Name: using human induced pluripotent stem cells for the generation of tumor antigen-specific t cells
Uploaded: 2019-10-24T13:00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells at JoVE.com

Vi tackar Alan B. Hoofring och Erina H. Han för grafisk hjälp. Denna forskning stöddes av intramural forsknings program av National Cancer Institute (ZIA BC010763) och intramural NCI cancer Moonshot initiativ för cellbaserad cancer immunoterapi.

1. culturing Human iPSCs (hiPSCs) på mus embryonala fibroblaster (MEF)
Anmärkning: Alternativa metoder för odling av hiPSCs kan också användas, inklusive men inte begränsat till: sådd på en 6 väl platta pre-belagda med gelatin, en gelatinös proteinblandning, rekombinant laminin 511, eller någon annan extracellulär matris som används i hiPSC expansion, och odlas med hjälp av definierade medier speciellt framtagen för mänsklig pluripotenta stamcells kultur.
<ol><li>
Culturing MEF
	<ol>
<li>Coat en 10 cm cellkultur petriskål med 4 mL 0,1% gelatin och inkubera i 30 min vid 37 ° c.</li>
		<li>Tina en injektionsflaska med 4 x 106 bestrålade MEF snabbt i 10 ml 37 ° c MEF media (DMEM + 10% FBS + 1x penicillin-streptomycin + 1x L-glutamin tillägg). Centrifugera vid 300 x g i 5 min vid 4 ° c. Aspirera på supernatanten och Omsuspendera cellpelleten i 9 mL MEF-media.</li>
		<li>Ta bort den gelatin-belagda skålen från inkubatorn. Aspirera gelatin och tillsätt 7 mL MEF-media. Platta 3 mL MEF suspension (från steg 1.1.2) på den gelatin-belagda skålen. Vagga skålen sida till sida och fram-till-back för att säkerställa jämn fördelning av MEF över skålen. Inkubera vid 37 ° c för 8-36 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Passaging hiPSC på MEF Obs: data har genererats med Mart-1 iPSC härrör från långsiktiga odlade melanom til, som specifikt erkänna Mart-1 peptid i samband med HLA-A * 02:01, som tidigare beskrivits18.<ol>
<li>Passage hiPSCs när kolonier är mellan 0,8-1,2 mm i diameter. Före passaging, kontrollera hiPSC kolonier i en stereo-Mikroskop och ta bort alla områden av differentiering från kulturen med hjälp av plast kanten av en 200 μL spets.</li>
		<li>Aspirera tillbringade medier och tillsätt 10 mL hiPSC media (Human ES kultur Media [tabell över material] + 10 ng/ml Human grundläggande fibroblast tillväxtfaktor [hbFGF]) kompletteras med 10 μm rock inhibitor.</li>
		<li>Håll cellkultur skålen i ena handen och rulla en disponibel cell passaging verktyg över hela skålen i en riktning. Applicera tillräckligt med tryck så att hela rullbladet vidrör odlings skålen och bibehålla ett enhetligt tryck under rullande action.</li>
		<li>Rotera kultur skålen 90 ° och upprepa steg 1.2.3. Visa plattan i mikroskopet för att visuellt bekräfta korrekt kapning av kolonierna, som bör visas rutig. Lossa de klippta kolonierna genom skonsam mekanisk spolning med en 200 μL pipett. Anmärkning: Avlossning av skurna kolonier genom mekanisk spolning måste göras omedelbart efter styckning kolonier med rullen, eftersom efter 3 min de skurna kolonierna kommer att börja sätta tillbaka till skålen, och det kommer att bli svårt att lossa kolonier av homogen storlek genom spolning.</li>
		<li>Överföring 350-600 klumpar av klippta kolonier på en ny 10 cm maträtt av MEF (pläterad 8-36 h före hiPSC passaging) med 10 mL färskt hiPSC Media kompletteras med 10 μM ROCK inhibitor. Inkubera vid 37 ° c. Anmärkning: 600 klumpar representerar cirka 1,0 x 106 Mart-1 IPSC och kommer att ge 0.5-1.0 x 106 DP celler på dag 35. Förväntat antal kommer dock att variera beroende på styrkan hos start cells linjen och odlingsförhållandena.</li>
		<li>Följande dag, aspirera tillbringade media och tillsätt 10 mL färskt hiPSC media. Ändra hiPSC Media varje 1-2 dagar beroende på hiPSC tillväxttakt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. beredning av OP9/DLL1 celler för samodling med hiPSCs
<ol><li>Kultur OP9/DLL1 celler i OP9 Media [α-minsta essentiella mediet (α-MEM) + 20% fetalt bovint serum (FBS) + 1x penicillin-streptomycin] vid 37 ° c. När OP9/DLL1 celler når confluency, aspirera media och tvätta en gång med 5 mL 1x magnesium, kalcium och fenol rödfri fosfatbuffrad saltlösning (PBS).</li>
	<li>Sug upp PBS och tillsätt 2 mL 0,05% trypsin-EDTA.  Inkubera i 5 min vid 37 ° c. Lägg sedan till 4 mL OP9 media och separera mekaniskt cell lagret genom att Pipettera för att göra en encellig suspension.</li>
	<li>Överför cellsuspensionen till ett 50 mL koniskt rör genom en cell SIL på 100 μm för att undvika cell klumpar. Centrifugera vid 300 x g i 5 min vid 4 ° c. Aspirera på supernatanten och Omsuspendera i 12 mL OP9 media.</li>
	<li>Tillsätt 8 mL OP9 media till var och en av sex nya 10 cm cellkulturer petriskålar. Platta 2 mL OP9/DLL1 cellsuspension från steg 2,3 till varje ny 10 cm skålen. Rock skålen sida till sida sedan fram-till-back för att säkerställa jämn fördelning av OP9/DLL1 över skålen.</li>
	<li>Inkubera vid 37 ° c. Upprepa passage var 2-3 dagar när cellerna når confluency. Anmärkning: Det är viktigt att göra tillräckligt fryst lager av OP9/DLL1 celler och Tina ett nytt lager varje 4-6 veckor.</li>
</ol>3. in vitro-differentiering av hiPSCs till CD8αβ+ singelpositiva (SP) T-celler
<ol><li>Förbered gelatiniserad OP9/DLL1 rätter en vecka före samodling med hipscs. För att förbereda 0,1% gelatin lösning, tillsätt 5 mL rumstemperatur (RT) vävnad-grade lager gelatin lösning till 500 mL PBS.
	<ol>
<li>Coat 3 nya 10 cm cellkultur petriskålar genom att tillsätta 4 mL per maträtt av 0,1% gelatin.  Inkubera 30 min vid 37 ° c.</li>
		<li>Aspirera gelatin och tillsätt 8 mL OP9 media till varje maträtt. Passage en konfluenta skålen med OP9/DLL1 (som görs i avsnitt 2 ovan) till tre gelatin förbehandlade rätter.</li>
	</ol></li>
	<li>Efter 4 dagar, tillsätt 10 mL OP9 media till varje 10 cm skålen med OP9/DLL1 på gelatin, för totalt 20 mL Media per maträtt.</li>
	<li>Efter 7-8 dagar, börja hipsc Co-Culture på OP9/DLL1 konfluenta rätter (differentiering dag 0).
	<ol>
<li>Aspirera tillbringade media från konfluenta 10 cm fat hipscs på MEF. Tillsätt 10 mL OP9-media. Klipp ut och lossa hiPSC-kolonier med hjälp av ett engångscells passaging-verktyg som görs i steg 1.2.3 och 1.2.4.</li>
		<li>Överföring 350-600 klumpar av klippta kolonier på en 10 cm pre-gelatinized OP9/DLL1 skålen (steg 3,1) med 10 mL färskt OP9 media med en 200 μL pipett. Rock kultur skålen sida till sida sedan fram-till-back för att säkerställa jämn fördelning av kolonier. Obs: Alternativt kan förformade hipsc embryoid kroppar (EBS) eller liten klump suspension användas.  Emellertid, användningen av en disponibel cell passaging verktyg eller EB formation system är att föredra att producera hiPSC klumpar av enhetlig storlek.</li>
	</ol></li>
	<li>På dag 1, aspirera förbrukade medier och Ersätt med 20 mL färskt OP9 media. hipsc klumpar Co-odlade på OP9/DLL1 för 1 dag kommer att visas som små runda enskiktslager kolonier (figur 1).</li>
	<li>På dag 5, aspirera 10 mL förbrukade medier och tillsätt 10 mL färskt OP9 media. hiPSC kolonier kommer att börja differentiera till primitiva mesoderm, som kännetecknas av en mångbottnad mörk centrum.</li>
	<li>På dag 9, aspirera 10 mL förbrukade medier och tillsätt 10 mL färskt OP9 media. Vid denna punkt kommer flerskiktade centrum strukturer utvecklas till kupolliknande former, och en perifer nätverksliknande område kommer att börja bli uppenbar.</li>
