Name: using human induced pluripotent stem cells for the generation of tumor antigen-specific t cells
Uploaded: 2019-10-24T13:00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells at JoVE.com

Мы благодарим Алана Б. Хуфринга и Эрину Х. Он за графическую помощь. Это исследование было поддержано Intramural исследовательской программы Национального института рака (ЗИА BC010763) и интрамуральной NCI рака Moonshot инициативы для клеточной иммунотерапии рака.

<ol>
	<li>Brauer, P. M., Singh, J., Xhiku, S., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cell+Genesis:+In+Vitro+Veritas+Est.">T Cell Genesis: In Vitro Veritas Est.</a> Trends in Immunology. 37 (12), 889-901 (2016).</li><li>Rosenberg, S. A., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+cell+transfer+as+personalized+immunotherapy+for+human+cancer.">Adoptive cell transfer as personalized immunotherapy for human cancer.</a> Science. 348 (6230), 62-68 (2015).</li><li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquisition+of+full+effector+function+in+vitro+paradoxically+impairs+the+in+vivo+antitumor+efficacy+of+adoptively+transferred+CD8++T+cells.">Acquisition of full effector function in vitro paradoxically impairs the in vivo antitumor efficacy of adoptively transferred CD8+ T cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (6), 1616-1626 (2005).</li><li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Durable+complete+responses+in+heavily+pretreated+patients+with+metastatic+melanoma+using+T-cell+transfer+immunotherapy.">Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T-cell transfer immunotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).</li><li>Crompton, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+relationship+of+CD8(+)+T+cell+subsets+is+revealed+by+progressive+changes+in+the+epigenetic+landscape.">Lineage relationship of CD8(+) T cell subsets is revealed by progressive changes in the epigenetic landscape.</a> Cellular and Molecular Immunology. 13 (4), 502-513 (2016).</li><li>Henning, A. N., Klebanoff, C. A., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+stemness+in+T+cell+differentiation.">Silencing stemness in T cell differentiation.</a> Science. 359 (6372), 163-164 (2018).</li><li>Henning, A. N., Roychoudhuri, R., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+control+of+CD8(+)+T+cell+differentiation.">Epigenetic control of CD8(+) T cell differentiation.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (5), 340-356 (2018).</li><li>Vodnala, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+stemness+and+dysfunction+in+tumors+are+triggered+by+a+common+mechanism.">T cell stemness and dysfunction in tumors are triggered by a common mechanism.</a> Science. 363 (6434), (2019).</li><li>Restifo, N. P., Gattinoni, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+relationship+of+effector+and+memory+T+cells.">Lineage relationship of effector and memory T cells.</a> Current Opinion in Immunology. 25 (5), 556-563 (2013).</li><li>Tran, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunotherapy+based+on+mutation-specific+CD4++T+cells+in+a+patient+with+epithelial+cancer.">Cancer immunotherapy based on mutation-specific CD4+ T cells in a patient with epithelial cancer.</a> Science. 344 (6184), 641-645 (2014).</li><li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+arrests+effector+T+cell+differentiation+and+generates+CD8++memory+stem+cells.">Wnt signaling arrests effector T cell differentiation and generates CD8+ memory stem cells.</a> Nature Medicine. 15 (7), 808-813 (2009).</li><li>Gautam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+c-Myb+regulates+CD8(+)+T+cell+stemness+and+antitumor+immunity.">The transcription factor c-Myb regulates CD8(+) T cell stemness and antitumor immunity.</a> Nature Immunology. 20 (3), 337-349 (2019).</li><li>Klebanoff, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+successful+CD8++T-cell+adoptive+immunotherapy+for+large+established+tumors+in+mice.">Determinants of successful CD8+ T-cell adoptive immunotherapy for large established tumors in mice.</a> Clinical Cancer Research. 17 (16), 5343-5352 (2011).</li><li>Klebanoff, C. A., Gattinoni, L., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorting+through+subsets:+which+T-cell+populations+mediate+highly+effective+adoptive+immunotherapy.">Sorting through subsets: which T-cell populations mediate highly effective adoptive immunotherapy.</a> Journal of Immunotherapy. 35 (9), 651-660 (2012).</li><li>Crompton, J. G., Clever, D., Vizcardo, R., Rao, M., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+antitumor+immunity.">Reprogramming antitumor immunity.</a> Trends in Immunology. 35 (4), 178-185 (2014).</li><li>Crompton, J. G., Rao, M., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memoirs+of+a+reincarnated+T+cell.">Memoirs of a reincarnated T cell.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 6-8 (2013).</li><li>Kennedy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+lymphocyte+potential+marks+the+emergence+of+definitive+hematopoietic+progenitors+in+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+cultures.">T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures.</a> Cell Reports. 2 (6), 1722-1735 (2012).</li><li>Vizcardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+human+tumor+antigen-specific+T+cells+from+iPSCs+derived+from+mature+CD8(+)+T+cells.">Regeneration of human tumor antigen-specific T cells from iPSCs derived from mature CD8(+) T cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 31-36 (2013).</li><li>Nishimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+rejuvenated+antigen-specific+T+cells+by+reprogramming+to+pluripotency+and+redifferentiation.">Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 114-126 (2013).</li><li>Lo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+recognition+of+a+shared+p53+mutated+neoantigen+in+a+patient+with+metastatic+colorectal+cancer.">Immunologic recognition of a shared p53 mutated neoantigen in a patient with metastatic colorectal cancer.</a> Cancer Immunology Research. , (2019).</li><li>Timmermans, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+T+cells+from+human+embryonic+stem+cell-derived+hematopoietic+zones.">Generation of T cells from human embryonic stem cell-derived hematopoietic zones.</a> Journal of Immunology. 182 (11), 6879-6888 (2009).</li><li>Maeda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+CD8alphabeta+T+Cells+from+T-cell-Derived+iPSC+Imparts+Potent+Tumor+Antigen-Specific+Cytotoxicity.">Regeneration of CD8alphabeta T Cells from T-cell-Derived iPSC Imparts Potent Tumor Antigen-Specific Cytotoxicity.</a> Cancer Research. 76 (23), 6839-6850 (2016).</li><li>Salter, R. D., Howell, D. N., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+regulating+HLA+class+I+antigen+expression+in+T-B+lymphoblast+hybrids.">Genes regulating HLA class I antigen expression in T-B lymphoblast hybrids.</a> Immunogenetics. 21 (3), 235-246 (1985).</li><li>Snauwaert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+mature,+naive+antigen-specific+CD8(+)+T+cells+with+a+single+T-cell+receptor+by+agonist+selection.">In vitro generation of mature, naive antigen-specific CD8(+) T cells with a single T-cell receptor by agonist selection.</a> Leukemia. 28 (4), 830-841 (2014).</li><li>Takahama, Y., Suzuki, H., Katz, K. S., Grusby, M. J., Singer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+selection+of+CD4++T+cells+by+TCR+ligation+without+aggregation+even+in+the+absence+of+MHC.">Positive selection of CD4+ T cells by TCR ligation without aggregation even in the absence of MHC.</a> Nature. 371 (6492), 67-70 (1994).</li><li>Seki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+terminally+differentiated+circulating+T+cells.">Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (1), 11-14 (2010).</li><li>Vodyanik, M. A., Slukvin, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematoendothelial+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells.">Hematoendothelial differentiation of human embryonic stem cells.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2007).</li><li>Vizcardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Tumor+Antigen-Specific+iPSC-Derived+Thymic+Emigrants+Using+a+3D+Thymic+Culture+System.">Generation of Tumor Antigen-Specific iPSC-Derived Thymic Emigrants Using a 3D Thymic Culture System.</a> Cell Reports. 22 (12), 3175-3190 (2018).</li><li>McNicol, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8alpha/alpha+homodimers+fail+to+function+as+co-receptor+for+a+CD8-dependent+TCR.">CD8alpha/alpha homodimers fail to function as co-receptor for a CD8-dependent TCR.</a> European Journal of Immunology. 37 (6), 1634-1641 (2007).</li><li>Themeli, M., Riviere, I., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+cell+sources+for+T+cell+engineering+and+adoptive+immunotherapy.">New cell sources for T cell engineering and adoptive immunotherapy.</a> Cell Stem Cell. 16 (4), 357-366 (2015).</li><li>Minagawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+T+Cell+Receptor+Stability+in+Rejuvenated+iPSC-Derived+T+Cells+Improves+Their+Use+in+Cancer+Immunotherapy.">Enhancing T Cell Receptor Stability in Rejuvenated iPSC-Derived T Cells Improves Their Use in Cancer Immunotherapy.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 850-858 (2018).</li><li>Montel-Hagen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid-Induced+Differentiation+of+Conventional+T+Cells+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Organoid-Induced Differentiation of Conventional T Cells from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 376-389 (2019).</li><li>Takada, K., Kondo, K., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Peptides+That+Promote+Positive+Selection+in+the+Thymus.">Generation of Peptides That Promote Positive Selection in the Thymus.</a> Journal of Immunology. 198 (6), 2215-2222 (2017).</li><li>Takada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR+affinity+for+thymoproteasome-dependent+positively+selecting+peptides+conditions+antigen+responsiveness+in+CD8(+)+T+cells.">TCR affinity for thymoproteasome-dependent positively selecting peptides conditions antigen responsiveness in CD8(+) T cells.</a> Nature Immunology. 16 (10), 1069-1076 (2015).</li><li>Vizcardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Three-dimensional+Thymic+Culture+System+to+Generate+Murine+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-derived+Tumor+Antigen-specific+Thymic+Emigrants.">A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants.</a> JoVE. , e58672 (2019).</li></ol>

Авторы не раскрытии информации.

