Name: using human induced pluripotent stem cells for the generation of tumor antigen-specific t cells
Uploaded: 2019-10-24T13:00:00
Duration: 10 min 57 s
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Agradecemos alan B. Hoofring e Erina H. Ele para assistência gráfica. Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pesquisa Intramural do Instituto Nacional do Câncer (ZIA BC010763) e pela Intramural NCI Cancer Moonshot Initiative for Cell-based Cancer Immunotherapy.

1. Culturing IPSCs humanos (hiPSCs) em fibroblastos embrionários do rato (MEF)
Nota: Métodos alternativos para cultivar hiPSCs também podem ser usados, incluindo, mas não limitado a: semeadura em uma placa de 6 poços pré-revestida com gelatina, uma mistura de proteína gelatinosa, laminina recombinante 511, ou qualquer outra matriz extracelular usada na expansão hiPSC, e culto usando meios definidos especialmente formulados para a cultura de células-tronco pluripotentes humanas.
<ol><li>
Culturing MEF
	<ol>
<li>Cubra uma placa de Petri de cultura celular de 10 cm com 4 mL de 0,1% de gelatina e incubada por 30 min a 37 °C.</li>
		<li>Descongele um frasco de 4 x 106 MEF irradiado rapidamente em 10 mL de 37 °C mef media (DMEM + 10% FBS + 1x penicilina-estreptomicina + 1x L-suplemento de glutamamina). Centrífuga a 300 x g por 5 min a 4 °C. Assaa o supernatant e resuspende a pelota da pilha em 9 mL de meios de MEF.</li>
		<li>Retire o prato revestido de gelatina da incubadora. Aspirate gelatina e adicionar 7 mL de mídia MEF. Placa 3 mL de suspensão mef (do passo 1.1.2) para o prato revestido de gelatina. Rock o prato lado a lado e frente-a-trás para garantir até mesmo a distribuição de MEF sobre o prato. Incubar a 37 °C para 8-36 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Passagem hiPSC no MEF NOTA: Os dados foram gerados usando o MART-1 iPSC derivado do melanoma cultivado a longo prazo TIL, que reconhece especificamente o peptídeo MART-1 no contexto do HLA-A*02:01, como descrito anteriormente18.<ol>
<li>HiPSCs da passagem quando as colônias estão entre 0.8 - 1.2 milímetros no diâmetro. Antes da passagem, verifique as colônias hiPSC em um microscópio estéreo e remova quaisquer áreas de diferenciação da cultura usando a borda de plástico de uma ponta de 200 μL.</li>
		<li>Aspirate passou a mídia e adicionar 10 mL hiPSC media (mídia cultura ES humana [Tabela de Materiais] + 10 ng/mL fator de crescimento fibroblasto básico humano [hbFGF]) complementado com inibidor de 10 μM ROCK.</li>
		<li>Segure o prato de cultura celular em uma mão e rolar uma ferramenta de passagem de céluladescartável em todo o prato em uma direção. Aplique pressão suficiente para que toda a lâmina de rolo toque o prato de cultura e mantenha uma pressão uniforme durante a ação de rolamento.</li>
		<li>Gire o prato de cultura 90° e repita o passo 1.2.3. Veja a placa no microscópio para confirmar visualmente o corte adequado das colônias, que devem aparecer quadriculadas. Desapego cortar colônias por rubor mecânico suave usando uma pipeta de 200 μL. Nota: O destacamento de colônias cortadas por rubor mecânico deve ser feito imediatamente após o corte de colônias com o rolo, porque depois de 3 min as colônias cortadas começarão a recolocar-se no prato, e se tornará difícil separar colônias de tamanho homogêneo por rubor.</li>
		<li>Transfira 350 - 600 grupos de colônias cortadas para um novo prato de 10 cm de MEF (banhado 8 - 36 h antes da passaging hiPSC) com 10 mL de mídia hiPSC fresco complementado com inibidor de 10 μM ROCK. Incubar a 37 °C. NOTA: 600 aglomerados representa aproximadamente 1,0 x 106 MART-1 iPSC e renderá 0,5-1,0 x 106 células DP no dia 35. No entanto, os números esperados variam dependendo da potência da linha celular inicial e condições de cultura.</li>
		<li>No dia seguinte, aspirate mídia gasta e adicionar 10 mL de mídia hiPSC fresco. Mude a mídia hiPSC a cada 1 a 2 dias, dependendo da taxa de crescimento do hiPSC.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparação de células OP9/DLL1 para co-cultura com hiPSCs
<ol><li>Células OP9/DLL1 cultura em mídia OP9 [α-mínimo meio essencial (α-MEM) + 20% de soro bovino fetal (FBS) + 1x penicilina-estreptomicina] em 37 °C. Quando as células OP9/DLL1 atingem a confluência, aspirate e stão lavando uma vez com 5 mL de magnésio 1x, cálcio e fenol sem vermelho soro de fosfato amortecida salina (PBS).</li>
	<li>Aspirate PBS e adicionar 2 mL de 0,05% Trypsin-EDTA.  Incubar por 5 min a 37 °C. Em seguida, adicione 4 mL de mídia OP9 e mecanicamente dissociar a camada celular por pipetting para fazer uma suspensão de célula única.</li>
	<li>Transfira a suspensão celular em um tubo cônico de 50 mL através de um filtro de célula strainer de 100 μm para evitar aglomerados celulares. Centrífuga a 300 x g por 5 min a 4 °C. Aspirar o supernatant e resuspender em 12 mL de mídia OP9.</li>
	<li>Adicione 8 mL de mídia OP9 para cada um dos seis novos 10 cm de cultura de células placas de Petri. Placa 2 mL de suspensão celular OP9/DLL1 do passo 2.3 para cada novo prato de 10 cm. Rock o prato lado a lado, em seguida, frente-a-trás para garantir até mesmo a distribuição de OP9/ DLL1 sobre o prato.</li>
	<li>Incubar a 37 °C. Repita a passagem a cada 2 - 3 dias quando as células atingem a confluência. Nota: É importante fazer bastante estoque congelado de pilhas OP9/DLL1 e descongelar um estoque novo cada 4-6 semanas.</li>
</ol>3. Diferenciação in vitro de hiPSCs em CD8αβ+ Células T Positivas Únicas (SP)
<ol><li>Prepare pratos OP9/DLL1 gelatinizados uma semana antes da co-cultura com hiPSCs. Para preparar a solução de gelatina de 0,1%, adicione 5 mL de temperatura ambiente (RT) solução de gelatina de estoque de tecido de grau para 500 mL de PBS.
	<ol>