	<li>På dag 13, skörd hematopoietiska progenitorceller (HPCs) (figur 1). hiPSC-härledda strukturer på dag 13 kännetecknas av en mörk Central Organoid omgiven av ett nätverk av kupolliknande områden, företrädare för hematopoietiska zoner (HZs) tidigare rapporterat att bifoga mänskliga embryonala stamceller härledda hematopoietiska progenitorer 21. Obs: närvaron av kupolliknande strukturer indikerar en lyckad process även i avsaknad av mörka centra. Oförmågan att producera HPCs kan bero på dålig kvalitet på OP9/DLL1, kvalitet FBS Lot, confluency av iPSC klumpar seedade på OP9/DLL1 (350-600 klumpar är optimal), och/eller variationer i potensen av iPSC linjer för att producera hematopoietiska prekursorer.<ol>
<li>Aspirera förbrukade medier och tvätta 1x med 5 mL 1x fenolröd-fri Hanks balanserade saltlösning modifierad med kalcium och magnesium (HBSS).</li>
		<li>Aspirera HBSS och tillsätt 250 μL av 5000 enheter/mL kollagenas IV i 10 mL HBSS. Inkubera vid 37 ° c i 45 min. Aspirera HBSS med kollagenase IV och tvätta en gång med 5 mL PBS.</li>
		<li>Sug upp PBS och tillsätt 5 mL 0,25% trypsin-EDTA. Inkubera vid 37 ° c i 20 min. Tillsätt sedan 4 mL OP9 media och separera cell skiktet genom att Pipettera för att göra en encellig suspension.</li>
		<li>Överför cellsuspensionen till ett 50 mL koniskt rör genom en cell SIL med 100 μm.  Centrifugera vid 300 x g i 5 min vid 4 ° c. Sug upp supernatanten och Omsuspendera i 10 mL OP9 media.</li>
		<li>Tallrik cell fjädring på en ny gelatiniserad 10 cm cell-kultur petriskål (se steg 3.1.1 och 3.1.2). Inkubera vid 37 ° c i 45 min. Samla sedan icke-adherenta celler genom skonsam pipettering.</li>
		<li>Överför insamlad cellsuspension till ett 50 mL koniskt rör genom en cell SIL på 100 μm.  Centrifugera vid 300 x g i 5 min vid 4 ° c. Aspirera på supernatanten och Omsuspendera i 10 mL differentieringsmedia [OP9 media med 5 ng/mL Human stamcells faktor (hSCF), 5 ng/mL Human FLT3 ligand (hFLT3L) och 5 ng/mL Human interleukin 7 (hIL-7)].</li>
		<li>Platta cellsuspensionen på en ny 10 cm OP9/DLL1 konfluenta skålen.</li>
	</ol></li>
	<li>På dag 16, passage cellerna.
	<ol>
<li>Lossa de icke-adherenta cellerna mekaniskt genom att försiktigt Pipettera och filtrera genom en cell SIL på 100 μm. Centrifugera vid 300 x g i 5 min vid 4 ° c. Aspirera på supernatanten och Omsuspendera i 10 mL differentieringsmedia.</li>
		<li>Platta cellsuspensionen på en ny 10 cm OP9/DLL1 konfluenta skålen.</li>
	</ol></li>
	<li>Fortsätt att föra över icke-adherenta celler var 5-7: de dagar därefter genom att upprepa steg 3,8.</li>
	<li>På dag 35, berika CD4+CD8+ dubbel positiv (DP) population och stimulera till att producera CD8αβ+ SP T celler (figur 2).
	<ol>
<li>Mekaniskt lossa icke-adherenta celler genom att försiktigt Pipettera och filtrera genom en cell SIL på 100 μm för att ta bort cell klumpar. Berika CD4+ cellpopulation av CD4 magnetisk pärla isolering enligt tillverkarens protokoll. Anmärkning: den logiska grunden för att använda CD4 magnetiska pärlor är att ta bort CD4-CD8- DN celler från kulturen, eftersom dessa har visat sig orsaka direkt dödande avCD4 +CD8+ DP-celler efter stimulering22.</li>
		<li>Räkna levande CD4 anrikade celler med hjälp av en Neubauer hemocytometern och Trypan blå färgämne.  Suspendera i OP9 media vid total koncentration 0,5 x 106 celler/ml. Alikvot 1 ml av cellsuspensionen (0,5 x 106 celler) i varje brunn av en vävnadskultur platt botten 24 väl platta av konfluenta OP9/DLL1.</li>
		<li>Tillsätt 100 IE humant interleukin 2 (hIL-2), 5 ng/mL hIL-7, 500 ng/mL anti-human CD3 antikropp, och 2 μg/mL anti-human CD28 antikropp, sedan kultur vid 37 ° c.</li>
		<li>På dag 4-7 efter stimulering, samla celler för molekylär analys (figur 3) eller co-kultur med peptid-pulsade antigen presenterande celler (APCS).</li>
	</ol></li>
</ol>4. mätning av antigen specificitet för hiPSC härledda CD8αβ+ SP T-celler
Anmärkning: Den typ av APCs som ska användas för denna experiement är beroende av MHC-begränsningen av hiPSC-härledda T-celler. Här används T2-celllinje, som är en hybrid av T och B lymfoblastoid cellinjer. T2-celler uttrycker HLA-A * 02:0123, som känns igen av JKF6 celler som MART1-IPSC härrörde från18. Denna T2-celllinje kan utökas i RPMI 1640 + 20% FBS + 1x penicillin-streptomycin och är blint när cellerna når en densitet av 5 x 105 celler/ml.
<ol><li>Räkna levande HLA-A * 02:01+ T-B hybrid lymfoblastoid T2-celler med hjälp av en Neubauer hemocytometern och trypan blå färgämne. Inkubera APCs i 24 väl vävnadsodling tallrik med 1 μg/mL MART-1 peptid för 2 h vid 37 ° c. Anmärkning: Optimal peptid koncentration varierar beroende på cellinjer och antigen specificitet.</li>
	<li>Samla APCs och tvätta 2x med 10 mL PBS för att avlägsna eventuella extra peptid.</li>
	<li>Räkna APCs och suspendera vid 2 – 5 x 105 celler/ml i OP9 media med 100 IE IL-2 och 5 ng/ml Il-7. Aliquot 100 μL cellsuspension (2-5 x 104 celler) i varje brunn av en ultra-låg infästning U botten 96 väl plattan eller direkt i en pre-coated ELISpot plattan.</li>
	<li>Sortera hiPSC-härledda CD8αβ+ SP T-celler (1 vecka efter anti-humant CD3/CD28 antikropps stimulering) med hjälp av en cell sorterare och suspendera vid 1 x 106 celler/ml i OP9 media med 100 IE IL-2 och 5 ng/ml Il-7. Aliquot 100 μL cellsuspension (1 x 105 celler) i varje brunn av APCS och kultur för 16-20 h vid 37 ° c.</li>
	<li>Efter 16-20 h, analysera cytokin sekretion profil av ELISpot assay per tillverkarens protokoll (figur 4).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brauer, P. M., Singh, J., Xhiku, S., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cell+Genesis:+In+Vitro+Veritas+Est.">T Cell Genesis: In Vitro Veritas Est.</a> Trends in Immunology. 37 (12), 889-901 (2016).</li><li>Rosenberg, S. A., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+cell+transfer+as+personalized+immunotherapy+for+human+cancer.">Adoptive cell transfer as personalized immunotherapy for human cancer.</a> Science. 348 (6230), 62-68 (2015).</li><li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquisition+of+full+effector+function+in+vitro+paradoxically+impairs+the+in+vivo+antitumor+efficacy+of+adoptively+transferred+CD8++T+cells.">Acquisition of full effector function in vitro paradoxically impairs the in vivo antitumor efficacy of adoptively transferred CD8+ T cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (6), 1616-1626 (2005).</li><li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Durable+complete+responses+in+heavily+pretreated+patients+with+metastatic+melanoma+using+T-cell+transfer+immunotherapy.">Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T-cell transfer immunotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).</li><li>Crompton, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+relationship+of+CD8(+)+T+cell+subsets+is+revealed+by+progressive+changes+in+the+epigenetic+landscape.">Lineage relationship of CD8(+) T cell subsets is revealed by progressive changes in the epigenetic landscape.</a> Cellular and Molecular Immunology. 13 (4), 502-513 (2016).</li><li>Henning, A. N., Klebanoff, C. A., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+stemness+in+T+cell+differentiation.">Silencing stemness in T cell differentiation.</a> Science. 359 (6372), 163-164 (2018).</li><li>Henning, A. N., Roychoudhuri, R., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+control+of+CD8(+)+T+cell+differentiation.">Epigenetic control of CD8(+) T cell differentiation.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (5), 340-356 (2018).</li><li>Vodnala, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+stemness+and+dysfunction+in+tumors+are+triggered+by+a+common+mechanism.">T cell stemness and dysfunction in tumors are triggered by a common mechanism.</a> Science. 363 (6434), (2019).</li><li>Restifo, N. P., Gattinoni, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+relationship+of+effector+and+memory+T+cells.">Lineage relationship of effector and memory T cells.