Сокультура стромальных клеток OP9 murine является хорошо отлаженной системой для производства лимфоцитов in vitro (т.е., НК, В и Т)) из HSPCs и плюрипотентных стволовых клеток. Notch сигнализации требуется, чтобы вызвать T линии обязательств и может быть достигнуто эктопическим выражением Notch ligand DLL1 или DLL4, которые имеют сопоставимую эффективность для Т-клеток поколения1. Таким образом, система сокультуры OP9/DLL1 стала широко используемым методом производства Т-клеток in vitro.  Кроме того, этот метод применим для использования с несколькими типами и источниками человеческих клеток, включая пуповинную кровь, ГСКИ костного мозга и ESCs.  Однако генерация Т-клеток из этих источников ограничена либо недостаточным извлечением исходных клеток, либо неэффективной дифференциацией на Т-клетки1. Кроме того, продукт Т-клеток с одной рекомбинацией TCR не может быть создан из этих открытых источников репертуара. С помощью методов регенеративной медицины, а именно индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) технологии, это может быть возможно производить огромное количество антиген-специфических Т-клеток для использования в клеточной основе терапии15.
hiPSCs похожи на плюрипотентных ESCs в их способности к самообновлению, безграничное расширение, и потенциал, чтобы дифференцировать к любому типу соматических клеток в организме; однако, они не имеют этических проблем, связанных с использованием продуктов эмбрионального происхождения для клинического применения. Кроме того, HIPSCs может быть произведенизна из любой соматической клетки, что позволяет развитие клеточных продуктов для персонализированной медицины. В предыдущих докладах, HIPSCs были произведены из человеческих Т-клеток с использованием целых периферических моноядерных клеток, CD3и клеток, или изолированных цитотоксических Т-лимфоцитов (CTLs) в качестве источника18,19,22, 26. Когда hiPSCs генерируются из источника Т-клеток (T-iPSCs), первоначальная перестановка гена TCR наследуется. Таким образом, пациент T-iPSC полученных Т-клеток может обеспечить модель для персонализированного лечения ACT, ориентируясь на пациента различных антигенов рака.
Дифференциация человеческих плюрипотентных стволовых клеток в Т-линии клеток делится на два этапа: генерация гематопоиетических клеток-прародителей (HPCs)27 и их дальнейшая дифференциация на Т линейные клетки21. Оба шага могут быть выполнены с помощью системы совместной культуры OP9/DLL1. Важно отметить, что качество клеток-кормушек OP9/DLL1 имеет решающее значение для успеха дифференциации Т-клеток. Поскольку клетки OP9/DLL1 не являются увековеченной однородной клеточной линией, качество FBS и культурных условий имеют решающее значение для поддержания их расширения, не теряя при этом возможности поддерживать дифференциацию hiPSC. Поэтому рекомендуется предварительно оценить много FBS и проход последовательно, когда клетка к клетке цитоплазматический контакт начинает происходить, в целях предотвращения клеточной дифференциации и сенесценции. Один момент, чтобы принять во внимание то, что контакт между клетками может показаться неотличимым от фона в зависимости от фазы контраста и увеличения микроскопа. По нашему опыту, большинство блюд OP9/DLL1 будет казаться 80% сливовыми, когда они готовы к прохождению.
Было показано, что редифференцированные T линейные клетки, генерируемые из T-iPSCs OP9/DLL1 совместной культуры может производить CD8и SP Т-клеток при стимуляции18,19. Тем не менее, регенерированные CD8и SP Т-клетки приобретают врожденный, как CD8 "гомодимер22,28, который является неэффективным со-рецептором для TCR сигнализации29.  Кроме того, эти регенерированные CD8и SP Т-клетки показали сильную TCR-независимую цитотоксичность, что делает эти клетки неблагоприятными для клинического использования30. Этот протокол описывает недавний метод, включающий стимуляцию очищенного CD4иCD8- DP-клеток для генерации CD8 "- SP T-клеток с более обычным фенотипом и улучшенной антиген-специфической цитотоксичность22. Несмотря на то, что потеря специфичности антигена из-за вторичной tCR' аллеличная перестановка происходит на стадии DP после длительной долгосрочной культуры, это может быть преодолено путем редактирования генома в T-iPSCs31.  По нашему опыту, hiPSC-полученных DP-клеток начинают появляться на 30 - 35 день культуры, и эти вновь созданные dP-клетки еще не претерпели вторичной перестановки TCR. Таким образом, большинство клеток ДП на 35-й день сохраняют специфичность антигена и могут быть использованы для генерации антигена-специфических CD8 '- SP T-клеток.
До человека анти-CD3 и анти-CD28 стимуляции на 35 день, CD4-CD8- DN клетки должны быть удалены из культуры, так как они были продемонстрированы, чтобы вызвать прямое убийство CD4CD8и DP клеток после стимуляции22. Использование CD4 магнитного обогащения бисера (шаг 3.10) обогатит как для DP и CD4CD8- промежуточные одноположительные (ISP) клетки1, которые мы, как было показано, не имеют негативных последствий22. Кроме того, флуоресцентная сортировка клеток по цитометрии потока может быть выполнена для изоляции клеток ДП. Тем не менее, магнитное разделение биса является предпочтительным, как это позволяет избежать механического стресса, вызванного цитометрии потока.
Поколение CD8'- SP Т-клеток из человеческих плюрипотентных стволовых клеток без активации опосредования агонист выбор впоследствии было продемонстрировано с помощью 3D мурина стромальной культуры32. Однако физиологический положительный отбор зависит от взаимодействия TCR с комплексами самопептид-МХК, которые однозначно обрабатываются и представлены тимическими корковых эпителиальных клетками33. Кроме того, было показано, что сродство TCR к отбору пептидов определяет последующие функциональные возможности зрелых CD8 »- SP T-клеток34.  В настоящее время нет никаких доказательств того, что Notch stromal клеточной системы со-культуры может обеспечить определенный отбор пептид и MHC комплекс, необходимый для физиологического положительного отбора.
Ранее сообщалось в модели murine, что T линии клеток, генерируемых из опухолевых антигенов конкретных Т-клеток полученных hiPSCs с использованием OP9/DLL1 только не испытывают обычного созревания. Тем не менее, iPSC-полученных незрелых Т-клеток, генерируемых системой OP9/DLL1 может созреть в наивные Т-клетки путем дальнейшего физиологического тимического образования в системе 3D культуры 28,35. Таким образом, протокол, представленный здесь для производства iPSC полученных незрелых Т-клеток, генерируемых системой OP9/DLL1 имеет жизненно важное значение для дальнейших попыток создания реальных человеческих опухолевых антигенов конкретных пост-тимических Т-клеток, способных долгосрочной настойчивости в vivo с эффективность лечения устоявшихся васкуляризированных опухолей.

