Name: inducing acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation
Uploaded: 2019-07-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation at JoVE.com

ويود المؤلفان أن يشكرا جان كلينر وسوزان شولتز على تقديم الدعم التقني. ويقر المؤلفون بالدعم الممتاز الذي يقدمه المرفق الأساسي للقياس الدفقي في كلية الطب بجامعة بون. ولم يتلق المؤلفون أي تمويل من أي منظمة خارجية.  وقد سبق أن عرض جزء من البيانات الواردة في قسم النتائج والمبينة في الشكل 3 في منشور سابقرقم 8.

وقد وافقت اللجنة المحلية لرعاية الحيوانات على هذا البروتوكول (LANUV، ريكلينغهاوزن، ألمانيا؛ البروتوكول رقم 84-02.04.2015) وتم تنفيذه وفقاً للمبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة لاستخدام الحيوانات الحية (نشرالمعاهد الوطنية للصحة) )١٠( رقم ٨٥-٢٣، المنقح ١٩٩٦.
1. علي التعريفي
<ol><li>?...

<ol>
	<li>Fink, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+sepsis.">Animal models of sepsis.</a> Virulence. 5 (1), 143-153 (2014).</li><li>Lu, Y. -. C., Yeh, W. -. C., Ohashi, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS/TLR4+signal+transduction+pathway.">LPS/TLR4 signal transduction pathway.</a> Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).</li><li>Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+acute+lung+injury.">Animal models of acute lung injury.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (3), 379-399 (2008).</li><li>Rabelo, M. A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Lung+Injury+in+Response+to+Intratracheal+Instillation+of+Lipopolysaccharide+in+an+Animal+Model+of+Emphysema+Induced+by+Elastase.">Acute Lung Injury in Response to Intratracheal Instillation of Lipopolysaccharide in an Animal Model of Emphysema Induced by Elastase.</a> Inflammation. 41 (1), 174-182 (2018).</li><li>Liu, F., Li, W., Pauluhn, J., Tr&#252;bel, H., Wang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-induced+acute+lung+injury+in+rats:+comparative+assessment+of+intratracheal+instillation+and+aerosol+inhalation.">Lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats: comparative assessment of intratracheal instillation and aerosol inhalation.</a> Toxicology. 304, 158-166 (2013).</li><li>Rittirsch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Lung+Injury+Induced+by+Lipopolysaccharide+Is+Independent+of+Complement+Activation.">Acute Lung Injury Induced by Lipopolysaccharide Is Independent of Complement Activation.</a> Journal of Immunology. 180 (11), 7664-7672 (2008).</li><li>D'Alessio, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+CD25+Foxp3++Tregs+resolve+experimental+lung+injury+in+mice+and+are+present+in+humans+with+acute+lung+injury.">CD4+CD25+Foxp3+ Tregs resolve experimental lung injury in mice and are present in humans with acute lung injury.</a> The Journal of Clinical Investigation. 119 (10), 2898-2913 (2009).</li><li>Ehrentraut, H., Weisheit, C., Scheck, M., Frede, S., Hilbert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+murine+acute+lung+injury+induces+increase+of+pulmonary+TIE2-expressing+macrophages.">Experimental murine acute lung injury induces increase of pulmonary TIE2-expressing macrophages.</a> Journal of Inflammation. 15, 12 (2018).</li><li>Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+pulmonary+damage+induced+by+lipopolysaccharide+via+intranasal+instillation.">A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation.</a> Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).</li><li>Reutershan, J., Basit, A., Galkina, E. V., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+recruitment+of+neutrophils+into+lung+and+bronchoalveolar+lavage+fluid+in+LPS-induced+acute+lung+injury.">Sequential recruitment of neutrophils into lung and bronchoalveolar lavage fluid in LPS-induced acute lung injury.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 289 (5), 807-815 (2005).</li><li>Hoegl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+multifactorial+nature+of+ARDS+-+approach+to+model+murine+acute+lung+injury.">Capturing the multifactorial nature of ARDS - approach to model murine acute lung injury.</a> Physiological Reports. 6 (6), (2018).</li><li>Weisheit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ly6Clow+and+Not+Ly6Chigh+Macrophages+Accumulate+First+in+the+Heart+in+a+Model+of+Murine+Pressure-Overload.">Ly6Clow and Not Ly6Chigh Macrophages Accumulate First in the Heart in a Model of Murine Pressure-Overload.</a> PLoS ONE. 9 (11), (2014).</li><li>Grommes, J., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+Neutrophils+to+Acute+Lung+Injury.">Contribution of Neutrophils to Acute Lung Injury.</a> Molecular Medicine. 17 (3-4), 293-307 (2011).</li><li>M&#252;ller-Redetzky, H. C., Suttorp, N., Witzenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+pulmonary+endothelial+barrier+function+in+acute+inflammation:+mechanisms+and+therapeutic+perspectives.">Dynamics of pulmonary endothelial barrier function in acute inflammation: mechanisms and therapeutic perspectives.</a> Cell and Tissue Research. 355 (3), 657-673 (2014).</li><li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+apoptosis+in+lipopolysaccharide-induced+lung+injury+in+mice.">Endothelial cell apoptosis in lipopolysaccharide-induced lung injury in mice.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 117 (3), 202-208 (1998).</li><li>Doyen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+induced+by+inhaled+lipopolysaccharide+depends+on+particle+size+in+healthy+volunteers.">Inflammation induced by inhaled lipopolysaccharide depends on particle size in healthy volunteers.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 82 (5), 1371-1381 (2016).</li><li>Stephens, R. S., Johnston, L., Servinsky, L., Kim, B. S., Damarla, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tyrosine+kinase+inhibitor+imatinib+prevents+lung+injury+and+death+after+intravenous+LPS+in+mice.">The tyrosine kinase inhibitor imatinib prevents lung injury and death after intravenous LPS in mice.</a> Physiological Reports. 3 (11), (2015).</li><li>Yu, Y., Jing, L., Zhang, X., Gao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simvastatin+Attenuates+Acute+Lung+Injury+via+Regulating+CDC42-PAK4+and+Endothelial+Microparticles.">Simvastatin Attenuates Acute Lung Injury via Regulating CDC42-PAK4 and Endothelial Microparticles.</a> Shock. 47 (3), 378-384 (2017).</li></ol>

