem Cell. 16 (4), 357-366 (2015).</li><li>Minagawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+T+Cell+Receptor+Stability+in+Rejuvenated+iPSC-Derived+T+Cells+Improves+Their+Use+in+Cancer+Immunotherapy.">Enhancing T Cell Receptor Stability in Rejuvenated iPSC-Derived T Cells Improves Their Use in Cancer Immunotherapy.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 850-858 (2018).</li><li>Montel-Hagen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid-Induced+Differentiation+of+Conventional+T+Cells+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Organoid-Induced Differentiation of Conventional T Cells from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 376-389 (2019).</li><li>Takada, K., Kondo, K., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Peptides+That+Promote+Positive+Selection+in+the+Thymus.">Generation of Peptides That Promote Positive Selection in the Thymus.</a> Journal of Immunology. 198 (6), 2215-2222 (2017).</li><li>Takada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR+affinity+for+thymoproteasome-dependent+positively+selecting+peptides+conditions+antigen+responsiveness+in+CD8(+)+T+cells.">TCR affinity for thymoproteasome-dependent positively selecting peptides conditions antigen responsiveness in CD8(+) T cells.</a> Nature Immunology. 16 (10), 1069-1076 (2015).</li><li>Vizcardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Three-dimensional+Thymic+Culture+System+to+Generate+Murine+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-derived+Tumor+Antigen-specific+Thymic+Emigrants.">A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants.</a> JoVE. , e58672 (2019).</li></ol>

Forfatterne har ingen avsløringer.