</a> Current Opinion in Immunology. 25 (5), 556-563 (2013).</li><li>Tran, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunotherapy+based+on+mutation-specific+CD4++T+cells+in+a+patient+with+epithelial+cancer.">Cancer immunotherapy based on mutation-specific CD4+ T cells in a patient with epithelial cancer.</a> Science. 344 (6184), 641-645 (2014).</li><li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+arrests+effector+T+cell+differentiation+and+generates+CD8++memory+stem+cells.">Wnt signaling arrests effector T cell differentiation and generates CD8+ memory stem cells.</a> Nature Medicine. 15 (7), 808-813 (2009).</li><li>Gautam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+c-Myb+regulates+CD8(+)+T+cell+stemness+and+antitumor+immunity.">The transcription factor c-Myb regulates CD8(+) T cell stemness and antitumor immunity.</a> Nature Immunology. 20 (3), 337-349 (2019).</li><li>Klebanoff, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+successful+CD8++T-cell+adoptive+immunotherapy+for+large+established+tumors+in+mice.">Determinants of successful CD8+ T-cell adoptive immunotherapy for large established tumors in mice.</a> Clinical Cancer Research. 17 (16), 5343-5352 (2011).</li><li>Klebanoff, C. A., Gattinoni, L., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorting+through+subsets:+which+T-cell+populations+mediate+highly+effective+adoptive+immunotherapy.">Sorting through subsets: which T-cell populations mediate highly effective adoptive immunotherapy.</a> Journal of Immunotherapy. 35 (9), 651-660 (2012).</li><li>Crompton, J. G., Clever, D., Vizcardo, R., Rao, M., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+antitumor+immunity.">Reprogramming antitumor immunity.</a> Trends in Immunology. 35 (4), 178-185 (2014).</li><li>Crompton, J. G., Rao, M., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memoirs+of+a+reincarnated+T+cell.">Memoirs of a reincarnated T cell.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 6-8 (2013).</li><li>Kennedy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+lymphocyte+potential+marks+the+emergence+of+definitive+hematopoietic+progenitors+in+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+cultures.">T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures.</a> Cell Reports. 2 (6), 1722-1735 (2012).</li><li>Vizcardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+human+tumor+antigen-specific+T+cells+from+iPSCs+derived+from+mature+CD8(+)+T+cells.">Regeneration of human tumor antigen-specific T cells from iPSCs derived from mature CD8(+) T cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 31-36 (2013).</li><li>Nishimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+rejuvenated+antigen-specific+T+cells+by+reprogramming+to+pluripotency+and+redifferentiation.">Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 114-126 (2013).</li><li>Lo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+recognition+of+a+shared+p53+mutated+neoantigen+in+a+patient+with+metastatic+colorectal+cancer.">Immunologic recognition of a shared p53 mutated neoantigen in a patient with metastatic colorectal cancer.</a> Cancer Immunology Research. , (2019).</li><li>Timmermans, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+T+cells+from+human+embryonic+stem+cell-derived+hematopoietic+zones.">Generation of T cells from human embryonic stem cell-derived hematopoietic zones.</a> Journal of Immunology. 182 (11), 6879-6888 (2009).</li><li>Maeda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+CD8alphabeta+T+Cells+from+T-cell-Derived+iPSC+Imparts+Potent+Tumor+Antigen-Specific+Cytotoxicity.">Regeneration of CD8alphabeta T Cells from T-cell-Derived iPSC Imparts Potent Tumor Antigen-Specific Cytotoxicity.</a> Cancer Research. 76 (23), 6839-6850 (2016).</li><li>Salter, R. D., Howell, D. N., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+regulating+HLA+class+I+antigen+expression+in+T-B+lymphoblast+hybrids.">Genes regulating HLA class I antigen expression in T-B lymphoblast hybrids.</a> Immunogenetics. 21 (3), 235-246 (1985).</li><li>Snauwaert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+mature,+naive+antigen-specific+CD8(+)+T+cells+with+a+single+T-cell+receptor+by+agonist+selection.">In vitro generation of mature, naive antigen-specific CD8(+) T cells with a single T-cell receptor by agonist selection.</a> Leukemia. 28 (4), 830-841 (2014).</li><li>Takahama, Y., Suzuki, H., Katz, K. S., Grusby, M. J., Singer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+selection+of+CD4++T+cells+by+TCR+ligation+without+aggregation+even+in+the+absence+of+MHC.">Positive selection of CD4+ T cells by TCR ligation without aggregation even in the absence of MHC.</a> Nature. 371 (6492), 67-70 (1994).</li><li>Seki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+terminally+differentiated+circulating+T+cells.">Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (1), 11-14 (2010).</li><li>Vodyanik, M. A., Slukvin, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematoendothelial+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells.">Hematoendothelial differentiation of human embryonic stem cells.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2007).</li><li>Vizcardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Tumor+Antigen-Specific+iPSC-Derived+Thymic+Emigrants+Using+a+3D+Thymic+Culture+System.">Generation of Tumor Antigen-Specific iPSC-Derived Thymic Emigrants Using a 3D Thymic Culture System.</a> Cell Reports. 22 (12), 3175-3190 (2018).</li><li>McNicol, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8alpha/alpha+homodimers+fail+to+function+as+co-receptor+for+a+CD8-dependent+TCR.">CD8alpha/alpha homodimers fail to function as co-receptor for a CD8-dependent TCR.</a> European Journal of Immunology. 37 (6), 1634-1641 (2007).</li><li>Themeli, M., Riviere, I., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+cell+sources+for+T+cell+engineering+and+adoptive+immunotherapy.">New cell sources for T cell engineering and adoptive immunotherapy.</a> Cell Stem Cell. 16 (4), 357-366 (2015).</li><li>Minagawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+T+Cell+Receptor+Stability+in+Rejuvenated+iPSC-Derived+T+Cells+Improves+Their+Use+in+Cancer+Immunotherapy.">Enhancing T Cell Receptor Stability in Rejuvenated iPSC-Derived T Cells Improves Their Use in Cancer Immunotherapy.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 850-858 (2018).</li><li>Montel-Hagen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid-Induced+Differentiation+of+Conventional+T+Cells+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Organoid-Induced Differentiation of Conventional T Cells from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 376-389 (2019).</li><li>Takada, K., Kondo, K., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Peptides+That+Promote+Positive+Selection+in+the+Thymus.">Generation of Peptides That Promote Positive Selection in the Thymus.</a> Journal of Immunology. 198 (6), 2215-2222 (2017).</li><li>Takada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR+affinity+for+thymoproteasome-dependent+positively+selecting+peptides+conditions+antigen+responsiveness+in+CD8(+)+T+cells.">TCR affinity for thymoproteasome-dependent positively selecting peptides conditions antigen responsiveness in CD8(+) T cells.</a> Nature Immunology. 16 (10), 1069-1076 (2015).</li><li>Vizcardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Three-dimensional+Thymic+Culture+System+to+Generate+Murine+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-derived+Tumor+Antigen-specific+Thymic+Emigrants.">A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants.</a> JoVE. , e58672 (2019).</li></ol>