الحد الأدنى من التوغل، والتعامل البسيط، وتكرار جيد هي السمات الرئيسية للنهج المقدم للحث على ALI في نموذج القوارض الصغيرة. استخدام LPS بدلا من البكتيريا كلها في النماذج الحيوانية له مزايا. وهو مركب مستقر ونقي ويمكن تخزينها في شكل الليوفيليز حتى الاستخدام. وهو منبه قوي للاستجابات المناعية الف...

النماذج الحيوانية التجريبية لا غنى عنها في البحوث المناعية الأساسية. وقد استخدمت إدارة البكتيريا الكاملة أو المكونات الميكروبية في كثير من الأحيان في النماذج الحيوانية الصغيرة للحث على التهاب محلي أو نظامي1. Lipopolysaccharide (LPS، أو التوكسين البكتيري) هو مكون جدار الخلية ومستضد السطح من البكتيريا السالبة للجرام (على سبيل المثال، البكتيريا المعوية، الزائفة spp.، أو الفيلق spp.). يتكون الجزيء المستقرة بالحرارة والكبيرة (الوزن الجزيئي 1-4 × 106 kDa) من مويتي الدهون (الدهون A)، ومنطقة أساسية (oligosaccharide)، وO السكريات (أو مستضد). الدهون A، مع سلاسل الأحماض الدهنية المسعورة، يرسو الجزيء في غشاء بكتيري وتوسط (على تدهور البكتيريا) النشاط المناعي وسمية LPS. بعد الربط إلى البروتين ملزم LPS (LBP)، LPS: مجمع LBP ligate مجمع مستقبلات CD14/TLR4/MD2 تقع على سطح العديد من أنواع الخلايا، مما يؤدي إلى رد فعل proinflammatory قوي مع NF-κB نقل النووية وupregulation اللاحقة من السيتوكين التعبير2.
يتم تعريف إصابة الرئة الحادة (ALI) بأنها فشل الجهاز التنفسي الحاد مع وذمة رئوية ثنائية في غياب فشل القلب3. إدارة مجرى الهواء من LPS هو وسيلة شائعة للحث على التهاب رئوي وعلي4،5،6،7. على الرغم من أن المادة المعقمة ليست مناسبة لدراسة التدخلات الدوائية في الأمراض المعدية، يمكن الإجابة على الأسئلة المناعية الميكانيكية بدقة كافية. غرس LPS في القصبة الهوائية يحفز على رد فعل التهابي قوي مع غزو الكريات البيض، وupregulation من السيتوكينات proinflammatory، وتعطيل حاجز الحويفين الشعرية في غضون ساعات إلى أيام، اعتمادا على جرعة LPS3، 6,7.
يصف البروتوكول المقدم إجراءً مفصلاً خطوة بخطوة لحث ALI في الفئران عن طريق تبيل LPS داخل الرغامى. تم التحقق من صحة النموذج من خلال تقييم التعبير السيتوكين، غزو المحببة العدلية، وتسرب الألبومين داخل الحُقف كما سبق وصفه8.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1189px;" width="1189">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:653px;">1 ml syringes</td>
			<td style="width:289px;">BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td style="width:104px;">300013</td>
			<td style="width:143px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 ml syringes</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>309110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-CD115 (c-fms) APC</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>17-1152-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-CD11b (M1/70) - FITC</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>11-0112-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-CD45 (30-F11) - eF450</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>48-0451-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-F4/80 (BM-8) - PE Cy7</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>25-4801-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Gr1 (RB6-8C5)</td>
			<td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>552093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>45-5932-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7</td>
			<td>Bio Legend, San Diego, CA</td>
			<td>127623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Buprenorphine hydrochloride</td>
			<td>Indivior UK Limited, Berkshire, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C57BL/6 mice, female, 10 - 12 weeks old</td>
			<td>Charles River, Wilmongton, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td style="width:143px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaliBRITE APC-beads (6&#181;m)</td>