В дополнение к физиологическим преимуществам, Т-клетки имеют много потенциальных терапевтических применений. Генерация и расширение Т-клеток in vitro может быть использовано для моделирования заболеваний и терапевтической проверки, а также источником лечения наследственных и приобретенных состояний иммунодефицита (т.е. вирусных иммунодефицитов и лимфодепляции вторичных к химиотерапии или трансплантации) и для искоренения рака. Это последнее качество привело к развитию приемной передачи Т-клеток (ACT) для лечения пациентов с запущенным раком1.
ACT состоит из резекции опухоли пациента, извлечения опухолевых лимфоцитов (TILs), расширение TILs ex vivo, а затем reinfusing расширенные клетки в пациента2. Было показано, что эффективная методика лечения для некоторых пациентов с метастатическим раком.  К сожалению, не все пациенты реагируют на эту терапию. Предыдущие отчеты показали, что дифференциация состояния переданных ячеек3,4,5,6,7,8,9, использование больших чисел высокообогащенного рака антиген-специфических Т-клеток10, и сохранение Т-клеток после передачи11,12 все коррелируют с более прочными ответами13,14. Поэтому, когда ACT не в состоянии вызвать противоопухолевую реакцию, это может отчасти из-за низкой урожайности рака антиген-специфических Т-клеток, неэффективное расширение ex vivo, приводящее к истощению и потере реактивных клонов, или отсутствие настойчивости после передачи4 . Было постулировано, что эти препятствия могут быть преодолены путем генерации большого числа менее дифференцированных антигена рака конкретных Т-клеток в пробирке15,16.
Гематопоиэтисические стволовые/прародители клетки (HSPCs) являются обычным источником для генерации клеток in vitro T, хотя этот метод ограничен небольшим количеством клеток, которые могут быть извлечены из одного донора1. Эмбриональные стволовые клетки (ESC) также были показаны для производства Т-клеток, но с низкой урожайностью17, что делает его неэффективным для клинического применения. Кроме того, поскольку T линейные клетки испытывают стохастические генетические рекомбинации своих Т-клеточных рецепторов (TCRs) на ранних стадиях развития, невозможно использовать HSPCs или ESCs для создания чистой популяции антиген-специфических Т-клеток без дальнейших геномных модификации, такие как трансдукция генов TCR.
Один из подходов к преодолению этих оговорок заключается в перепрограммировании TILs для индуцированных человека плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs), которые могут обеспечить безграничный источник для генерации т-клеток in vitro. Было показано, что рак антиген-специфических TILs могут быть перепрограммированы в hiPSCs и вновь дифференцированы к линии Т-клеток, которая сохраняет тот же Рецептор Т-клеток (TCR) гена перестановки, как оригинальный Т-клеток18,19.  Эта деталь важна для ACT, потому что отдельные опухоли пациента имеют уникальные мутационные профили, и очень немногие антигены рака были показаны, чтобы быть общим среди пациентов20. Таким образом, использование рака антигена конкретных TILs в качестве источника для в ипроцпредства поколения hiPSC полученных Т-клеток может обеспечить новую стратегию для персонализированного лечения пациентов с метастатическим раком.
Представлено здесь подробно протокол для дифференциации hiPSC полученных T линейных клеток в функциональных антиген-специфических CD8 "- один положительный (SP) Т-клеток с использованием OP9/DLL1 совместной культуры системы. Этот метод является мощным инструментом для дифференциации клеток in vitro T hiPSCs, гематопоиетических прародителей и эмбриональных стволовых клеток, а также их дальнейшего применения в регенеративной медицине и клеточной терапии.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >10 cm dish</td>
			<td >Corning, Inc.&#160;</td>
			<td >353003</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD3, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 561812, RRID:AB_1089628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD34, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >Cat# 348791, RRID:AB_400381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD4, human</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td>Cat# 344612, RRID:AB_2028479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD43, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >Cat# 560198, RRID:AB_1645460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD7, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 555361, RRID:AB_395764</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD8a, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 555369, RRID:AB_398595</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD8b, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >Cat# 641057, RRID:AB_1645747</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-TCRb, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >Cat# 555548, RRID:AB_395932</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD28 human monoclonal antibody (15E8), pure functional grade</td>
			<td >Miltenyl Biotec</td>
			<td>130-093-375</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD3 human monoclonal antibody (OKT3), pure functional grade</td>
			<td >Miltenyl Biotec</td>
			<td>130-093-387</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD4 Microbeads, human</td>
			<td >Miltenyl Biotec</td>
			<td >130-045-101</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell strainer 100 um</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >22-363-549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td >Gemini</td>
			<td >100-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Flt-3 ligand</td>
			<td >R&#38;D Systems</td>
			<td >427-FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gelatin Solution 2%&#160;</td>
			<td>SIGMA-Aldritch</td>
			<td>G1393-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GlutaMAX (100X)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >35050-061</td>
			<td >L-Glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HBSS Mg+Ca+ Phenol-Red Free</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Interleukin-2</td>
			<td >R&#38;D Systems</td>
			<td >202-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Interleukin-7</td>
			<td >R&#38;D Systems</td>
			<td >407-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >iTAG MHC Tetramer HLA-A*0201 Mart1 Tetramer -ELAGIGILTV</td>
			<td >MBL</td>
			<td >Cat#TB-0009-2</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mart1-hiPSC</td>
			<td >Vizcardo et al., Cell Stem Cell 2013</td>
			<td >RIKEN-IMS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Melan-A, MART 1 (26-35)</td>
			<td >InnoPep</td>
			<td >3146-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#945;MEM powder</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >61100061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C57BL/6 MEF MITC-TREATED 4M EACH; A34962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >OP9/N-DLL1</td>
			<td >Riken Bioresource center</td>
			<td >Cat# RCB2927; RRID:CVCL_B220</td>
			<td >OP9/DLL1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/streptomycin</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate buffered saline pH 7.4 (1x)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primate ES Cell Medium</td>
			<td >Reprocell</td>
			<td >RCHEMD001</td>
			<td >Human ESC Culture Media</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rhok inhibitor (Y-27632 dihydrochloride)</td>
			<td >Tocris</td>
			<td >1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RPMI 1640</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td >R&#38;D Systems</td>
			<td >455-MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >StemPro</td>
			<td >EZPassage</td>
			<td >23181-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T2-tumor</td>
			<td >ATCC</td>
			<td>T2 (174 x CEM.T2) (ATCC&#174; CRL-1992&#8482;)&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red&#160;</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red&#160;</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >U Bottom 96 well plate</td>
			<td >Corning, Inc.&#160;</td>
			<td >3799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using human induced pluripotent stem cells for the generation of tumor antigen-specific t cells