Författarna har inga avslöjanden.

Den Co-Culture av OP9 murina stromaceller är ett väletablerat system för in vitro-generering av lymfocyter (dvs, NK, B, och T-celler) från hspcs och pluripotenta stamceller. Notch signalering krävs för att inducera T härstamning engagemang och kan åstadkommas genom ektopisk uttryck av notch ligand DLL1 eller DLL4, som har jämförbar effekt för T-cell generation1. Därför har OP9/DLL1 Co-Culture-systemet blivit en allmänt använd metod för att framställa T-celler in vitro.  Vidare, denna metod är tillämplig för användning med flera typer och källor av mänskliga celler, inklusive navelsträngsblod, benmärg HSPCs och ESCs.  Generering av T-celler från dessa källor begränsas antingen av otillräcklig hämtning av käll celler eller genom ineffektiv differentiering till T-celler1. Dessutom kan en T-cellsprodukt med en enda TCR-återkombination inte genereras från dessa öppna repertoareskällor. Genom att använda regenerativ medicinteknik, nämligen inducerad pluripotenta stamceller (iPSC) teknik, det kan vara möjligt att producera massiva antal antigen-specifika T-celler för användning i cellbaserade Therapeutics15.
hiPSCs liknar pluripotenta ESCs i sin förmåga till självförnyelse, gränslös expansion, och potential att differentiera till någon typ av somatisk cell i kroppen; de saknar dock den etiska oro som omger användningen av produkter av embryonala ursprung för kliniska tillämpningar. Dessutom kan hiPSCs produceras från någon somatisk cell, vilket möjliggör utveckling av cellprodukter för personlig medicin. I tidigare rapporter har hipscs framställts från humana T-celler med hjälp av hela perifera mononukleära celler, CD3+ celler eller isolerade cytotoxiska T-lymfocyter (ctls) som källa18,19,22, 26. När hiPSCs genereras från en t-cellkälla (t-iPSCs) ärvs den ursprungliga TCR-genomordningen. Därför, patient T-iPSC härledda T-celler kan ge en modell för personlig handling behandling genom att rikta en patients distinkta cancer antigener.
Differentieringen av humana pluripotenta stamceller till T härstamning celler är uppdelad i två steg: generering av hematopoietiska progenitorceller (HPCs)27 och deras ytterligare differentiering till t härstamning celler21. Båda stegen kan åstadkommas med hjälp av OP9/DLL1 Co-Culture system. Viktigt är att kvaliteten på OP9/DLL1 Feeder celler är avgörande för framgången för T-celldifferentiering. Eftersom OP9/DLL1 celler inte är en förevigat homogen cellinjer, kvaliteten på FBS och odlingsförhållanden är avgörande för att bibehålla sin expansion utan att förlora förmågan att stödja hiPSC differentiering. Därför, det rekommenderas att pre-utvärdera mycket FBS och passage konsekvent när cell-till-cell cytoplasmiska kontakt börjar inträffa, för att förhindra celldifferentiering och senescence. En punkt att ta hänsyn till är att cell-till-cell-kontakt kan visas omöjlig att skilja från bakgrunden beroende på faskontrast och förstoring av mikroskopet. Enligt vår erfarenhet, de flesta OP9/DLL1 rätter kommer att verka vara 80% konfluenta när redo att passage.
Det har visats att den redifferentiated T härstamning celler som genereras från T-iPSCs av OP9/DLL1 Co-Culture kan producera CD8+ SP t celler vid stimulering18,19. Emellertid, regenererad CD8+ SP T celler förvärva medfödda-liknande CD8αα homodimer22,28, vilket är en ineffektiv Co-receptor för TCR signalering29.  Dessutom, dessa regenererad CD8+ SP T celler har visat stark TCR-oberoende cytotoxicitet, vilket gör dessa celler ogynnsamma för klinisk användning30. Detta protokoll beskriver en ny metod som inbegriper stimulering av renade CD4+CD8+ DP celler att generera CD8αβ+ SP T celler med en mer konventionell fenotyp och förbättrad antigen-specifik cytotoxicitet22. Även om förlusten av antigen specificitet på grund av sekundär tcrα alleliska rearrangering sker i DP skede efter långvarig långsiktig kultur, detta kan övervinnas genom genomredigering i T-iPSCs31.  Enligt vår erfarenhet, hiPSC-härledda DP celler börjar dyka upp på dag 30-35 av kulturen, och dessa nyligen genererade DP celler har ännu inte genomgått sekundär TCRα omordning. Därför behåller de flesta DP-celler på dag 35 antigen specificitet och kan användas för att generera antigen-specifika CD8αβ+ SP T-celler.
Före Human anti-CD3 och anti-CD28 stimulering på dag 35, CD4-CD8- DN celler måste avlägsnas från kulturen, eftersom dessa har visat sig orsaka direkt dödande av CD4+CD8+ DP celler efter stimulering22. Använda CD4 magnetisk pärla anrikning (steg 3,10) kommer att berika för både DP och CD4+CD8- mellanliggande enda positiva (ISP) celler1, som vi har visat sig ha några negativa effekter22. Alternativt kan fluorescens-aktiverad cell sortering med flödescytometri utföras för att isolera DP-celler. Emellertid, magnetisk pärla separation är att föredra eftersom det undviker den mekaniska stressen induceras av flödescytometri.
Generering av CD8αβ+ SP T-celler från humana pluripotenta stamceller utan aktivering-medierad agonist val har därefter visats genom användning av 3D murina stromacellstumörer cellkultur32. Emellertid, fysiologiska positiva urvalet är beroende av samspelet mellan TCR med själv peptid-MHC komplex, som är unikt bearbetas och presenteras av thymic kortikala epitelceller33. Dessutom har TCR-tillhörighet för urvals peptider visats fastställa de efterföljande funktionella kapaciteterna hos mogna CD8αβ+ SP T-celler34.  För närvarande finns det inga belägg som tyder på att en notch stromacellstumörer cell-baserade Co-Culture system kan ge den definierade urvalet peptid och MHC komplex som krävs för fysiologiska positiva val.
Det har tidigare rapporterats i en murin modell som T härstamning celler som genereras från tumörantigen-specifika T cell-härledda hiPSCs med OP9/DLL1 ensam misslyckas med att uppleva konventionell mognad. IPSC-härledda omogna t-celler som genereras av OP9/DLL1-systemet kan dock mogna till naiva-liknande t-celler genom ytterligare fysiologisk thymic-utbildning i ett 3D-kultursystem 28,35. Därför är det protokoll som presenteras här för att producera iPSC-härledda omogna T-celler som genereras av OP9/DLL1 systemet avgörande för ytterligare försök att generera verkliga humana tumörantigen-specifika post-thymic T-celler som kan långtidsbeständighet in vivo med effektivitet för att behandla etablerade vaskulariserad tumörer.