<li>Casaco 3 novas placas de 10 cm de cultura celular Petri, adicionando 4 mL por prato de 0,1% de gelatina.  Incubar 30 min a 37 °C.</li>
		<li>Aspirate gelatina e adicionar 8 mL de mídia OP9 para cada prato. Passar um prato de confluente de OP9/DLL1 (como feito na seção 2 acima) para três pratos pré-revestidos de gelatina.</li>
	</ol></li>
	<li>Após 4 dias, adicione 10 mL de mídia OP9 para cada prato de 10 cm de OP9/DLL1 em gelatina, para um total de 20 mL de mídia por prato.</li>
	<li>Após 7 a 8 dias, comece a co-cultura hiPSC em pratos de confluente op9/DLL1 (dia de diferenciação 0).
	<ol>
<li>A Aspirate gastou mídia de prato de 10 cm de cofluentes em mef. Adicione 10 mL de mídia OP9. Corte e desapara as colônias hiPSC usando uma ferramenta de passaging de células descartáveis, como feito nos passos 1.2.3 e 1.2.4.</li>
		<li>Transfira 350 - 600 grupos de colônias cortadas em um prato OP9/DLL1 pré-gelatinizado de 10 cm (passo 3.1) com 10 mL de mídia OP9 fresca usando uma pipeta de 200 μL. Rock o prato de cultura lado a lado, em seguida, frente-a-trás para garantir até mesmo a distribuição de colônias. NOTA: Alternativamente, podem ser utilizados corpos embrionários hiPSC pré-formados (EBs) ou suspensão de pequeno aglomeração.  No entanto, o uso de uma ferramenta de passaging de células descartáveis ou sistema de formação de EB é preferível produzir grupos hiPSC de tamanho uniforme.</li>
	</ol></li>
	<li>No dia 1, aspirate passou a mídia e substituir por 20 mL de mídia OP9 fresco. hiPSC grupos co-cultivada s OP9/DLL1 para 1 dia aparecerá como pequenas colônias de monocamadas redondas (Figura 1).</li>
	<li>No dia 5, aspirar 10 mL de mídia gasta e adicionar 10 mL de mídia OP9 fresco. colônias hiPSC começará a se diferenciar em mesoderm primitivo, que é caracterizado por um centro escuro multicamadas.</li>
	<li>No dia 9, aspirar 10 mL de mídia gasta e adicionar 10 mL de mídia OP9 fresco. Neste ponto, as estruturas centrais multicamadas evoluirão para formas semelhantes a cúpulas, e uma área periférica semelhante à rede começará a se tornar evidente.</li>
	<li>No dia 13, colhem células progenitoras hematopoiéticas (HPCs) (Figura 1). estruturas derivadas de hiPSC no dia 13 são caracterizadas por um organóide central escuro cercado por uma rede de áreas semelhantes a cúpulas, representativas de zonas hematopoiéticas (HZs) anteriormente relatadas para encerrar progenitores hematopoiéticos derivados de células-tronco embrionárias humanas 21. NOTA: A presença das estruturas semelhantes a cúpulaindica um processo bem-sucedido, mesmo na ausência de centros escuros. A incapacidade de produzir HPCs pode ser devido à má qualidade do OP9/DLL1, qualidade do lote FBS, confluência de aglomerados iPSC semeados em OP9/DLL1 (350-600 aglomerados é ideal), e / ou variações na potência das linhas iPSC para produzir precursores hematopoietic.<ol>
<li>Aspirate passou a mídia e lavar 1x com 5 mL de 1x fenol vermelho-livre Hanks' solução de sal equilibrado modificado com cálcio e magnésio (HBSS).</li>
		<li>Aspirate HBSS e adicionar 250 μL de 5000 Unidades/mL colagem IV em 10 mL de HBSS. Incubar a 37 °C por 45 min. Aspirate HBSS com collagenase IV e lavar uma vez com 5 mL de PBS.</li>
		<li>Aspirate PBS e adicionar 5 mL de 0,25% Trypsin-EDTA. Incubar a 37 °C por 20 min. Em seguida, adicione 4 mL de mídia OP9 e dissociar a camada celular por pipetting para fazer uma suspensão de célula única.</li>
		<li>Transfira a suspensão celular em um tubo cônico de 50 mL através de um filtro de célula strainer de 100 μm.  Centrífuga a 300 x g por 5 min a 4 °C. Aspirar o supernatant e resuspender em 10 mL de mídia OP9.</li>
		<li>Suspensão de células de placa em uma nova placa de Petri de cultura celular gelatinizada de 10 cm (ver etapas 3.1.1 e 3.1.2). Incubar a 37 °C por 45 min. Em seguida, coletar células não-aderentes por pipetting suave.</li>
		<li>Transfira a suspensão celular coletada em um tubo cônico de 50 mL através de um filtro de células de 100 μm.  Centrífuga a 300 x g por 5 min a 4 °C. Aspirar o supernatant e resuspender em 10 mL de meios de diferenciação [mídia OP9 com 5 ng/mL fator de células-tronco humanas (hSCF), 5 ng/mL humano Flt3 ligand (hFLT3L), e 5 ng/mL interleucina humana 7 (hIL-7)].</li>
		<li>Placa a suspensão celular em um novo 10 cm OP9/DLL1 prato de confluente.</li>
	</ol></li>
	<li>No dia 16, passar as celas.
	<ol>
<li>Mecanicamente destacar as células não-aderentes por tubulação suave e filtro através de um filtro de células de 100 μm. Centrífuga a 300 x g por 5 min a 4 °C. Assaa o supernatant e resuspende em 10 meios da diferenciação do mL.</li>
		<li>Placa a suspensão celular em um novo 10 cm OP9/DLL1 prato de confluente.</li>
	</ol></li>
	<li>Continue a passar células não aderentes a cada 5-7 dias depois, repetindo passo 3.8.</li>
	<li>No dia 35, enriquecer CD4+CD8+ duplo positivo (DP) população e estimular a produzir cd8αβ+ sp células T (Figura 2).
	<ol>
<li>Mecanicamente destacar células não-aderentes por pipetting suave e filtro através de um filtro de célula sitios de 100 μm para remover grupos celulares. Enriqueça a população de cd4+ células pelo isolamento de contas magnéticas CD4 de acordo com o protocolo do fabricante. NOTA: A justificativa para o uso de contas magnéticas CD4 é remover as células CD4-CD8- DN da cultura, como estas foram demonstradas para causar matança direta de células CD4+CD8+ DP após a estimulação22.</li>
		<li>Conte células enriquecidas cd4 vivas usando um hemocytometer Neubauer e tinudura azul Trypan.  Suspender na mídia OP9 na concentração total 0,5 x 106 células/mL. Aliquot 1 mL da suspensão celular (0,5 x 106 células) em cada poço de uma cultura de tecido plana inferior 24 placa bem de confluent OP9/DLL1.</li>