Генерация и расширение функциональных Т-клеток in vitro может привести к широкому спектру клинических применений. Одним из таких применений является лечение пациентов с запущенным раком. Было показано, что приемная передача Т-клеток (ACT) высокообогащенных опухолевых антиген-специфических Т-клеток вызывает прочную регрессию метастатического рака у некоторых пациентов. Однако, во время расширения, эти клетки могут стать исчерпаны или старческие, ограничивая их функции эффектора и настойчивость в vivo. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC) технология может преодолеть эти препятствия, что приводит к в пробирке поколения большого количества менее дифференцированных опухолевых антиген-специфических Т-клеток. Человеческий iPSC (hiPSC) имеет способность дифференцироваться в любой тип соматических клеток, включая лимфоциты, которые сохраняют исходный рецептор Т-клеток (TCR) геномные перестановки, когда Т-клетка используется в качестве стартовой клетки. Таким образом, перепрограммирование человеческих опухолевых антиген-специфических Т-клеток в hiPSC с последующим повторением к линии Т-клеток имеет потенциал для производства помолодевших опухолевых антигенов конкретных Т-клеток. Описанный здесь метод для генерации опухолевых антиген-специфических CD8"- одиночные положительные (SP) Т-клетки от hiPSC с помощью OP9/DLL1 системы совместной культуры. Этот метод является мощным инструментом для генерации линии линии in vitro T и будет способствовать развитию in vitro полученных Т-клеток для использования в регенеративной медицине и клеточной терапии.