Förutom fysiologiska fördelar, T-celler har många potentiella terapeutiska tillämpningar. Generering och utbyggnad av T-celler in vitro kan användas för sjukdomsmodellering och terapeutisk validering samt en källa till behandling för ärftliga och förvärvade immunbrist stater (dvs., viral immunobristfälligheter och lymfoavskrivning sekundärt till kemoterapi eller transplantation) och för utrotning av cancer. Denna sistnämnda kvalitet har lett till utvecklingen av adoptiv T cell Transfer (ACT) för behandling av patienter med avancerad cancer1.
ACT består av resekera en patients tumör, utvinna tumörinfiltrerande lymfocyter (TILs), expanderande TILs ex vivo, sedan reinfusing de expanderade cellerna till patienten2. Det har visat sig vara en effektiv behandling modalitet för vissa patienter med metastaserande cancer.  Tyvärr, inte alla patienter svarar på denna behandling. Tidigare rapporter har visat att differentieringen tillstånd av överförda celler3,4,5,6,7,8,9, användning av stora tal av höganrikade cancer antigen-specifika t-celler10, och persistens av t-celler efter överföring11,12 är alla korrelerade med mer hållbara svar13,14. Därför, när ACT underlåter att framkalla en anti-tumörsvar, det kan delvis bero på en låg avkastning av cancer antigen-specifika T-celler, ineffektiv ex vivo expansion leder till konsumtion och förlust av reaktiva kloner, eller brist på uthållighet efter överföring4 . Det har postulerat att dessa hinder kan övervinnas genom generering av ett stort antal mindre differentierade cancer antigen-specifika T-celler in vitro-15,16.
Hematopoietiska Stem/progenitorceller (HSPCs) är en konventionell källa för in vitro-T-cellsgenerering, även om denna metod begränsas av det lilla antal celler som kan återvinnas från en enda givare1. Embryonala stamceller (ESCs) har också visat sig producera T-celler men med låg avkastning17, vilket gör det ineffektiva för kliniska tillämpningar. Eftersom T härstamnings celler upplever stokastisk genetisk rekombination av deras T-cellreceptorer (TCR) i tidiga utvecklingsstadier, är det inte möjligt att använda HSPCs eller ESCs för att generera en ren population av antigen-specifika T-celler utan ytterligare genomisk modifieringar som TCR-gentransduktion.
Ett sätt att övervinna dessa förbehåll är att programmera TILs till humana inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs), som kan ge en gränslös källa för in vitro-T-cellsgenerering. Det har visats att cancer antigen-specifika TILs kan omprogrammeras till hipscs och åter differentieras till T-cell härstamning, som behåller samma t cell receptor (TCR) gen omordning som den ursprungliga t-cellen18,19.  Denna detalj är viktig för Act eftersom enskilda patient tumörer har unika Mutations profiler, och mycket få cancer antigener har visat sig delas mellan patienter20. Därför, med hjälp av cancer antigen-specifika TILs som en källa för in vitro-generering av hiPSC-härledda T-celler kan ge en ny strategi för personlig behandling av patienter med metastaserande cancer.
Presenteras här i detalj är ett protokoll för att differentiera hiPSC-derived T Lineage celler till funktionella antigen-specifika CD8αβ+ enda positiva (SP) T celler med OP9/DLL1 Co-Culture system. Denna metod är ett kraftfullt verktyg för in vitro-T celldifferentiering av hiPSCs, hematopoietiska progenitorer, och embryonala stamceller, samt deras ytterligare tillämpningar i regenerativ medicin och cellbaserade terapier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >10 cm dish</td>
			<td >Corning, Inc.&#160;</td>
			<td >353003</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD3, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 561812, RRID:AB_1089628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD34, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >Cat# 348791, RRID:AB_400381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD4, human</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td>Cat# 344612, RRID:AB_2028479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD43, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >Cat# 560198, RRID:AB_1645460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD7, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 555361, RRID:AB_395764</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD8a, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 555369, RRID:AB_398595</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD8b, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >Cat# 641057, RRID:AB_1645747</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-TCRb, human</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >Cat# 555548, RRID:AB_395932</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD28 human monoclonal antibody (15E8), pure functional grade</td>
			<td >Miltenyl Biotec</td>
			<td>130-093-375</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD3 human monoclonal antibody (OKT3), pure functional grade</td>
			<td >Miltenyl Biotec</td>
			<td>130-093-387</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD4 Microbeads, human</td>
			<td >Miltenyl Biotec</td>
			<td >130-045-101</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell strainer 100 um</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >22-363-549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td >Gemini</td>
			<td >100-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Flt-3 ligand</td>
			<td >R&#38;D Systems</td>
			<td >427-FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gelatin Solution 2%&#160;</td>
			<td>SIGMA-Aldritch</td>
			<td>G1393-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GlutaMAX (100X)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >35050-061</td>
			<td >L-Glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HBSS Mg+Ca+ Phenol-Red Free</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Interleukin-2</td>
			<td >R&#38;D Systems</td>
			<td >202-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Interleukin-7</td>
			<td >R&#38;D Systems</td>
			<td >407-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >iTAG MHC Tetramer HLA-A*0201 Mart1 Tetramer -ELAGIGILTV</td>
			<td >MBL</td>
			<td >Cat#TB-0009-2</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mart1-hiPSC</td>
			<td >Vizcardo et al., Cell Stem Cell 2013</td>
			<td >RIKEN-IMS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Melan-A, MART 1 (26-35)</td>
			<td >InnoPep</td>
			<td >3146-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#945;MEM powder</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >61100061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C57BL/6 MEF MITC-TREATED 4M EACH; A34962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >OP9/N-DLL1</td>
			<td >Riken Bioresource center</td>
			<td >Cat# RCB2927; RRID:CVCL_B220</td>
			<td >OP9/DLL1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/streptomycin</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate buffered saline pH 7.4 (1x)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primate ES Cell Medium</td>
			<td >Reprocell</td>
			<td >RCHEMD001</td>
			<td >Human ESC Culture Media</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rhok inhibitor (Y-27632 dihydrochloride)</td>
			<td >Tocris</td>
			<td >1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RPMI 1640</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td >R&#38;D Systems</td>
			<td >455-MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >StemPro</td>
			<td >EZPassage</td>
			<td >23181-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T2-tumor</td>
			<td >ATCC</td>
			<td>T2 (174 x CEM.T2) (ATCC&#174; CRL-1992&#8482;)&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red&#160;</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red&#160;</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >U Bottom 96 well plate</td>
			<td >Corning, Inc.&#160;</td>
			<td >3799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using human induced pluripotent stem cells for the generation of tumor antigen-specific t cells