		<li>Adicione 100 UI interleucina humana 2 (hIL-2), 5 ng/mL hIL-7, 500 ng/mL anticorpo Anti-humano CD3, e 2 μg/mL anticorpo CD28 anti-humano, em seguida, cultura em 37 °C.</li>
		<li>No dia 4 - 7 após a estimulação, coletar células para análise molecular (Figura 3) ou co-cultura com células de apresentação de antígeno pulsado pelo peptídeo (APCs).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Medindo especificidade de antígeno de células CD8αβ+ SP T derivadas hiPSC
Nota: O tipo de APCs a serem usados para este experiement é dependente da limitação de MHC de pilhas de T hiPSC-derivadas. Aqui, a linha celular T2 é usada, que é um híbrido de linhas de células linfoboblastóides T e B. As células T2 expressam HLA-A*02:0123, que é reconhecido pelas células JKF6 das quais mart1-iPSC foi derivado18. Esta linha celular T2 pode ser expandida em RPMI 1640 + 20% FBS + 1x penicilina-estreptomicina e é passagen quando as células atingem uma densidade de 5 x 105 células/mL.
<ol><li>Conte ao vivo HLA-A*02:01+ T-B híbrido linfoblastoide t2 células usando um hemocytometer Neubauer e tine azul Trypan. Incubar APCs em 24 placa de cultura de tecido bem com 1 μg/mL MART-1 peptídeo para 2 h a 37 °C. Nota: A concentração ideal do peptídeo é variável, dependendo da linha celular e da especificidade do antígeno.</li>
	<li>Colete APCs e lave 2x com 10 mL de PBS para remover qualquer peptídeo extra.</li>
	<li>Conte APCs e suspenda em 2 - 5 x 105 células/mL na mídia OP9 com 100 IU IL-2 e 5 ng/mL IL-7. Aliquot 100 μL de suspensão celular (2-5 x 104 células) em cada poço de uma placa de 96 poços de ligação u ultra-baixa ou diretamente em uma placa ELISpot pré-revestida.</li>
	<li>Classificar as células T CD8αβ+ SP derivadas de hiPSC (1 semana após estimulação anti-humana de anticorpos CD3/CD28) usando um classificador celular e suspenda em 1 x 106 células/mL na mídia OP9 com 100 IU IL-2 e 5 ng/mL IL-7. Aliquot 100 μL de suspensão celular (1 x 105 células) em cada poço de APCs e cultura para 16 - 20 h a 37 °C.</li>
	<li>Após 16 - 20 h, analise o perfil de secreção de citocina pelo ensaio elispot por protocolo do fabricante (Figura 4).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brauer, P. M., Singh, J., Xhiku, S., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cell+Genesis:+In+Vitro+Veritas+Est.">T Cell Genesis: In Vitro Veritas Est.</a> Trends in Immunology. 37 (12), 889-901 (2016).</li><li>Rosenberg, S. A., Restifo, N. 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J., Singer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+selection+of+CD4++T+cells+by+TCR+ligation+without+aggregation+even+in+the+absence+of+MHC.">Positive selection of CD4+ T cells by TCR ligation without aggregation even in the absence of MHC.</a> Nature. 371 (6492), 67-70 (1994).</li><li>Seki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+terminally+differentiated+circulating+T+cells.">Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (1), 11-14 (2010).</li><li>Vodyanik, M. A., Slukvin, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematoendothelial+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells.">Hematoendothelial differentiation of human embryonic stem cells.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2007).</li><li>Vizcardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Tumor+Antigen-Specific+iPSC-Derived+Thymic+Emigrants+Using+a+3D+Thymic+Culture+System.">Generation of Tumor Antigen-Specific iPSC-Derived Thymic Emigrants Using a 3D Thymic Culture System.</a> Cell Reports. 22 (12), 3175-3190 (2018).</li><li>McNicol, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8alpha/alpha+homodimers+fail+to+function+as+co-receptor+for+a+CD8-dependent+TCR.">CD8alpha/alpha homodimers fail to function as co-receptor for a CD8-dependent TCR.</a> European Journal of Immunology. 37 (6), 1634-1641 (2007).</li><li>Themeli, M., Riviere, I., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+cell+sources+for+T+cell+engineering+and+adoptive+immunotherapy.">New cell sources for T cell engineering and adoptive immunotherapy.</a> Cell Stem Cell. 16 (4), 357-366 (2015).</li><li>Minagawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+T+Cell+Receptor+Stability+in+Rejuvenated+iPSC-Derived+T+Cells+Improves+Their+Use+in+Cancer+Immunotherapy.">Enhancing T Cell Receptor Stability in Rejuvenated iPSC-Derived T Cells Improves Their Use in Cancer Immunotherapy.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 850-858 (2018).</li><li>Montel-Hagen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid-Induced+Differentiation+of+Conventional+T+Cells+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Organoid-Induced Differentiation of Conventional T Cells from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 376-389 (2019).</li><li>Takada, K., Kondo, K., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Peptides+That+Promote+Positive+Selection+in+the+Thymus.">Generation of Peptides That Promote Positive Selection in the Thymus.</a> Journal of Immunology. 198 (6), 2215-2222 (2017).</li><li>Takada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR+affinity+for+thymoproteasome-dependent+positively+selecting+peptides+conditions+antigen+responsiveness+in+CD8(+)+T+cells.">TCR affinity for thymoproteasome-dependent positively selecting peptides conditions antigen responsiveness in CD8(+) T cells.</a> Nature Immunology. 16 (10), 1069-1076 (2015).</li><li>Vizcardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Three-dimensional+Thymic+Culture+System+to+Generate+Murine+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-derived+Tumor+Antigen-specific+Thymic+Emigrants.">A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants.</a> JoVE. , e58672 (2019).</li></ol>