После 13 дней hiPSCs со-культивирования с OP9/DLL1, CD34cd43й гематопоитетические клетки-предродителя появились (Рисунок 1). После дополнительных 22 дней культуры на не-желатинизированных OP9/DLL1 в присутствии hSCF, hFLT3L, и hIL-7, гематопоиетическиепрародители дифференцированы вCD3 большинство из которых выразили TCR специфичны для ЭПитопа MART-1 (тетрамер)(рисунок 2).
Ранее было показано, что CD8и SP Т-клетки могут быть индуцированы из CD4иCD8DP T-клеток TCR сигнализации через агонист пептид или антитела инициативе TCR стимуляции24,25. Таким образом, на 35-й день культуры, hiPSC-производные CD4иD8DP T-клетки были стимулированы с анти-человеческих CD3 и антител CD28 в присутствии hIL-7 и hIL-2.  Через четыре дня после стимуляции, количество CD3иCD8 "SP-клеток резко увеличилось и оставалось специфическим для ЭПитопа MART-1, подтверждая сохранение их унаследованной антиген-специфическости (Рисунок 3).
Для определения функциональных свойств хиПС-производных CD8 'SP T-клеток, антиген-зависимой активации и секреции интерферона гамма (IFN-я) был проанализирован. После стимуляции античеловеческими CD3 и антителами CD28 в течение 1 недели, HIPSC-производные CD8» - SP T-клетки были выделены с помощью сортировки клеток и совместно культивированы с линией т2 клеток, выражающей HLA-A:01 с или без cognate MART1 пептид для 16 - 20 h. Проверка ELISpot показала, что hiPSC-производные CD8 »- SP T-клетки выделяют более высокое количество IFN-я по сравнению с CD8 »и SP T-клеток, когда культивируется в присутствии ПЕПтида MART-1. Выражение IFN-я было недействительным для Т-клеток и АПК в одиночку, демонстрируя, что человеческие Т-iPSC полученных Т-клеток антиген-специфических и функциональных (Рисунок 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59997/59997fig1.jpg"> Рисунок 1: Поколение клеток гематопоитического прародителя, полученных из hiPSC. (A) Схематический обзор дифференциации hiPSCs к гематопоитической линии с использованием OP9/DLL1 совместной культуры. (B) Появление hiPSC-производных структур на днях 1 (вверху слева), 3 (вверху справа), 7 (внизу слева) и 13 (внизу справа). Шкала баров 100 мкм. (C) Поток цитометрического анализа hiPSC полученных CD34cd43й гематопоитетические клетки-прародители на день 13. Данные представляют шесть независимых экспериментов (n no 1 к 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59997/59997fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59997/59997fig2.jpg"> Рисунок 2: дифференциация hiPSC в Mart1 и CD4,CD8 " (A) Схематический обзор дифференциации hiPSC полученных гематопоитической линии на незрелые Т-клетки с использованием OP9/DLL1 совместной культуры. (B) Поток цитометрического анализа CD4 против CD8 ", CD3 против CD8" и MART-1 тетрамер выражение в hiPSC полученных Т-клеток на 35-й день. Закрытые на лимфоциты, одиночные клетки, PI отрицательный. Данные являются репрезентативными из трех независимых экспериментов (n No 3 - 8). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59997/59997fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59997/59997fig3.jpg"> Рисунок 3: Индукция CD8 "- ФЕнотип Т-клеток SP. Поток цитометрического анализа CD4- HiPSC полученных Т-клеток через 4 дня после человека анти-CD3 и человека анти-CD28 антитела инициативе стимуляции. Закрытые на лимфоциты, одиночные клетки, ИП отрицательные (n No 4).   <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59997/59997fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59997/59997fig4.jpg"> Рисунок 4: Антигенная специфичность hiPSC-производных CD8 »- SP Т-клеток. IFN-я секреция ELISpot ассси hiPSC-производных CD8" SP, CD8" SP, и объемНые Т-клетки после 20 ч совместной культуры с или без T2 клеток импульсных (или нет) с MART-1 пептид. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59997/59997fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells at JoVE.com

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

В этой статье описывается метод генерации функциональных опухолевых антигенов-специфических индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных CD8 "- один положительных Т-клеток с помощью OP9/DLL1 совместной культуры системы.

Использование человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток для поколения опухолевых антигенов конкретных Т-клеток