Co-kulturen i OP9 murine stromal celler er et veletablert system for in vitro generasjon av lymfocytter (dvs. NK, B og T celler) fra HSPCs og Pluripotent stamceller. Hakk signalering er nødvendig for å indusere T avstamning forpliktelse og kan oppnås ved svangerskap/utvikling uttrykk for hakk ligand DLL1 eller DLL4, som har sammenlignbar effekt for T celle generasjon1. Derfor har OP9/DLL1 co-kultur systemet blitt en mye brukt metode for å produsere T-celler in vitro.  Videre er denne metoden gjelder for bruk med flere typer og kilder til menneskelige celler, inkludert ledningen blod, benmarg HSPCs og ESCs.  Imidlertid er generering av T-celler fra disse kildene begrenset enten ved utilstrekkelig gjenfinning av kilde celler eller ineffektiv differensiering til T-celler1. I tillegg kan ikke et T-cellers produkt med en enkelt TCR rekombinasjon genereres fra disse åpne repertoar kildene. Ved å bruke regenererende medisin teknikker, nemlig indusert pluripotent stilk cellen (iPSC) teknologi, kan det være mulig å produsere massive antall antigen-spesifikke T-celler for bruk i celle-baserte legemiddel-15.
hiPSCs ligner pluripotent ESCs i sin kapasitet for selv-fornyelse, ubegrensede ekspansjon, og potensial til å differensiere til alle typer somatiske celle i kroppen; men de mangler de etiske bekymringene rundt bruk av produkter av embryonale opprinnelse for kliniske applikasjoner. Videre kan hiPSCs produseres fra en hvilken som helst somatiske celle, slik at utviklingen av celle produkter for personlig medisin. I tidligere rapporter, hiPSCs har blitt produsert fra Human T celler ved hjelp av hele perifere mononukleære celler, CD3+ celler, eller isolerte cytotoksisk T-lymfocytter (CTLer) som en kilde18,19,22, 26. Når hiPSCs er generert fra en t-celle kilde (t-iPSCs), den opprinnelige TCR genet omorganisering er arvet. Derfor, pasient T-iPSC avledet T-celler kan gi en modell for personlig ACT behandling ved å målrette en pasientens distinkte kreft antigener.
Differensiering av menneskelige Pluripotent stamceller i T avstamning celler er delt inn i to trinn: generering av blodkreft stamceller (HPCs)27 og deres videre differensiering i t avstamning celler21. Begge trinnene kan oppnås ved hjelp av OP9/DLL1 co-kultur system. Viktigere er kvaliteten på OP9/DLL1 mater celler avgjørende for suksessen til T celle differensiering. Siden OP9/DLL1 celler er ikke en udødeliggjort homogen cellelinje, kvaliteten på FBS og kultur forhold er avgjørende for å opprettholde sin ekspansjon uten å miste evnen til å støtte hiPSC differensiering. Derfor er det anbefalt å pre-evaluere mye FBS og passasje konsekvent når celle-til-celle cytoplasmatiske kontakt begynner å oppstå, for å hindre celle differensiering og senescence. Ett poeng å ta hensyn til er at celle-til-celle-kontakt kan vises skille fra bakgrunnen avhengig av fase kontrast og forstørrelse av mikroskopet. I vår erfaring, de fleste OP9/DLL1 retter vil synes å være 80% confluent når klar til passering.
Det har blitt vist at redifferentiated t slekts celler generert fra t-iPSCs av OP9/DLL1 co-kultur kan produsere CD8+ SP T celler ved stimulering18,19. Men, fornyet CD8+ SP T celler erverve medfødt-lignende CD8αα homodimer22,28, som er en ineffektiv co-reseptor for TCR signalering29.  I tillegg har disse generert CD8+ SP T Cells vist sterke TCR-uavhengige cytotoksisitet, noe som gjør disse cellene ugunstige for klinisk bruk30. Denne protokollen beskriver en fersk metode som involverer stimulering av renset CD4+CD8+ DP celler til å generere CD8αβ+ SP T celler med en mer konvensjonell fenotype og forbedret antigen-spesifikke cytotoksisitet22. Selv om tap av antigen spesifisitet på grunn av sekundær TCRα allel omorganisering oppstår i DP scenen etter langvarig langsiktig kultur, kan dette overvinnes ved Genova redigering i T-iPSCs31.  I vår erfaring, hiPSC-avledet DP celler begynner å vises på dag 30-35 av kultur, og disse nylig genererte DP-celler har ennå ikke gjennomgått sekundære TCRα omorganisering. Derfor, de fleste DP celler på dag 35 beholde antigen spesifisitet og kan brukes til å generere antigen-spesifikke CD8αβ+ SP T Cells.
Før menneskelige anti-CD3 og anti-CD28 stimulering på dag 35, CD4-CD8- DN celler må fjernes fra kulturen, da disse har vist å forårsake direkte drap av CD4+CD8+ DP celler etter stimulering22. Bruke CD4 magnetisk perle berikelse (trinn 3,10) vil berike for både DP og CD4+CD8- INTERMEDIATE single positive (ISP) celler1, som vi har vist å ha noen negative effekter22. Alternativt kan fluorescens-aktivert celle sortering av Flow-flowcytometri utføres for å isolere DP-celler. Imidlertid er magnetisk perle separasjon foretrukket som det unngår mekanisk stress indusert av Flow flowcytometri.
Den generasjonen av CD8αβ+ SP T Cells fra humant Pluripotent stamceller uten aktivering-mediert Agonistiske utvalg har senere blitt demonstrert ved bruk av 3D murine stromal cellekultur32. Men fysiologiske positivt valg er avhengig av samspillet av TCR med Self-peptid-MHC komplekser, som er unikt behandlet og presentert av tymusatrofi kortikale epitelceller33. Videre har TCR affinitet for utvalgs peptider vist å bestemme de påfølgende funksjonelle evnene til modne CD8αβ+ SP T Cells34.  Foreløpig er det ingen bevis som tyder på at en notch stromal celle-basert co-kultur systemet kan gi den definerte utvalg peptid og MHC kompleks som kreves for fysiologiske positivt valg.
Det har vært tidligere rapportert i en murine modell som T avstamning celler generert fra tumor antigen-spesifikke T celle-avledet hiPSCs bruker OP9/DLL1 alene unnlater å oppleve konvensjonell modning. Men IPSC-avledet umodne T celler generert av OP9/DLL1 systemet kan modnes i naiv-lignende T celler ved videre fysiologiske tymusatrofi utdanning i et 3D-kultur system 28,35. Derfor protokollen som presenteres her for å produsere iPSC-avledet umodne T-celler generert av OP9/DLL1 systemet er avgjørende for ytterligere forsøk på å generere ekte menneskelig tumor antigen-spesifikke post-tymusatrofi T-celler i stand til langsiktig utholdenhet in vivo med effektivitet til å behandle etablerte vascularized svulster.