Os autores não têm divulgações.

A co-cultura das células estromais de urina OP9 é um sistema bem estabelecido para a geração in vitro de linfócitos (ou seja, células NK, B e T) de HSPCs e células-tronco pluripotentes. A sinalização de entalhe é necessária para induzir o compromisso de linhagem T e pode ser realizada pela expressão ectópica de Notch ligand DLL1 ou DLL4, que têm eficácia comparável para a geração de células T1. Portanto, o sistema de cocultura OP9/DLL1 tornou-se um método amplamente utilizado para a produção de células T in vitro.  Além disso, este método é aplicável para uso com vários tipos e fontes de células humanas, incluindo sangue do cordão umbilical, HSPCs de medula óssea e ESCs.  No entanto, a geração de células T a partir dessas fontes é limitada por recuperação insuficiente de células de origem ou por diferenciação ineficiente para as células T1. Além disso, um produto de célulaS T com uma única recombinação TCR não pode ser gerado a partir dessas fontes de repertório aberto. Usando técnicas de medicina regenerativa, ou seja, induzida stemipotente stemipotente (iPSC) tecnologia, pode ser possível produzir um grande número de células T específicas de antígeno para uso em terapêutica baseada em células15.
hiPSCs são semelhantes aos ESCs pluripotentes em sua capacidade de auto-renovação, expansão ilimitada e potencial para diferenciar qualquer tipo de célula somática no corpo; no entanto, eles não têm as preocupações éticas em torno do uso de produtos de origem embrionária para aplicações clínicas. Além disso, hiPSCs podem ser produzidos a partir de qualquer célula somática, permitindo o desenvolvimento de produtos celulares para medicina personalizada. Em relatórios anteriores, hiPSCs foram produzidos a partir de células T humanas usando células mononucleares periféricas inteiras, células CD3+ ou linfócitos citotóxicos isolados (CTLs) como fonte18,19,22, 26.Quando os hiPSCs são gerados a partir de uma fonte de células T (T-iPSCs), o rearranjo original do gene TCR é herdado. Portanto, as células T derivadas do T-iPSC paciente podem fornecer um modelo para o tratamento personalizado do ACT, visando os antígenos distintos do câncer de um paciente.
A diferenciação das células-tronco pluripotentes humanas nas células de linhagem T é dividida em duas etapas: a geração de células progenitoras hematopoiéticas (HPCs)27 e sua diferenciação adicional nas células de linhagem T21. Ambas as etapas podem ser realizadas usando o sistema de co-cultura OP9/DLL1. É importante ressaltar que a qualidade das células-alimentadorope OP9/DLL1 é fundamental para o sucesso da diferenciação de células T. Como as células OP9/DLL1 não são uma linha celular homogênea imortalizada, a qualidade da FBS e as condições culturais são fundamentais para manter sua expansão sem perder a capacidade de suportar a diferenciação de hiPSC. Portanto, recomenda-se pré-avaliar o lote de FBS e passagem consistentemente quando o contato citoplasmiccélula célula-célula começa a ocorrer, a fim de evitar a diferenciação celular e senescência. Um ponto a levar em consideração é que o contato célula-célula pode parecer indistinguível do fundo, dependendo do contraste de fase e ampliação do microscópio. Em nossa experiência, a maioria dos pratos OP9/DLL1 parecerá ser 80% de confluentes quando estiverem prontos para passar.
Tem sido demonstrado que as células de linhagem T rediferenciadas geradas a partir de T-iPSCs por OP9/DLL1 co-cultura podem produzir células T CD8+ SP após estimulação18,19. No entanto, as células T CD8+ SP regeneradas adquirem o homodimer22,28,que é um coreceptor ineficaz para a sinalização de TCR29.  Além disso, essas células T CD8+ SP regeneradas têm mostrado uma citotoxicidade forte independente do TCR, tornando essas células desfavoráveis para uso clínico30. Este protocolo descreve um método recente envolvendo estimulação de células CD4+CD8+ DP purificadas purificadas purificadas para gerar células T CD8αβ+ SP com fenótipo mais convencional e citotoxicidade específica de antígeno melhorada22. Embora a perda de especificidade de antígeno devido ao rearranjo alélico TCRα secundário ocorra na fase de DP após a cultura prolongada de longo prazo, isso pode ser superado pela edição do genoma em T-iPSCs31.  Em nossa experiência, as células DP derivadas de hiPSC começam a aparecer no dia 30 - 35 de cultura, e essas células DP recém-geradas ainda não foram submetidas ao rearranjo tcrα secundário. Portanto, a maioria das células DP no dia 35 retêm especificidade de antígeno e podem ser usadas para gerar células T CD8αβ+ SP específicas por antígeno.
Antes da estimulação anti-CD3 humano e anti-CD28 no dia 35, as células CD4-CD8- DN devem ser removidas da cultura, pois estas foram demonstradas para causar morte direta de células CD4+CD8+ DP após estimulação22. Usando enriquecimento de contas magnéticas CD4 (passo 3.10) enriquecerá tanto para DP quanto para CD4+CD8- células médias únicas positivas (ISP)1,que nos mostraram não ter efeitos negativos22. Alternativamente, a classificação celular ativada por fluorescência por citometria de fluxo pode ser realizada para isolar as células DP. Entretanto, a separação magnética do grânulo é preferida porque evita o esforço mecânico induzido pela citometria do fluxo.
A geração de células T CD8αβ+ SP de células-tronco pluripotentes humanas sem seleção agonista mediada pela ativação foi posteriormente demonstrada pelo uso da cultura de células estromais de urina 3D32. No entanto, a seleção fisiológica positiva depende da interação do TCR com complexos auto-peptídeos-MHC, que são exclusivamente processados e apresentados por células epiteliais cortical thymic33. Além disso, a afinidade tcr para peptídeos de seleção tem sido mostrado para determinar as capacidades funcionais subseqüentes de células T CD8αβ+ SP34.  Atualmente, não há nenhuma evidência para sugerir que um sistema de co-cultura baseado em células estromals notch pode fornecer o peptídeo de seleção definida e complexo de MHC necessário para a seleção fisiológica positiva.
Tem sido relatado anteriormente em um modelo de urina que as células de linhagem T geradas a partir de hiPSCs derivados de células T específicos de antígeno tumoral usando OP9/DLL1 sozinho não conseguem experimentar maturação convencional. No entanto, células T imaturas derivadas do iPSC geradas pelo sistema OP9/DLL1 podem amadurecer em células T ingênuas por mais educação fisiológica de tímico em um sistema de cultura 3D 28,35. Portanto, o protocolo apresentado aqui para produzir células T imaturas derivadas do iPSC geradas pelo sistema OP9/DLL1 é vital para novas tentativas de gerar células T pós-ténmicas específicas de antígeno humano real capazes de persistência in vivo a longo prazo eficiência para tratar tumores vascularizados estabelecidos.