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Мы представляем метод для генерации человека индуцированной плюрипотентных стволовых клеток, полученных опухолевых антиген-специфических CD8 альфа-бета однопогодных Т-клеток с помощью OP9-Delta-1 совместной культуры системы. Этот метод является мощным инструментом для выработки Т-клеток in vitro и будет способствовать развитию Т-клеток, полученных в пробирке, для использования в регенеративной медицине и клеточной терапии. Он также может быть адаптирован для генерации других лимфоцитов, таких как НК-клетки.При выполнении этого метода, важно предварительно оценить много FBS и прохождения OP9-Delta-1 клетки последовательно, когда от клетки к клетке цитоплазмический контакт начинают предотвращать дифференциацию клеток и сенесценции. Демонстрацией процедуры будет доктор Меган Гуд, хирургическая онкология из моей команды. Начните с проверки человеческих колоний iPSC в стерео-микроскопе, и удалите любые области дифференциации от культуры с пластиковым краем 200-микролитрового наконечника пипетки.Когда диаметр колоний достигает от 0,8 до 1,2 миллиметра, проходят человеческие iPSCs. Аспирировать оттраченные средства массовой информации, и добавить 10 миллилитров человека iPSC средств массовой информации дополняется 10-микромолярный ингибитор ROCK. Roll одноразовые ячейки проходной инструмент по всей блюдо в одном направлении, убедившись, что для поддержания равномерного давления и что весь ролик лезвие касается культуры блюдо.Поверните культуру блюдо 90 градусов, и повторить прокатки. Визуально подтвердить правильную резку колоний с помощью микроскопа. Они должны казаться клетчатыми.Затем отсоедините разрезанные колонии нежным механическим промывкой 200-микролитровой пипеткой. Визуально оцените количество колоний комков и перенесите от 350 до 600 комков в новое 10-сантиметровое блюдо эмбриональных фибробластов мыши с 10 миллилитров свежих человеческих iPSC-средств, дополненных ингибитором ROCK. Инкубировать блюдо на ночь при 37 градусах по Цельсию.На следующий день, аспирировать провел средств массовой информации, и добавить 10 миллилитров свежих человеческих средств массовой информации iPSC. Изменение мультимедиа каждые один или два дня, в зависимости от скорости роста ячейки. Культура OP9-Delta-1 клетки в OP9 СРЕДСТВ массовой информации при 37 градусов по Цельсию.Когда они достигают слияния, аспирировать средства массовой информации, и мыть клетки один раз с пятью миллилитров 1x магния, кальция и фенола красный свободный PBS. Аспирировать PBS, добавить два миллилитров 05%трипсина-ЭДТА, и инкубировать клетки в течение пяти минут при 37 градусов по Цельсию. Затем добавьте четыре миллилитров средств OP9 и механически отмежевать клеточный слой от труб.Перенесите подвеску клетки в 50-миллилитровую коническую трубку через 100-микрометровый клеточный ситечко и центрифугу при 300 градусах при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Аспирировать супернатант и повторно помыть клетки в 12 миллилитров СРЕДСТВ OP9. Добавьте восемь миллилитров средств массовой информации OP9 к каждому из шести новых блюд клеточной культуры, и пластины два миллилитров OP9-дельта-1 клеточной подвески на каждом блюде.Рок блюдо из стороны в сторону и спереди назад, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток. Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию, и повторить проход, когда клетки достигают слияния. Приготовьте желатинированные блюда OP9-Delta-1 за неделю до совместной культуры с человеческими iPSCs.Добавьте четыре миллилитров 0,1%желатина к трем новым блюдам клеточной культуры и инкубировать их в течение 30 минут при 37 градусах по Цельсию. После инкубации, аспирировать желатин, и добавить восемь миллилитров OP9 средств массовой информации для каждого блюда. Прохождение одного стеченного блюда op9-Delta-1 клеток до трех желатин покрытием блюд.Через четыре дня, добавить 10 миллилитров OP9 средств массовой информации для каждого блюда клеток, в общей сложности 20 миллилитров средств массовой информации на блюдо. Начните совместное культуру человека iPSC на OP9-Delta-1 стеченных блюд семь-восемь дней после прохода клеток. Оспирировать средства массовой информации из стечения блюдо человека iPSCs, и добавить 10 миллилитров OP9 средств массовой информации.Отрежьте и отсоедините колонии клеток с помощью одноразового инструмента пропуска клеток и перенесите от 350 до 600 скоплений разрезанных колоний на предварительно желатинизированное блюдо OP9-Delta-1 с 10 миллилитров свежих средств массовой информации OP9. Рок культуры блюдо из стороны в сторону и спереди назад, чтобы обеспечить равномерное распределение колоний. На следующий день, аспирировать провел средств массовой информации, и заменить его на 20 миллилитров свежих средств массовой информации OP9.