I tillegg til fysiologiske fordeler, T-celler har mange potensielle terapeutiske anvendelser. Generering og utvidelse av T-celler in vitro kan brukes til sykdoms modellering og terapeutisk validering, samt en kilde til behandling for arvelig og ervervet immunsvikt tilstander (dvs. viral immunodeficiencies og lymphodepletion sekundært til kjemoterapi eller transplantasjon) og for utryddelse av kreft. Denne sistnevnte kvaliteten har ført til utviklingen av adoptiv T celle overføring (ACT) for behandling av pasienter med avansert kreft1.
ACT består av resecting en pasients svulst, utpakking tumor-infiltrere lymfocytter (TILs), utvide TILs ex Vivo, deretter reinfusing de utvidede cellene inn i pasienten2. Det har vist seg å være en effektiv behandling modalitet for noen pasienter med metastatisk kreft.  Dessverre svarer ikke alle pasientene på denne behandlingen. Tidligere rapporter har vist at differensiering staten overført celler3,4,5,6,7,8,9, bruk av store tall av høyt beriket kreft antigen-spesifikke t-celler10, og utholdenhet av T-celler etter overføring11,12 er alle korrelert med mer holdbare svar13,14. Derfor, når ACT unnlater å lokke fram en anti-tumor respons, kan det delvis skyldes en lav avkastning av kreft antigen-spesifikke T-celler, ineffektiv ex vivo ekspansjon fører til utmattelse og tap av reaktive kloner, eller mangel på utholdenhet etter overføring4 . Det har vært postulert at disse hindringene kan overvinnes ved generering av et stort antall mindre differensiert kreft antigen-spesifikke T celler in vitro15,16.
Blodkreft stem/stamceller (HSPCs) er en konvensjonell kilde for in vitro T celle generering, selv om denne metoden er begrenset av lite antall celler i stand til å bli utvunnet fra en enkelt donor1. Embryonale stamceller (ESCs) har også vist seg å produsere T-celler, men med lav avkastning17, noe som gjør det ineffektivt for kliniske anvendelser. Videre, siden T avstamning celler opplever Stokastisk genetisk rekombinasjon av deres T celle reseptorer (TCRs) i tidlige utviklingsmessige stadier, er det ikke mulig å bruke HSPCs eller ESCs å generere en ren populasjon av antigen-spesifikke T-celler uten videre genomisk modifikasjoner som TCR genet Transduction.
En tilnærming til å overvinne disse begrensningene er å programmere TILs til menneskelig indusert Pluripotent stamceller (hiPSCs), som kan gi en ubegrenset kilde for in vitro T celle generasjon. Det har vist seg at kreft antigen-spesifikke TILs kan omprogrammeres inn hiPSCs og re-differensiert til T celle avstamning, som beholder den samme t celle reseptor (TCR) genet omorganisering som den opprinnelige t celle18,19.  Denne detaljen er betydelig for gjerning fordi individ pasient svulst ha enestående mutational profiler, og svært få kreften antigener ha blitt vist å bli delt blant pasienter20. Derfor, ved hjelp av kreft antigen-spesifikke TILs som en kilde for in vitro generasjon av hiPSC-avledede T-celler kan gi en ny strategi for personlig behandling av pasienter med metastatisk kreft.
Presentert her i detalj er en protokoll for å skille hiPSC-avledet T avstamning celler til funksjonell antigen-spesifikke CD8αβ+ singel positive (SP) T celler ved hjelp OP9/DLL1 co-kultur system. Denne metoden er et kraftig verktøy for in vitro T celle differensiering av hiPSCs, blodkreft forfedre, og embryonale stamceller, så vel som deres videre søknader i regenererende medisin og celle-baserte terapier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >10 cm dish</td>
			<td >Corning, Inc.&#160;</td>
			<td >353003</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD3, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 561812, RRID:AB_1089628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD34, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >Cat# 348791, RRID:AB_400381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD4, human</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td>Cat# 344612, RRID:AB_2028479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD43, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >Cat# 560198, RRID:AB_1645460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD7, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 555361, RRID:AB_395764</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD8a, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 555369, RRID:AB_398595</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD8b, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >Cat# 641057, RRID:AB_1645747</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-TCRb, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >Cat# 555548, RRID:AB_395932</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD28 human monoclonal antibody (15E8), pure functional grade</td>
			<td >Miltenyl Biotec</td>
			<td>130-093-375</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD3 human monoclonal antibody (OKT3), pure functional grade</td>
			<td >Miltenyl Biotec</td>
			<td>130-093-387</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD4 Microbeads, human</td>
			<td >Miltenyl Biotec</td>
			<td >130-045-101</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell strainer 100 um</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >22-363-549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td >Gemini</td>
			<td >100-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Flt-3 ligand</td>
			<td >R&#38;D Systems</td>
			<td >427-FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gelatin Solution 2%&#160;</td>
			<td>SIGMA-Aldritch</td>
			<td>G1393-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GlutaMAX (100X)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >35050-061</td>
			<td >L-Glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HBSS Mg+Ca+ Phenol-Red Free</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Interleukin-2</td>
			<td >R&#38;D Systems</td>
			<td >202-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Interleukin-7</td>
			<td >R&#38;D Systems</td>
			<td >407-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >iTAG MHC Tetramer HLA-A*0201 Mart1 Tetramer -ELAGIGILTV</td>
			<td >MBL</td>
			<td >Cat#TB-0009-2</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mart1-hiPSC</td>
			<td >Vizcardo et al., Cell Stem Cell 2013</td>
			<td >RIKEN-IMS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Melan-A, MART 1 (26-35)</td>
			<td >InnoPep</td>
			<td >3146-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#945;MEM powder</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >61100061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C57BL/6 MEF MITC-TREATED 4M EACH; A34962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >OP9/N-DLL1</td>
			<td >Riken Bioresource center</td>
			<td >Cat# RCB2927; RRID:CVCL_B220</td>
			<td >OP9/DLL1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/streptomycin</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate buffered saline pH 7.4 (1x)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primate ES Cell Medium</td>
			<td >Reprocell</td>
			<td >RCHEMD001</td>
			<td >Human ESC Culture Media</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rhok inhibitor (Y-27632 dihydrochloride)</td>
			<td >Tocris</td>
			<td >1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RPMI 1640</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td >R&#38;D Systems</td>
			<td >455-MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >StemPro</td>
			<td >EZPassage</td>
			<td >23181-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T2-tumor</td>
			<td >ATCC</td>
			<td>T2 (174 x CEM.T2) (ATCC&#174; CRL-1992&#8482;)&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red&#160;</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red&#160;</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >U Bottom 96 well plate</td>
			<td >Corning, Inc.&#160;</td>
			<td >3799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using human induced pluripotent stem cells for the generation of tumor antigen-specific t cells