			<td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>340487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:653px;">Canula 23 gauge 1&#39;&#39;</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>300800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:653px;">Canula 26 gauge 1/2&#39;&#39;</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>303800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell strainer 70 &#181;m</td>
			<td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase Type I</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>1148089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deoxyribonuclease II</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>D8764&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS), sterile</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (PBS), without calcium chloride and magnesium chloride, sterile</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS tubes, 5 ml</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>551579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11049-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane</td>
			<td>Baxter, Unterschlei&#223;heim, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O111:B4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>L2630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Green Kit</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>L23101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block&#8482;), Clone 2.4G2</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Red blood cell lysis buffer</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI-1640, with L-glutamine and sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>14060-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium azide (NaN3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue forceps</td>
			<td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11021-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:653px;">Tubes</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>30125150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Venous catheter, 22 gauge</td>
			<td>B.Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>4268091B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine hydrochloride</td>
			<td>Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducing acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation

إدارة مجرى الهواء من السكاريد (LPS) هو وسيلة شائعة لدراسة التهاب رئوي وإصابة الرئة الحادة (ALI) في النماذج الحيوانية الصغيرة. وقد وصفت نُهج مختلفة، مثل استنشاق الهباء الجوي وغرس الأنف أو داخل الرغامى. يصف البروتوكول المقدم إجراءً مفصلاً خطوة بخطوة لحث ALI في الفئران عن طريق تهيئة LPS داخل الرغامى مباشرة وإجراء تحليل FACS لعينات الدم، وسوائل غسل القصبات (BAL)، وأنسجة الرئة. بعد التخدير داخل الحَرَب، يتم تعريض القصبة الهوائية وتدار الـ LPS بواسطة قسطرة وريديّة 22 G. يتم التسبب في رد فعل التهابي قوي وقابل للتكرار مع غزو الكريات البيض ، وupregulation من السيتوكينات proinflammatory ، وتعطيل حاجز الحويفين الشعري في غضون ساعات إلى أيام ، اعتمادا على جرعة LPS المستخدمة. يتم وصف جمع عينات الدم، والسائل BAL، وحصاد الرئة، فضلا عن معالجة لتحليل FACS، بالتفصيل في البروتوكول. على الرغم من أن استخدام LPS المعقمة ليست مناسبة لدراسة التدخلات الدوائية في الأمراض المعدية، فإن النهج الموصوف يقدم الحد الأدنى من التوغل، والتعامل البسيط، والقدرة على استنساخ جيدة للرد على الأسئلة المناعية الميكانيكية. وعلاوة على ذلك، فإن المعايرة بالتحليل الكيميائي للجرعة، فضلا عن استخدام الاستعدادات البديلة لـ LPS أو سلالات الماوس تسمح بتحوير الآثار السريرية، والتي يمكن أن تظهر درجات مختلفة من شدة ALI أو في وقت مبكر مقابل بداية متأخرة من أعراض المرض.