Человеческие скопления iPSC, со-культурные на OP9-Delta-1 в течение одного дня, должны выглядеть как маленькие, круглые, однослойные колонии. На пятый день, аспирировать 10 миллилитров оттраченных средств массовой информации, и добавить 10 миллилитров свежих средств массовой информации OP9. Колонии начнут дифференцироваться в примитивный мезодерм, который характеризуется многослойным темным центром.Повторите этот процесс на девятый день, после чего многослойные центральные конструкции будут эволюционировать в куполообразные формы. Урожай гематопоэтических клеток-предшественников на 13-й день, после чего структуры состоят из темного центрального органоида, окруженного сетью куполоподобных областей. Аспирировать средства массовой информации, и мыть клетки один раз с пятью миллилитров 1x фенол красно-бесплатный раствор соли Hanks'balanced с кальцием и магнием, или HBSS.После мытья добавьте 250 микролитров коллагеназы 5 000 единиц на миллилитр IV до 10 миллилитров HBSS. Добавить смесь в клетки, и инкубировать их при 37 градусов по Цельсию в течение 45 минут. Аспирировать смесь HBSS-коллагеназы, и мыть клетки один раз с пятью миллилитров PBS.После мытья с PBS, добавить пять миллилитров 0,25%трипсина-ЭДТА, и инкубировать клетки при 37 градусов по Цельсию в течение 20 минут. Затем добавьте четыре миллилитров мультимедиа OP9 и отмежеваться от клеточного слоя путем трубопроводов, чтобы сделать одноклеточную подвеску. Перенесите подвеску клетки в 50-миллилитровую коническую трубку через 100-микрометровый ситечко и центрифугировать трубку при 300 г и четыре градуса по Цельсию в течение пяти минут.Аспирировать супернатант, и повторного перерасхода клеток в 10 миллилитров OP9 средств массовой информации. Плита клеточной суспензии на новый желатиновый 10-сантиметровый элемент культуры блюдо, и инкубировать их при 37 градусов по Цельсию в течение 45 минут. Затем соберите любые неприемные клетки, нежно трубя.Перенесите подвеску клетки в 50-миллилитровую коническую трубку через ситечко и центрифугу, как описано ранее. Затем, аспирировать супернатант, и повторного перерасхода клеток в 10 миллилитров дифференциации средств массовой информации. Плита клеточной подвески на новое op9-Delta-1 слияние блюдо.Проходят клетки на 16-й день в соответствии с рукописными указаниями и продолжают проходить через неприемные клетки каждые пять-семь дней после этого. После 35 дней дифференциации обогатить CD4-положительной популяции клеток CD4 магнитной изоляции шарика в соответствии с протоколом производителя. Затем, повторное приостановление клеток в OP9 средств массовой информации, и пластины один миллилитр клеточной подвески в каждом колодец ткани культуры, плоский дно, 24-хорошо пластины стечения OP9-Delta-1.Стимулируя клетки, добавляя 100 международных единиц человеческого IL-2, пять нанограммов человеческого IL-7, 500 нанограммов анти-человеческого антитела CD3, и два микрограмма анти-человеческого антитела CD28 к каждой хорошо. Через четыре-семь дней клетки могут быть собраны для дальнейшего анализа. После культуры на не желатинизированных OP9-Дельта-1 в присутствии человеческого фактора стволовых клеток, человека FLT3-лиганд, и человека интерлеукин-7, гематопоэтические прародители дифференцированы в CD3, CD7, CD4, и CD8 двойной положительной Т-линии клеток, большинство из которых выразили Т-клеточных рецепторов, характерных для ЭПИтопа MART1.Когда CD4, CD8 двойной положительный Т-клеток были стимулированы анти-человеческих CD3 и CD28 антител в присутствии человека интерлейкин-7 и 2, число CD3-положительных CD8 альфа-бета-однопозитимных клеток увеличилось и остается специфическим для эпитопа MART1, подтверждающие сохранение их унаследованной специфичности антигена. Анализ ELISpot показал, что, когда культурный в присутствии пептида MART1, человека iPSC-производных CD8 альфа-бета-однополучевых Т-клеток выделяют большее количество интерферона гамма по сравнению с объемными и CD8 альфа альфа-альфа-однополучевых Т-клеток. Не было обнаружено никакой гамма-экспрессии интерферона только для Т-клеток и антиген-представляя клеток, демонстрируя, что Т-клетки, полученные человеком T-iPSC, являются специфическими и функциональными.Важным шагом в этом методе является CD4 магнитного обогащения бисера для устранения CD4-отрицательных, CD8-отрицательных двойных отрицательных клеток, которые могут вызвать прямое убийство двойных положительных клеток при стимуляции. Этот метод применим для использования с несколькими источниками человеческих клеток, включая гематопоэтические стволовые клетки и эмбриональные стволовые клетки. iPSC полученных незрелых Т-клеток, порожденных этим методом может быть дополнительно улучшена для генерации зрелых опухолевых антигенов человека конкретных наивных Т-клеток для будущего терапевтического использования.После просмотра этого видео, зритель должен понять, как генерировать человека iPSC полученных CD8 альфа-бета-одно-положительных Т-клеток с помощью OP9-Delta-1 совместной культуры системы.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Моделирование остеосаркома, используя синдром ли Фраумени, которую пациент производные индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