Generering och expansion av funktionella T-celler in vitro kan leda till ett brett spektrum av kliniska tillämpningar. En sådan användning är för behandling av patienter med avancerad cancer. Adoptiv T cell överföring (ACT) av höganrikade tumörantigen-specifika T-celler har visat sig orsaka varaktig regression av metastaserande cancer hos vissa patienter. Emellertid, under expansion, dessa celler kan bli uttömda eller senescent, begränsa deras effektor funktion och persistens in vivo. Inducerad pluripotenta stamceller (iPSC) teknik kan övervinna dessa hinder genom att leda till in vitro-generering av ett stort antal mindre differentierade tumörantigen-specifika T-celler. Human iPSC (hiPSC) har förmågan att differentiera till någon typ av somatisk cell, inklusive lymfocyter, som behåller den ursprungliga T cell receptor (TCR) genomisk rearrangering när en T-cell används som en startcell. Därför omprogrammering av humana tumörantigen-specifika T-celler till hiPSC följt av redifferentiation till T-cell härstamning har potential att producera föryngring tumörantigen-specifika T-celler. Beskrivs här är en metod för att generera tumörantigen-specifika CD8αβ+ enda positiva (SP) T-celler från hipsc med OP9/DLL1 Co-Culture system. Denna metod är ett kraftfullt verktyg för in vitro-generering av T-cellslinje och kommer att underlätta utvecklingen av in vitro-härledda T-celler för användning i regenerativ medicin och cellbaserade terapier.