Além de vantagens fisiológicas, as células T têm muitas aplicações terapêuticas potenciais. A geração e expansão das células T in vitro podem ser usadas para modelagem de doenças e validação terapêutica, bem como uma fonte de tratamento para estados de imunodeficiência hereditária e adquirida (ou seja, imunodeficiências virais e linfodepletion secundário para quimioterapia ou transplante) e para a erradicação do câncer. Esta última qualidade levou ao desenvolvimento de transferência de células T adotivas (ACT) para o tratamento de pacientes com câncer avançado1.
Act consiste em reintegrar o tumor de um paciente, extraindo linfócitos infiltrados tumorais (TILs), expandindo TILs ex vivo, em seguida, reinfundindo as células expandidas para o paciente2. Tem se mostrado uma modalidade de tratamento eficaz para alguns pacientes com câncer metastático.  Infelizmente, nem todos os pacientes respondem a esta terapia. Relatórios anteriores mostraram que o estado de diferenciação das células transferidas3,4,5,6,7,8,9, uso de grandes números de células T altamente enriquecidas com antígeno de câncer10,e persistência das células T após a transferência11,12 estão todos correlacionados com respostas mais duráveis13,14. Portanto, quando act não consegue provocar uma resposta anti-tumoral, pode em parte ser devido a um baixo rendimento de células T específicas de antígeno do câncer, expansão ineficiente ex vivo levando à exaustão e perda de clones reativos, ou falta de persistência após a transferência4 . Foi postulado que esses obstáculos podem ser superados pela geração de um grande número de células T menos diferenciadas de câncer específicas de antígeno in vitro15,16.
As células-tronco/progenitoras hematopoiéticas (HSPCs) são uma fonte convencional para a geração de células T in vitro, embora este método seja limitado pelo pequeno número de células capazes de ser recuperadas de um único doador1. Células-tronco embrionárias (ESCs) também foram mostrados para produzir células T, mas com baixo rendimento17, tornando-o ineficiente para aplicações clínicas. Além disso, uma vez que as células de linhagem T experimentam recombinação genética estocástica de seus receptores de células T (TCRs) em estágios iniciais de desenvolvimento, não é possível usar HSPCs ou ESCs para gerar uma população pura de células T específicas de antígeno sem mais genômica modificações como a transdução do gene TCR.
Uma abordagem para superar essas ressalvas é reprogramar TILs para células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSCs), que podem fornecer uma fonte ilimitada para a geração de células T in vitro. Tem sido demonstrado que os TILs específicos de antígeno do câncer podem ser reprogramados em hiPSCs e rediferenciados na linhagem de células T, que retém o mesmo rearranjo do gene do receptor de células T (TCR) que a célula T original18,19.  Este detalhe é importante para act porque tumores individuais do paciente têm perfis mutational originais, e muito poucos antígenos do cancro foram mostrados para ser compartilhados entre pacientes20. Portanto, o uso de TILs específicos de antígeno do câncer como fonte para a geração in vitro de células T derivadas de hiPSC pode fornecer uma nova estratégia para o tratamento personalizado de pacientes com câncer metastático.
Apresentado aqui em detalhes é um protocolo para diferenciar células de linhagem T derivadas de hiPSC em células T cd8αβ+ únicas positivas (SP) positivas usando o sistema de cocultura OP9/DLL1. Este método é uma ferramenta poderosa para a diferenciação in vitro de células T de hiPSCs, progenitores hematopoiéticos e células-tronco embrionárias, bem como suas aplicações adicionais em medicina regenerativa e terapias baseadas em células.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >10 cm dish</td>
			<td >Corning, Inc.&#160;</td>
			<td >353003</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD3, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 561812, RRID:AB_1089628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD34, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >Cat# 348791, RRID:AB_400381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD4, human</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td>Cat# 344612, RRID:AB_2028479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD43, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >Cat# 560198, RRID:AB_1645460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD7, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 555361, RRID:AB_395764</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD8a, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 555369, RRID:AB_398595</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD8b, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >Cat# 641057, RRID:AB_1645747</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-TCRb, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >Cat# 555548, RRID:AB_395932</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD28 human monoclonal antibody (15E8), pure functional grade</td>
			<td >Miltenyl Biotec</td>
			<td>130-093-375</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD3 human monoclonal antibody (OKT3), pure functional grade</td>
			<td >Miltenyl Biotec</td>
			<td>130-093-387</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD4 Microbeads, human</td>
			<td >Miltenyl Biotec</td>
			<td >130-045-101</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell strainer 100 um</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >22-363-549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td >Gemini</td>
			<td >100-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Flt-3 ligand</td>
			<td >R&#38;D Systems</td>
			<td >427-FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gelatin Solution 2%&#160;</td>
			<td>SIGMA-Aldritch</td>
			<td>G1393-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GlutaMAX (100X)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >35050-061</td>
			<td >L-Glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HBSS Mg+Ca+ Phenol-Red Free</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Interleukin-2</td>
			<td >R&#38;D Systems</td>
			<td >202-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Interleukin-7</td>
			<td >R&#38;D Systems</td>
			<td >407-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >iTAG MHC Tetramer HLA-A*0201 Mart1 Tetramer -ELAGIGILTV</td>
			<td >MBL</td>
			<td >Cat#TB-0009-2</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mart1-hiPSC</td>
			<td >Vizcardo et al., Cell Stem Cell 2013</td>
			<td >RIKEN-IMS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Melan-A, MART 1 (26-35)</td>
			<td >InnoPep</td>
			<td >3146-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#945;MEM powder</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >61100061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C57BL/6 MEF MITC-TREATED 4M EACH; A34962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >OP9/N-DLL1</td>
			<td >Riken Bioresource center</td>
			<td >Cat# RCB2927; RRID:CVCL_B220</td>
			<td >OP9/DLL1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/streptomycin</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate buffered saline pH 7.4 (1x)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primate ES Cell Medium</td>
			<td >Reprocell</td>
			<td >RCHEMD001</td>
			<td >Human ESC Culture Media</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rhok inhibitor (Y-27632 dihydrochloride)</td>
			<td >Tocris</td>
			<td >1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RPMI 1640</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td >R&#38;D Systems</td>
			<td >455-MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >StemPro</td>
			<td >EZPassage</td>
			<td >23181-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T2-tumor</td>
			<td >ATCC</td>
			<td>T2 (174 x CEM.T2) (ATCC&#174; CRL-1992&#8482;)&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red&#160;</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red&#160;</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >U Bottom 96 well plate</td>
			<td >Corning, Inc.&#160;</td>
			<td >3799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using human induced pluripotent stem cells for the generation of tumor antigen-specific t cells