Generering og utvidelse av funksjonelle T-celler in vitro kan føre til et bredt spekter av kliniske applikasjoner. En slik bruk er for behandling av pasienter med avansert kreft. Adoptiv T celle overføring (ACT) av svært beriket tumor antigen-spesifikke T-celler har vist å forårsake varig regresjon av metastatisk kreft hos noen pasienter. Under utvidelsen kan imidlertid disse cellene bli oppbrukt eller senescent, og begrense deres effektor funksjon og utholdenhet i vivo. Indusert pluripotent stilk cellen (iPSC) teknologi kan overvinne disse hindringene ved å føre til in vitro generasjon av et stort antall mindre differensiert tumor antigen-spesifikke T-celler. Human iPSC (hiPSC) har kapasitet til å differensiere til alle typer somatiske celle, inkludert lymfocytter, som beholder den opprinnelige T celle reseptoren (TCR) genomisk omorganisering når en T-celle brukes som en start celle. Derfor omprogrammering av menneskelig tumor antigen-spesifikke T-celler til hiPSC etterfulgt av redifferentiation til T celle avstamning har potensial til å produsere fornyet tumor antigen-spesifikke T-celler. Beskrevet her er en metode for å generere tumor antigen-spesifikke CD8αβ+ singel positive (SP) T-celler fra HIPSC bruker OP9/DLL1 co-kultur system. Denne metoden er et kraftig verktøy for in vitro T celle avstamning generasjon og vil lette utviklingen av in vitro avledet T celler for bruk i regenererende medisin og celle-baserte terapier.