Efter 13 dagars hiPSCs Co-culturing med OP9/DLL1, CD34+CD43+ hematopoietiska progenitorceller dök upp (figur 1). Efter ytterligare 22 dagar av kultur på icke-gelatinized OP9/DLL1 i närvaro av hSCF, hFLT3L, och hIL-7, hematopoietiska stamceller differentierade till CD3+CD7+CD4+CD8+ dubbel-positiva (DP) T Lineage celler, TCR som är specifik för MART-1-epitopen (tetramer) (figur 2).
Det har tidigare visats att CD8+ SP T celler kan induceras från CD4+CD8+ DP t celler av TCR signalering via agonist peptid eller antikropp-driven TCR stimulering24,25. Därför, på dag 35 av kultur, hiPSC-derived CD4+CD8+ DP T celler stimulerades med anti-human CD3 och anti-human CD28 antikroppar i närvaro av hIL-7 och hil-2.  Fyra dagar efter stimulering ökade antalet CD3+CD8αβ+ SP-celler dramatiskt och förblev specifika för Mart-1 epitop, vilket bekräftar bevarandet av deras ärftliga antigen-specificitet (figur 3).
För att bestämma de funktionella egenskaperna hos hiPSC-härledda CD8αβ+ SP T-celler analyserades antigen-beroende aktivering och utsöndring av interferon gamma (IFN-γ). Efter stimulering med anti-human CD3 och anti-human CD28 antikroppar för 1 vecka, var hipsc-derived CD8αβ+ SP T celler isolerade med hjälp av en cell sorterare och co-odlade med T2 cell linje uttrycker HLA-a * 02:01 med eller utan besläktat MART1 peptid för 16-20 h. Den ELISpot analysen visade att hiPSC-härledda CD8αβ+ SP t celler utsöndrar högre mängder av IFN-γ jämfört med CD8αα+ SP t celler, när odlade i närvaro av Mart-1 peptid. IFN-γ uttryck var null för T-celler och APCs ensamt, visar att humana T-iPSC-härledda T-celler är antigen-specifika och funktionella (figur 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59997/59997fig1.jpg"> Figur 1: generering av hipsc-härledda hematopoietiska progenitorceller. (A) Schematisk översikt över differentieringen av hipscs till hematopoietisk härstamning med hjälp av OP9/DLL1 Co-Culture. (B) utseende av hipsc-härledda strukturer på dagar 1 (överst till vänster), 3 (överst till höger), 7 (nederst till vänster) och 13 (längst ner till höger). Skalstreck = 100 μm.Cflödescytometrisk analys av hipsc som härrör CD34+CD43+ hematopoietiska progenitorceller på dag 13. Data är representativa för sex oberoende experiment (n = 1 till 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59997/59997fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59997/59997fig2.jpg"> Figur 2: hiPSC differentiering till Mart1+ CD4+CD8αβ+ DP T-celler. (A) Schematisk översikt över differentieringen av hipsc-derived hematopoietiska härstamning till omogna T celler med OP9/DLL1 Co-Culture. (B) flödescytometrisk analys av CD4 vs. CD8Α, CD3 vs. CD8β, och Mart-1 tetramer uttryck i hipsc-härledda T-celler på dag 35. På lymfocyter, enstaka celler, PI-negativa. Uppgifterna är representativa för tre oberoende experiment (n = 3-8). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59997/59997fig2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59997/59997fig3.jpg"> Figur 3: induktion av CD8αβ+ SP T cells fenotyp. Flödescytometrisk analys av CD4- hipsc-härledda T-celler 4 dagar efter Human anti-CD3 och Human anti-CD28 antikroppsstyrd stimulering. Lymfocyter, enstaka celler, PI-negativa (n = 4).   <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59997/59997fig3large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59997/59997fig4.jpg"> Figur 4: antigen specificitet för hipsc-härledda CD8αβ+ SP T-celler. IFN-γ sekretion av ELISpot assay av hiPSC-derived CD8αβ+ SP, CD8αα+ SP, och bulk T-celler efter 20 h Co-kultur med eller utan T2-celler pulsade (eller inte) med Mart-1 peptid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59997/59997fig4large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells at JoVE.com

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Denna artikel beskriver en metod för att generera funktionella tumörantigen-specifika inducerad pluripotenta stamceller härledda CD8αβ+ enda positiva T-celler med OP9/DLL1 Co-Culture system.

Använda humana inducerade pluripotenta stamceller för generering av tumör antigen-specifika T-celler