Трехмерная тимическая культурная система для генерации Murine индуцированных Плюрипотентные стволовые клетки полученных Опухолевые антигена конкретных Тимических эмигрантов

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Режиме реального времени обнаружения в апоптоз клеток in Vitro опухоли индуцированные CD8 клетки+ T для изучения подавляющей иммунные функции проникновения опухоли миелоидных клеток

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Производство химерных антигенных рецепторов (CAR) Т-клеток для приемной иммунотерапии

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment

Изоляция и расширение цитотоксических цитотинов индуцированных Killer T-клеток для лечения рака

Adoptive cellular immunotherapy focuses on restoring cancer recognition via the immune system and improves effective tumor cell killing. Cytokine-induced ...

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Анализ опухоли и распределения тканей целевого антигена специфических терапевтических антител

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Патологический анализ метастазирования в легкие после инъекции опухолевых клеток в латеральную хвостовую вену

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis

Поколение зебрафиш Ларвал Ксенотрансплант и анализ поведения опухолей

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly ...

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Трансплантация опухоли для оценки динамики инфильтрирующих опухоль CD8+ Т-клеток у мышей

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

В городе Виво Скрининг иммуногенности внеклеточных везикул опухолевого происхождения методом проточной цитометрии селезеночных Т-клеток

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...