Etter 13 dager hiPSCs co-dyrking med OP9/DLL1, CD34+CD43+ blodkreft stamceller dukket opp (figur 1). Etter ytterligere 22 dager med kultur på ikke-gelatinized OP9/DLL1 i nærvær av hSCF, hFLT3L, og hIL-7, blodkreft forfedre differensiert i CD3+CD7+CD4+CD8+ Double-positive (DP) T Lineage celler, The flertallet av som uttrykte TCR spesifikke for MART-1 epitope (tetramer) (figur 2).
Det har tidligere blitt vist at CD8+ SP T celler kan bli indusert fra CD4+CD8+ DP T celler ved TCR signalering via Agonistiske peptid eller antistoff-drevet TCR stimulering24,25. Derfor, på dag 35 av kulturen, hiPSC-avledet CD4+CD8+ DP T celler ble stimulert med anti-menneskelige CD3 og anti-menneskelige CD28 antistoffer i nærvær av hIL-7 og hIL-2.  Fire dager etter stimulering, antall CD3+CD8αβ+ SP celler økte dramatisk og forble spesifikke for Mart-1 epitope, bekrefter bevaring av deres arvet antigen-spesifisitet (Figur 3).
For å finne de funksjonelle egenskapene til hiPSC-avledet CD8αβ+ SP T Cells, antigen-avhengig aktivering og sekresjon av interferon gamma (IFN-γ) ble analysert. Etter stimulering med anti-menneskelige CD3 og anti-menneskelige CD28 antistoffer for 1 uke, hiPSC-avledet CD8αβ+ SP T celler ble isolert ved hjelp av en celle Sorter og co-kultivert med T2 cellelinje uttrykker HLA-a * 02:01 med eller uten beslektet MART1 peptid for 16-20 h. Den ELISpot analysen avslørte at hiPSC-avledet CD8αβ+ SP T Cells skiller høyere mengder IFN-γ sammenlignet med CD8αα+ SP T Cells, når kultivert i nærvær av Mart-1 peptid. IFN-γ uttrykket var null for T-celler og APCs alene, viser at menneskelige T-iPSC-avledet T-celler er antigen-spesifikke og funksjonelle (Figur 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59997/59997fig1.jpg"> Figur 1: generering av hiPSC-avledet blodkreft stamfar celler. (A) skjematisk oversikt over differensiering av hiPSCs til blodkreft AVSTAMNING bruker OP9/DLL1 co-kultur. (B) utseende av hiPSC-avledede strukturer på dag 1 (øverst til venstre), 3 (øverst til høyre), 7 (nederst til venstre), og 13 (nederst til høyre). Skala bars = 100 μm. (C) Flow analytiske analyse av HIPSC avledet CD34+CD43+ blodkreft stamceller på dag 13. Data er representative for seks uavhengige eksperimenter (n = 1 til 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59997/59997fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59997/59997fig2.jpg"> Figur 2: hiPSC differensiering inn Mart1+ CD4+CD8αβ+ DP T celler. (A) skjematisk oversikt over differensiering av hiPSC-avledet blodkreft avstamning til umodne T celler ved hjelp OP9/DLL1 co-kultur. (B) Flow analytiske analyse av CD4 vs CD8Α, CD3 vs CD8β, og Mart-1 tetramer uttrykk i hiPSC-avledet T-celler på dag 35. Gated på lymfocytter, enkeltceller, PI negativ. Data er representative for tre uavhengige eksperimenter (n = 3-8). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59997/59997fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59997/59997fig3.jpg"> Figur 3: induksjon av CD8αβ+ SP T Cell fenotype. Flow analytiske analyse av CD4- hiPSC-avledet T-celler 4 dager etter menneskelig anti-CD3 og menneskelig anti-CD28 antistoff-drevet stimulering. Gated på lymfocytter, enkeltceller, PI negative (n = 4).   <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59997/59997fig3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59997/59997fig4.jpg"> Figur 4: antigen spesifisitet av hiPSC-avledet CD8αβ+ SP T celler. IFN-γ sekresjon av ELISpot analysen av hiPSC-avledet CD8αβ+ SP, CD8αα+ SP, og bulk T-celler etter 20 h co-kultur med eller uten T2 celler pulserende (eller ikke) med Mart-1 peptid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59997/59997fig4large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells at JoVE.com