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Vi presenterar en metod för att generera mänskliga inducerad pluripotent stamceller-härledda tumör antigen-specifika CD8 alpha beta enda-positiva T-celler med hjälp av OP9-Delta-1 samkultur system. Denna metod är ett kraftfullt verktyg för in vitro T-cellgenerering och kommer att underlätta utvecklingen av in vitro-härledda T-celler för användning i regenerativ medicin och cellbaserade terapier. Det kan också anpassas för generering av andra lymfocyter, som NK-celler.När du utför denna teknik, är det viktigt att i förväg utvärdera mycket FBS och passage OP9-Delta-1 celler konsekvent när cell-till-cell cytoplasmatisk kontakt börjar förhindra celldifferentiering och senescence. Att demonstrera ingreppet blir Dr.Meghan Good, en kirurgisk onkologikollega från mitt team. Börja med att kontrollera mänskliga iPSC kolonier i ett stereomikroskop, och ta bort eventuella områden av differentiering från kulturen med plastkanten av en 200-mikroliter pipett spets.När kolonierna når 0,8 till 1,2 millimeter i diameter, passage den mänskliga iPSCs. Aspirera de förbrukade medierna, och tillsätt 10 milliliter av mänskliga iPSC media kompletteras med 10-mikromolär ROCK-hämmare. Rulla en disponibel cell passaging verktyg över hela skålen i en riktning, se till att upprätthålla enhetligt tryck och att hela rullbladet berör kultur skålen.Rotera kultur skålen 90 grader, och upprepa rullande. Visuellt bekräfta korrekt skärning av kolonierna med mikroskop. De borde visas rutiga.Därefter, lösgör de skurna kolonierna genom skonsam mekanisk spolning med en 200-mikroliterpipett. Visuellt uppskatta antalet koloni klumpar, och överföra mellan 350 och 600 klumpar till en ny 10-centimeter skålen av mus embryonala fibroblaster med 10 milliliter av färska mänskliga iPSC media kompletteras med ROCK-hämmare. Inkubera skålen över natten vid 37 grader Celsius.Nästa dag aspirera de förbrukade medierna, och tillsätt 10 milliliter färska mänskliga iPSC media. Byt media var en eller varannan dag, beroende på celltillväxthastigheten. Odla OP9-Delta-1-cellerna i OP9-media vid 37 grader Celsius.När de når konfluency, aspirera media, och tvätta cellerna en gång med fem milliliter av 1x magnesium, kalcium och fenol röd-fri PBS. Aspirera PBS, tillsätt två milliliter på 05%trypsin-EDTA, och inkubera cellerna i fem minuter vid 37 grader Celsius. Tillsätt sedan fyra milliliter OP9-media, och ta ur mekaniskt avstånd från cellskiktet genom pipettering.Överför cellupphängningen till ett koniskt rör på 50 milliliter genom en 100-mikrometercellsil och centrifug vid 300 gånger g vid fyra grader Celsius i fem minuter. Aspirera supernatanten och återanvänd cellerna i 12 milliliter OP9-medier. Lägg till åtta milliliter OP9-medier till var och en av sex nya cellodlingsrätter och tallrik två milliliter av OP9-delta-1-cellupphängningen på varje rätt.Rock skålen sida till sida och framifrån och bakåt för att säkerställa jämn fördelning av cellerna. Inkubera cellerna i 37 grader Celsius, och upprepa passage när cellerna når konfluency. Förbered gelatiniserade OP9-Delta-1 rätter en vecka före samkultur med mänskliga iPSCs.Tillsätt fyra milliliter på 0,1%gelatin till tre nya cellkulturrätter och ruva in dem i 30 minuter vid 37 grader Celsius. Efter inkubationen, aspirera gelatinet, och tillsätt åtta milliliter OP9 media till varje maträtt. Passage en konfluent maträtt av OP9-Delta-1 celler till tre gelatin-belagda rätter.Efter fyra dagar, tillsätt 10 milliliter OP9 media till varje maträtt av celler, för totalt 20 milliliter media per maträtt. Börja mänskliga iPSC samkultur på OP9-Delta-1 konfluenta rätter sju till åtta dagar efter passaging cellerna. Aspirera media från en konfluent maträtt av mänskliga iPSCs, och tillsätt 10 milliliter OP9 media.Skär och lossa cell kolonier med hjälp av en disponibel cell passaging verktyg, och överföra 350 till 600 klumpar av skurna kolonier på en pre-gelatinized OP9-Delta-1 maträtt med 10 milliliter av färska OP9 media. Rocka kultur skålen sida till sida och framifrån och bakåt för att säkerställa jämn fördelning av kolonier. Nästa dag aspirerar de förbrukade medierna och ersätter det med 20 milliliter färska OP9-medier.Den mänskliga iPSC klumpar co-odlade på OP9-Delta-1 för en dag bör visas som små, runda, monolayer kolonier. På dag fem, aspirera 10 milliliter av förbrukade medier, och lägga till 10 milliliter färska OP9 media. Kolonierna kommer att börja differentiera till primitivt mesoderm, som kännetecknas av ett flerskiktat mörkt centrum.Upprepa denna process på dag nio, då flerskiktscenterstrukturerna kommer att utvecklas till kupolliknande former. Skörda de hematopoietiska progenitorcellerna på dag 13, vid vilken tidpunkt strukturerna består av en mörk central organoid omgiven av ett nätverk av kupolliknande områden. Aspirera media, och tvätta cellerna en gång med fem milliliter av 1x fenol röd-fri Hanks balanserade saltlösning med kalcium och magnesium, eller HBSS.Efter tvätten, tillsätt 250 mikroliter av 5, 000-enheter per milliliter kollagenas IV till 10 milliliter HBSS. Tillsätt blandningen till cellerna, och inkubera dem i 37 grader Celsius i 45 minuter. Aspirera HBSS-kollagenas blandningen, och tvätta cellerna en gång med fem milliliter PBS.Efter tvättning med PBS, tillsätt fem milliliter på 0,25%trypsin-EDTA, och inkubera cellerna på 37 grader Celsius i 20 minuter. Lägg sedan till fyra milliliter OP9-media, och separera cellskiktet genom pipettering för att göra en encellig suspension. Överför cellupphängningen till ett koniskt rör på 50 milliliter genom en 100-mikrometersil, och centrifugera röret vid 300 gånger g och fyra grader Celsius i fem minuter.Aspirera supernatanten och återanvänd cellerna i 10 milliliter AV OP9-medier. Platta cellen suspensionen på en ny gelatiniserad 10-centimeter cell kultur skålen, och inkubera dem i 37 grader Celsius i 45 minuter. Samla sedan in eventuella icke-vidhäftande celler genom mild pipettering.Överför cellupphängningen till ett koniskt rör på 50 milliliter genom en sil, och centrifug som tidigare beskrivits. Sedan aspirera supernatanten och resuspend cellerna i 10 milliliter differentieringsmedia. Platta cellupphängningen på en ny OP9-Delta-1 konfluentfat.Passage cellerna på dag 16 enligt manuskriptet riktningar, och fortsätta passaging de icke-anhängare celler var femte till sju dagar därefter. Efter 35 dagars differentiering, berika CD4-positiva cellpopulationen genom CD4 magnetiska pärla isolering enligt tillverkarens protokoll. Sedan, resuspend cellerna i OP9 media, och platta en milliliter cell suspension i varje brunn av en vävnad-kultur, platt-botten, 24-brunn platta av konfluent OP9-Delta-1.Stimulera celler genom att lägga till 100 internationella enheter av mänskliga IL-2, fem nanogram av mänskliga IL-7, 500 nanogram anti-human CD3 antikropp, och två mikrogram anti-mänskliga CD28 antikropp till varje brunn. Efter fyra till sju dagar kan celler samlas in för vidare analys. Efter kultur på icke-gelatinized OP9-Delta-1 i närvaro av mänskliga stamceller faktor, mänskliga FLT3-ligand, och mänskliga interleukin-7, hematopoietic progenitors differentierade till CD3, CD7, CD4 och CD8 dubbel-positiva T härstamning celler, varav majoriteten uttryckt T cell receptorer specifika för MART1 epitop.När CD4, CD8 dubbel-positiva T-celler stimulerades med anti-mänskliga CD3 och CD28 antikroppar i närvaro av mänskliga interleukin-7 och 2, antalet CD3-positiva CD8 alpha beta enkelpositiva celler ökade och förblev specifik för den MART1 epitope, bekräftar bevarandet av deras ärvda antigen specificitet. En ELISpot analys visade att när odlade i närvaro av MART1 peptid, mänskliga iPSC-härledda CD8 alpha beta enkelpositiva T-celler utsöndrar högre mängder av interferon gamma jämfört med både bulk och CD8 alfa alfa single-positive T-celler. Ingen interferon gamma uttryck upptäcktes för T-celler och antigen-presentera celler ensam, visar att mänskliga T-iPSC-härledda T-celler är antigen-specifika och funktionella.Ett viktigt steg i denna metod är CD4 magnetisk pärla anrikning för att eliminera CD4-negativa, CD8-negativa dubbelnegativa celler, som kan orsaka direkt dödande av dubbel-positiva celler vid stimulering. Denna teknik är tillämplig för användning med flera källor av mänskliga celler, inklusive hematopoietiska stamceller och embryonala stamceller. iPSC-härledda omogna T-celler som genereras av denna metod skulle kunna förbättras ytterligare för generering av mogna mänskliga tumör antigen-specifika naiva-liknande T-celler för framtida terapeutisk användning.Efter att ha sett den här videon, bör betraktaren förstå hur man genererar mänskliga iPSC-härledda CD8 alfa beta enkel-positiva T-celler med hjälp av OP9-Delta-1 samkultur systemet.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Modeling osteosarkom med Li-Fraumeni syndrom patientderiverade inducerade pluripotenta stamceller

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

Ett tredimensionellt thymic kultur system för att generera murin inducerad pluripotenta stamcells härledda tumör antigen-specifika thymic emigranter

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Realtid upptäcka i Vitro tumör Cell apoptos induceras av CD8+ T celler att studera suppressiv immunförsvaret av tumör-infiltrera myeloida celler

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Tillverkning chimeric antigen receptor (bil) T celler för adoptiv immunterapi

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment

Isolering och expansion av cytotoxiska Cytokin-inducerad Killer T-celler för cancerbehandling

Adoptive cellular immunotherapy focuses on restoring cancer recognition via the immune system and improves effective tumor cell killing. Cytokine-induced ...

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Analysera tumör och vävnad distribution av Target Antigen specifik terapeutisk antikropp

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Patologisk analys av lungmetastasering efter lateral svansveninjektion av tumörceller

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis

Generation av zebrafisk larv Xenografts och tumör beteende analys

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly ...

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Tumörtransplantation för att bedöma dynamiken hos tumörinfiltrerande CD8 + T-celler hos möss

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicitet Screening av tumör-härledda extracellulära vesicles av flöde cytometri av splenic T-celler

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...