A geração e expansão das células T funcionais in vitro pode levar a uma ampla gama de aplicações clínicas. Um desses usos é para o tratamento de pacientes com câncer avançado. A transferência de células T adotivas (ACT) de células T altamente enriquecidas do tumor específicas tem sido mostrada para causar regressão durável de câncer metastático em alguns pacientes. No entanto, durante a expansão, essas células podem ficar esgotadas ou senescentes, limitando sua função efetiva e persistência in vivo. A tecnologia induzida de células-tronco pluripotentes (iPSC) pode superar esses obstáculos levando à geração in vitro de um grande número de células T específicas de antígeno tumoral menos diferenciada. O iPSC humano (hiPSC) tem a capacidade de diferenciar-se em qualquer tipo de célula somática, incluindo linfócitos, que retêm o rearranjo genômico original do receptor de células T (TCR) quando uma célula T é usada como célula de partida. Portanto, a reprogramação de células T específicas de antígeno tumor humano para hiPSC seguida de redifferentiação à linhagem de células T tem o potencial de produzir células T específicas de antígeno tumoral rejuvenescido. Descrito aqui é um método para gerar células T CD8αβ+ únicas positivas (SP) positivas (SP) do hiPSC usando o sistema de cocultura OP9/DLL1. Este método é uma ferramenta poderosa para a geração in vitro da linhagem da pilha de T e facilitará o desenvolvimento de pilhas de T derivadas in vitro para o uso na medicina regenerativa e nas terapias pilha-baseadas.

Após 13 dias hiPSCs co-culturing com OP9/DLL1, CD34+CD43+ células progenitoras hematopoiéticas apareceram (Figura 1). Após mais 22 dias de cultura sobre OP9/DLL1 não gelatinizado na presença de hSCF, hFLT3L e hIL-7, progenitores hematopoiéticos diferenciados em CD3+CD7+CD4+CD8+ células de linhagem T duplo-positivas (DP), maioria dos quais expressou TCR específico para o epitope MART-1 (tetramer) (Figura 2).
Já foi demonstrado anteriormente que as células T CD8+ SP podem ser induzidas a partir de células T CD4+CD8+ DP por sinalização TCR via peptídeo agonista ou estimulação tcr orientada por anticorpos24,25. Portanto, no dia 35 da cultura, as células T CD4+CD8+ DP derivadas de hiPSC foram estimuladas com anticorpos CD3 anti-humanos e CD28 anti-humanos na presença de hIL-7 e hIL-2.  Quatro dias após a estimulação, o número de células CD3+CD8αβ+ SP aumentou dramaticamente e permaneceu específico para o epítopo MART-1, confirmando a preservação de sua especificidade antígeno herdada (Figura 3).
Para determinar as propriedades funcionais das células T CD8αβ+ SP derivadas de hiPSC, foi analisada a ativação e secreção de interferon gama (IFN-γ). Após a estimulação com anticorpos CD3 anti-humanos e CD28 anti-humanos por 1 semana, as células T CD8αβ+ SP derivadas de hiPSC foram isoladas usando um classificador celular e co-cultivadas com linha celular T2 expressando HLA-A*02:01 com ou sem peptídeo MART1 cognado por 16 - 20 h. O ensaio elispot revelou que as células CD8αβ+ SP T derivadas de hiPSC secretam quantidades mais elevadas de IFN-γ em comparação com as células T CD8αα+ SP, quando cultivadas na presença do peptídeo MART-1. A expressão ifn-γ foi nula apenas para células T e APCs, demonstrando que as células T derivadas de T-iPSC humanas são específicas de antígeno e funcionais(Figura 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59997/59997fig1.jpg"> Figura 1:Geração de células progenitoras hematopoiéticas derivadas de hiPSC. A) Visão geral esquemática da diferenciação de hiPSCs para linhagem hematopoiética usando co-cultura OP9/DLL1. (B) Aparência de estruturas derivadas de hiPSC nos dias 1 (canto superior esquerdo), 3 (canto superior direito), 7 (canto inferior esquerdo) e 13 (canto inferior direito). Barras de escala = 100 μm. (C)Análise citométrica de fluxo de CD34 derivado hiPSC+CD43+ células progenitoras hematopoiéticas no dia 13. Os dados são representativos de seis experimentos independentes (n = 1 a 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59997/59997fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59997/59997fig2.jpg"> Figura 2: diferenciação hiPSC em Mart1+ CD4+CD8αβ+ DP Células T. (A)Visão geral esquemática da diferenciação da linhagem hematopoiética derivada do hiPSC para células T imaturas usando co-cultura OP9/DLL1. (B) Análise citométrica de fluxo de CD4 vs CD8α, CD3 vs CD8β e expressão tetramer MART-1 em células T derivadas de hiPSC no dia 35. Fechado em linfócitos, células individuais, PI negativo. Os dados são representativos de três experimentos independentes (n = 3 - 8). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59997/59997fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59997/59997fig3.jpg"> Figura 3: Indução de Fenótipo de células T CD8αβ+ SP. Análise citométrica do fluxo de CD4- células T derivadas de hiPSC 4 dias após a estimulação anti-CD3 humana e anti-CD28 humana. Fechado em linfócitos, células individuais, PI negativo (n = 4).   <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59997/59997fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59997/59997fig4.jpg"> Figura 4:Especificidade do antígeno das células T CD8αβ+ SPderivadas da hiPSC. Secreção IFN-γ pelo ensaio elispot de cd8αβ+ SP derivado sp, CD8αα+ SP, e células T em massa após 20 h co-cultura com ou sem células T2 pulsadas (ou não) com peptídeo MART-1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59997/59997fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>