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Denne artikkelen beskriver en metode for å generere funksjonelle tumor antigen-spesifikke indusert pluripotent stilk cellen-avledet CD8αβ+ singel positive T-celler ved hjelp OP9/DLL1 co-kultur system.

Bruke Human indusert Pluripotent stamceller for generering av tumor antigen-spesifikke T celler

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Vi presenterer en metode for å generere menneskelig indusert pluripotent stamcelle-avledet tumor antigen-spesifikke CD8 alfa beta enkelt-positive T-celler ved hjelp av OP9-Delta-1 co-kultur system. Denne metoden er et kraftig verktøy for in vitro T cellegenerering og vil lette utviklingen av in vitro-avledede T-celler for bruk i regenerativ medisin og cellebaserte terapier. Det kan også tilpasses for generering av andre lymfocytter, som NK-celler.Når du utfører denne teknikken, er det viktig å forhåndsevaluere mange FBS- og passasje OP9-Delta-1-celler konsekvent når celle-til-celle cytoplasmatisk kontakt begynner å forhindre celledienerneriering og senescence. Å demonstrere prosedyren vil være Dr.Meghan Good, en kirurgisk onkologi fyr fra teamet mitt. Start med å sjekke menneskelige iPSC-kolonier i et stereomikroskop, og fjern eventuelle områder av differensiering fra kulturen med plastkanten på en 200 mikroliter pipettespiss.Når koloniene når 0,8 til 1,2 millimeter i diameter,pass de menneskelige iPSCene. Aspirer brukte medier, og tilsett 10 milliliter humant iPSC-medier supplert med 10 mikromos ROCK-hemmer. Rull et engangscellepassagingsverktøy over hele fatet i én retning, og sørg for å opprettholde etsartet trykk og at hele rullebladet berører kulturfatet.Roter kulturfatet 90 grader, og gjenta rullen. Visuelt bekrefte riktig kutting av koloniene med et mikroskop. De bør virke rutete.Deretter løsner du de kuttede koloniene ved skånsom mekanisk spyling med en 200 mikroliter pipette. Visuelt estimer antall koloniklumper, og overfør mellom 350 og 600 klumper til en ny 10-centimeters rett med mus embryonale fibroblaster med 10 milliliter friske menneskelige iPSC-medier supplert med ROCK-hemmer. Inkuber parabolen over natten ved 37 grader Celsius.Neste dag aspirerer du brukte medier, og legger til 10 milliliter friske menneskelige iPSC-medier. Endre mediet hver én eller to dager, avhengig av celleveksthastigheten. Kultur OP9-Delta-1 cellene i OP9 media på 37 grader Celsius.Når de når samløpet, aspirerer mediet, og vask cellene en gang med fem milliliter 1x magnesium, kalsium og fenol rødfri PBS. Aspirer PBS, tilsett to milliliter på 05% trypsin-EDTA, og inkuber cellene i fem minutter ved 37 grader Celsius. Deretter legger du til fire milliliter OP9-medier, og mekanisk dissosierer cellelaget ved å pipettering.Overfør cellesuspensjonen til et konisk rør på 50 milliliter gjennom en 100 mikrometercellesil, og sentrifuge ved 300 ganger g ved fire grader Celsius i fem minutter. Aspirer den overnaturante, og resuspend cellene i 12 milliliter OP9 media. Legg til åtte milliliter OP9-medier i hver av seks nye cellekulturretter, og legg to milliliter av OP9-delta-1 cellesuspensjon på hver tallerken.Rock parabolen side til side og foran til bak for å sikre jevn fordeling av cellene. Inkuber cellene ved 37 grader Celsius, og gjenta passasjen når cellene når samløpet. Forbered gelatiniserte OP9-Delta-1 retter en uke før co-kultur med menneskelige iPSCer.Tilsett fire milliliter med 0,1% gelatin til tre nye cellekulturretter, og inkuber dem i 30 minutter ved 37 grader Celsius. Etter inkubasjonen aspirerer gelatinen, og tilsett åtte milliliter OP9-medier til hver tallerken. Pass en sammenføyd tallerken med OP9-Delta-1-celler til tre gelatinbelagte retter.Etter fire dager legger du til 10 milliliter OP9-medier til hver rett av celler, totalt 20 milliliter media per tallerken. Begynn menneskelig iPSC-co-kultur på OP9-Delta-1 samtidige retter syv til åtte dager etter å ha passert cellene. Aspirer mediet fra en sammenføyd tallerken med menneskelige iPSCer, og legg til 10 milliliter OP9-medier.Klipp og løs cellekolonier ved hjelp av et engangscellepassagingsverktøy, og overfør 350 til 600 klumper av avskårne kolonier på en pre-gelatinisert OP9-Delta-1-tallerken med 10 milliliter friske OP9-medier. Rock kultur parabolen side til side og foran til bak for å sikre jevn fordeling av kolonier. Neste dag aspirerer du brukte medier, og erstatter det med 20 milliliter ferske OP9-medier.De menneskelige iPSC klumper co-kultivert på OP9-Delta-1 for en dag skal vises som små, runde, monolayer kolonier. På dag fem, aspirere 10 milliliter brukt media, og legge til 10 milliliter med friske OP9 media. Koloniene vil begynne å differensiere til primitiv mesoderm, som er preget av et flerlags mørkt senter.Gjenta denne prosessen på dag ni, og da vil flerlagssenterstrukturene utvikle seg til kuppellignende former. Høst de hematopoetiske stamcellene på dag 13, og da består strukturene av en mørk sentral organoid omgitt av et nettverk av kuppellignende områder. Aspirer mediet, og vask cellene en gang med fem milliliter 1x fenol rødfri Hanks balansert saltløsning med kalsium og magnesium, eller HBSS.Etter vasken, tilsett 250 mikroliter på 5 000 enheter per milliliter kollagenase IV til 10 milliliter HBSS. Tilsett blandingen til cellene, og inkuber dem ved 37 grader Celsius i 45 minutter. Aspirer HBSS-kollagenaseblandingen, og vask cellene en gang med fem milliliter PBS.Etter vask med PBS, legg til fem milliliter på 0,25% trypsin-EDTA, og inkuber cellene ved 37 grader Celsius i 20 minutter. Deretter legger du til fire milliliter OP9-medier, og desinfisere cellelaget ved å pipettering for å lage en enkeltcelledepensjon. Overfør cellefjæringen til et konisk rør på 50 milliliter gjennom en 100-mikrometersil, og sentrifuger røret ved 300 ganger g og fire grader Celsius i fem minutter.Aspirer den overnaturante, og resuspend cellene i 10 milliliter OP9 media. Plate celle suspensjon på en ny gelatinisert 10-centimeter celle kultur rett, og inkubere dem på 37 grader Celsius i 45 minutter. Deretter samler du eventuelle ikke-tilhengerceller ved mild pipettering.Overfør cellefjæringen til et konisk rør på 50 milliliter gjennom en sil, og sentrifuge som tidligere beskrevet. Deretter aspirerer du det overnaturante, og gjenbruker cellene i 10 milliliter differensieringsmedier. Plate celle suspensjon på en ny OP9-Delta-1 confluent parabolen.Pass cellene på dag 16 i henhold til manuskriptets retninger, og fortsett å passere de ikke-tilhengerne hver femte til syv dager etterpå. Etter 35 dager med differensiering, berike CD4-positiv cellepopulasjonen ved CD4 magnetisk perleisolasjon i henhold til produsentens protokoll. Deretter gjenbruker cellene i OP9-medier, og plate en milliliter cellesuspensjon i hver brønn av en vevskultur, flat bunn, 24-brønns plate med samløpet OP9-Delta-1.Stimulere celler ved å legge til 100 internasjonale enheter av menneskelig IL-2, fem nanograms av menneskelig IL-7, 500 nanograms av anti-menneskelig CD3 antistoff, og to mikrogram anti-menneskelige CD28 antistoff til hver brønn. Etter fire til syv dager kan celler samles inn for videre analyse. Etter kultur på