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Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Este artigo descreve um método para gerar células-tronco pluripotentes induzidas por antígeno funcional do tumor derivadas de CD8αβ+ únicas células T positivas usando o sistema de cocultura OP9/DLL1.

Usando células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem para a geração de células T específicas de antígeno tumoral

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Apresentamos um método para gerar células-tronco pluripotentes induzidas por células-tronco derivadas do tumor cd8 alfa beta beta uni-positivo T usando o sistema de co-cultura OP9-Delta-1. Este método é uma poderosa ferramenta para a geração de células T in vitro e facilitará o desenvolvimento de células T derivadas in vitro para uso em medicina regenerativa e terapias baseadas em células. Também pode ser adaptado para a geração de outros linfócitos, como células NK.Ao executar essa técnica, é importante pré-avaliar o lote de células FBS e passagem OP9-Delta-1 de forma consistente quando o contato citoplasmático célula-celular começar a prevenir a diferenciação celular e a senescência. Demonstrando o procedimento será a Dra. Comece verificando colônias de iPSC humanos em um microscópio estéreo e remova quaisquer áreas de diferenciação da cultura com a borda plástica de uma ponta de pipeta de 200 microliter.Quando as colônias atingirem 0,8 a 1,2 milímetros de diâmetro, passagem os iPSCs humanos. Aspire a mídia gasta, e adicione 10 mililitros de mídia iPSC humana suplementada com inibidor ROCK de 10 micromolar. Enrole uma ferramenta de troca de celular descartável por todo o prato em uma direção, certificando-se de manter a pressão uniforme e que toda a lâmina de rolo toca o prato da cultura.Gire o prato de cultura 90 graus, e repita o rolamento. Confirme visualmente o corte adequado das colônias com um microscópio. Eles devem parecer quadrimestados.Em seguida, desprendem as colônias cortadas por uma suave descarga mecânica com uma pipeta de 200 microliter. Estimar visualmente o número de aglomerados de colônias, e transferir entre 350 e 600 aglomerados para um novo prato de 10 centímetros de fibroblastos embrionários de camundongos com 10 mililitros de mídia iPSC humana fresca complementada com inibidor de ROCK. Incubar o prato durante a noite a 37 graus Celsius.No dia seguinte, aspire a mídia gasta, e adicione 10 mililitros de mídia iPSC humana fresca. Mude a mídia a cada um ou dois dias, dependendo da taxa de crescimento celular. Cultura as células OP9-Delta-1 em mídia OP9 a 37 graus Celsius.Quando atingirem a confluência, aspirem a mídia e lavem as células uma vez com cinco mililitros de 1x magnésio, cálcio e PBS sem fenol. Aspire o PBS, adicione dois mililitros de 05% de trippsina-EDTA, e incuba as células por cinco minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, adicione quatro mililitros de mídia OP9 e dissociar mecanicamente a camada celular por pipetação.Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 50 mililitros através de um coador de células de 100 micrômetros, e centrífuga a 300 vezes g a quatro graus Celsius por cinco minutos. Aspire o supernasce, e resuspense as células em 12 mililitros de mídia OP9. Adicione oito mililitros de mídia OP9 a cada um dos seis novos pratos de cultura celular, e placa dois mililitros da suspensão celular OP9-delta-1 em cada prato.Balance o prato de um lado para o outro e frente para trás para garantir a distribuição uniforme das células. Incubar as células a 37 graus Celsius, e repetir a passagem quando as células atingirem a confluência. Prepare pratos OP9-Delta-1 gelatinizados uma semana antes da co-cultura com iPSCs humanos.Adicione quatro mililitros de gelatina de 0,1% a três novos pratos de cultura celular, e incuba-os por 30 minutos a 37 graus Celsius. Após a incubação, aspire a gelatina e adicione oito mililitros de mídia OP9 a cada prato. Passagem um prato confluente de células OP9-Delta-1 para três pratos revestidos de gelatina.Após quatro dias, adicione 10 mililitros de mídia OP9 a cada prato de células, para um total de 20 mililitros de mídia por prato. Inicie a co-cultura iPSC humana em pratos confluentes OP9-Delta-1 de sete a oito dias após a passagem das células. Aspire a mídia de um prato confluente de iPSCs humanos, e adicione 10 mililitros de mídia OP9.Corte e desprende colônias celulares usando uma ferramenta descartável de passagem celular, e transfira 350 a 600 aglomerados de colônias cortadas para um prato OP9-Delta-1 pré-gelatinizado com 10 mililitros de mídia OP9 fresca. Arrase o prato de cultura lado a lado e frente a frente para trás para garantir até mesmo a distribuição das colônias. No dia seguinte, aspire a mídia gasta, e substitua-a por 20 mililitros de mídia OP9 fresca.Os aglomerados humanos iPSC co-cultivados no OP9-Delta-1 por um dia devem aparecer como pequenas colônias de monocamadas redondas. No quinto dia, aspire 10 mililitros de mídia gasta, e adicione 10 mililitros de mídia OP9 fresca. As colônias começarão a se diferenciar em mesodermia primitiva, que é caracterizada por um centro escuro multicamadas.Repita este processo no nono dia, momento em que as estruturas do centro multicamadas evoluirão para formas semelhantes a cúpulas. Colher as células progenitoras hematopoiéticas no dia 13, momento em que as estruturas são compostas de um organoide central escuro cercado por uma rede de áreas semelhantes a cúpulas. Aspire a mídia, e lave as células uma vez com cinco mililitros de 1x solução de sal balanceado hanks sem fenol com cálcio e magnésio, ou HBSS.Após a lavagem, adicione 250 microliters de 5.000 unidades por mililitro colagenase IV a 10 mililitros de HBSS. Adicione a mistura às células e incuba-as a 37 graus Celsius por 45 minutos. Aspire a mistura HBSS-collagenase e lave as células uma vez com cinco mililitros de PBS.Depois de lavar com PBS, adicione cinco mililitros de 0,25% trypsin-EDTA, e incuba as células a 37 graus Celsius por 20 minutos. Em seguida, adicione quatro mililitros de mídia OP9 e dissocia a camada celular por pipetação para fazer uma suspensão de célula única. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 50 mililitros através de um coador de 100 micrômetros e centrifugar o tubo a 300 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos.Aspire o supernasce, e resuspense as células em 10 mililitros de mídia OP9. Plaque a suspensão celular em um novo prato de cultura celular gelatinizada de 10 centímetros, e incuba-os a 37 graus Celsius por 45 minutos. Em seguida, colete quaisquer células não aderentes por pipetação suave.Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 50 mililitros através de um coador e centrífuga como descrito anteriormente. Em seguida, aspire o supernasce, e resuspense as células em 10 mililitros de mídia de diferenciação. Coloque a suspensão da célula em um novo prato confluente OP9-Delta-1.Passe as células no dia 16 de acordo com as instruções do manuscrito, e continue a passar as células não aderentes a cada cinco ou sete dias depois. Após 35 dias de diferenciação, enriqueça a população celular CD4 positivo pelo isolamento de contas magnéticas CD4 de acordo com o protocolo do fabricante. Em seguida, resuspenque as células em mídia OP9, e placa um mililitro de suspensão celular em cada poço de uma cultura tecidual, fundo plano, placa de 24 poços de confluente OP9-Delta-1.Estimule as células adicionando 100 unidades internacionais de IL-2 humanos, cinco nanogramas de IL-7 humanos, 500 nanogramas de anticorpos CD3 anti-humanos, e dois microgramas de anticorpos CD28 anti-humanos para cada poço. Após quatro a sete dias, as células podem ser coletadas para análise suplementar. Após a cultura em OP9-Delta-1 não gelatinizada na presença de fatores de células-tronco humanas, flt3-ligantes humanos e interleucina humana-7, progenitores hematopoiéticos se diferenciam em células de linhagem T CD3, CD7, CD4 e CD8 duplamente positivas, a maioria das quais expressavam receptores de células T específicos para o epítope MART1.Quando o CD4, células T cd8 duplo-positivas foram estimuladas com anticorpos anti-humanos CD3 e CD28 na presença de interleucina humana-7 e 2, o número de células CD3-positivas CD8 alfa beta single-positivo aumentou e permaneceu específico para o epítope MART1, confirmando a preservação de sua especificidade de antígeno herdado. Um ensaio elispot revelou que quando cultivadas na presença de peptídeo MART1, as células T beta alfa beta monopositivos derivadas do iPSC secretam maiores quantidades de gama interferon em comparação com as células T alfa a granel e CD8. Nenhuma expressão gama de interferon foi detectada apenas para células T e células que apresentam antígenos, demonstrando que as células T derivadas do T-iPSC humanos são específicas de antígeno e funcionais.Um passo importante neste método é o enriquecimento de contas magnéticas CD4 para eliminar células CD4-negativas, CD8-negativos duplo-negativos, que podem causar morte direta de células dupla-positivas após a estimulação. Esta técnica é aplicável para uso com várias fontes de células humanas, incluindo células-tronco hematopoiéticas e células-tronco embrionárias. Células T imaturas derivadas do iPSC geradas por este método poderiam ser melhoradas ainda mais para a geração de células T ingênuas específicas do tumor humano maduro para uso terapêutico futuro.Depois de assistir a este vídeo, o espectador deve entender como gerar células T beta alfa beta monopositivos do iPSC usando o sistema de cocultura OP9-Delta-1.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Modelagem de osteossarcoma usando síndrome de Li-Fraumeni paciente-derivado induzido Pluripotent Stem Cells

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Pesquisa do câncer

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

Um sistema tridimensional da cultura Thymic para gerar os Emigrants Thymic antígeno-específicos induzidos pilha-derivados do tumor derivado murine

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Detecção de tempo real em Vitro Tumor celular apoptose induzida por CD8+ T células para estudar as funções imunológicas supressora de Tumor infiltrando células mieloides

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

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Fabricação de células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) para imunoterapia adotiva

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Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment

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Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

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Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Análise patológica da metástase pulmonar após injeção lateral de cauda-veia de células tumorais

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis

Geração de Xenoenxertos Larval de Zebrafish e Análise do Comportamento do Tumor

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly ...

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Transplante de tumor para avaliar a dinâmica das células CD8+ T que se infiltram em tumores em camundongos

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In vivo Triagem de imunogenicidade de vesículas extracelulares derivadas do tumor por citometria de fluxo de células T esplênicas

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...