ikke-gelatinisert OP9-Delta-1 i nærvær av menneskelig stamcellefaktor, menneskelig FLT3-ligand, og menneskelig interleukin-7, hematopoetiske stamfar differensiert til CD3, CD7, CD4, og CD8 dobbeltpositive T-avstamning celler, de fleste som uttrykte T celle reseptorer som er spesifikke for MART1 epitop.Når CD4, CD8 dobbeltpositive T-celler ble stimulert med anti-menneskelige CD3 og CD28 antistoffer i nærvær av menneskelig interleukin-7 og 2, antall CD3-positive CD8 alfa beta enkeltpositive celler økt og forble spesifikk for MART1 epitop, bekrefter bevaring av deres arvet antigen spesifisitet. En ELISpot analyse viste at når kultivert i nærvær av MART1 peptid, menneskelige iPSC-avledet CD8 alfa beta enkeltpositive T-celler utskiller høyere mengder interferon gamma sammenlignet med både bulk og CD8 alfa alfa enkeltpositive T-celler. Det ble ikke oppdaget interferon gammauttrykk for T-celler og antigen-presenterende celler alene, noe som viser at menneskelige T-iPSC-avledede T-celler er antigenspesifikke og funksjonelle.Et viktig skritt i denne metoden er CD4 magnetisk perle berikelse for å eliminere CD4-negative, CD8-negative dobbeltnegative celler, noe som kan føre til direkte drap av dobbeltpositive celler ved stimulering. Denne teknikken gjelder for bruk med flere kilder til menneskelige celler, inkludert hematopoetiske stamceller og embryonale stamceller. iPSC-avledede umodne T-celler generert av denne metoden kan forbedres ytterligere for generering av modne human tumor antigen-spesifikke naive-lignende T-celler for fremtidig terapeutisk bruk.Etter å ha sett denne videoen, bør betrakteren forstå hvordan man genererer menneskelige iPSC-avledede CD8 alfa beta enkeltpositive T-celler ved hjelp av OP9-Delta-1-kokultursystemet.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Modellering Osteosarcoma bruker Li-Fraumeni syndrom pasient-avledede Induced Pluripotent stamceller

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

En tredimensjonal Tymusatrofi kultur system for å generere murine indusert pluripotent Stem Cell-avledet tumor antigen-spesifikke Tymusatrofi nybyggere

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Sanntid påvisning av i Vitro svulst celle apoptose indusert av CD8+ T celler å studere immun undertrykkende funksjoner av svulst-infiltrere myeloide celler

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Fremstilling chimeric antigen reseptor (CAR) T celler for adoptiv immunterapi

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment

Isolasjon og utvidelse av cytotoktoktokin-indusert killer T-celler for kreftbehandling

Adoptive cellular immunotherapy focuses on restoring cancer recognition via the immune system and improves effective tumor cell killing. Cytokine-induced ...

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Analysere tumor- og vevsfordeling av målantigenspesifikt terapeutisk antistoff

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Patologisk analyse av lungemetastase etter lateral hale-vene injeksjon av tumorceller

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis

Generasjon av sebrafisk Larval Xenografts og tumor atferdsanalyse

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly ...

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Tumortransplantasjon for å vurdere dynamikken i tumorinfiltrerende CD8 + T-celler hos mus

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenisitet Screening av tumor-avledede ekstracellulære vesicles av Flow Cytometry av splenic T-celler

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...