تم التحقق من صحة النهج الموصوف للحث على ALI في الفئران عن طريق تقييم التعبير السيتوكين، وتسلل المحببات العدلية، وتعطيل حاجز الحويفيو الشعري 24 ساعة و 72 ساعة بعد غرس LPS. وكانت الحيوانات التي يتم حقنها من قبل PBS بمثابة عنصر تحكم. وقد تسببت إدارة LPS داخل الرغامى في استجابة قوية للالتهابات الرئوية...

Watch this Scientific Journal Video about Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation at JoVE.com

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

يقدم هنا إجراء خطوة بخطوة للحث على إصابة الرئة الحادة في الفئران عن طريق مباشرة داخل الرغامى السكاريد ولإجراء تحليل FACS عينات الدم، والسائل القصبات الهوائية، وأنسجة الرئة. الحد الأدنى من التوغل، والتعامل البسيط، والقابلية للتكرار الجيد، ومعايرة شدة المرض هي مزايا هذا النهج.

إحداث إصابات الرئة الحادة في الفئران عن طريق التبيل المباشر للكيس الشحمي داخل الرغامى

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

النماذج الحيوانية الموثوقة هي مكونات حاسمة في البحوث الأساسية. يسمح نهجنا في المورين بالإجابة على الأسئلة المناعية حول الميكانيكا والحركات من تطور إصابات الرئة الحادة في الثدييات. الحد الأدنى من الغازية، والتعامل مع بسيطة، فضلا عن إعادة إنتاج جيدة هي المزايا الرئيسية لهذه التقنية.وبالإضافة إلى ذلك، مع المعايرة الجرعة، يمكننا تعديل الأثر السريري. هذه التقنية يعكس الوضع السريري للمرضى الذين يعانون من إصابات شديدة في الرئة ويسمح للتحقيق في الآليات الكامنة. تخزين الدهون والسكاريد، أو LPS، في aliquots بتركيز خمسة ملليغرام لكل ملليلتر في ناقص 20 درجة مئوية.للتقطير داخل منطقة اغراء، تخفيف LPS المذاب في الفوسفات المعقم العازل المالحة إلى تركيز نهائي من 2،000 ميكروغرام لكل ملليلتر. قطع قسطرة الوريدية 22 قياسا إلى طول 20 ملليمتر. ضع الماوس في وضعية عرضة على طاولة يتم التحكم فيها بدرجة حرارة للحفاظ على درجة حرارة الجسم من 37 درجة مئوية.بعد التخدير كما هو موضح في بروتوكول النص، وتطبيق مواد التشحيم معقمة العيون لمنع جفاف القرنيات تحت التخدير. ارفع الرأس وخطاف على شريط أفقي وضعه حوالي خمسة سنتيمترات فوق الطاولة بينما تبقى الفواصل على اتصال وثيق مع الجدول. سوبر تمديد الرقبة في زاوية 90 درجة بالنسبة إلى الجدول.ضع مصدر ضوء بارد على الجلد فوق الحنجرة للمساعدة في تصور الحبال الصوتية وهدف القصبة الهوائية. عقد اللسان مع ملقط لتقويم الحلق لظروف الانتبيب أسهل. التصور السليم وتحديد الحنجرة أمر بالغ الأهمية لضمان وضع الصحيح داخلالقسطار.مصدر الضوء البارد الخارجي يساعد في هذه الخطوة. أدخل القسطرة حوالي 10 ملليمترات في القصبة الهوائية. تأكد من أن الإدراج ليس عميقًا جدًا ، لأن هذا سيؤدي إلى تقطير من جانب واحد للسوائل في القصبات الرئيسية اليمنى أو اليسرى.إذا المقاومة من الحنجرة يحدث، تراجع القسطرة بضعة ملليمترات قبل التقدم مرة أخرى. الآن، حقن MPBS المخففة LPS باستخدام ماصة. يعتمد حجم الحقن على وزن جسم الماوس.توصيل حقنة وإضافة بول من 50 ميكرولترات من الهواء لضمان توزيع حجم السائل الكامل في الرئتين. إزالة ببطء القسطرة. الحفاظ على الجزء العلوي من جسم الفأر في وضع مستقيم لمدة 30 ثانية لتجنب تسرب السائل من القصبة الهوائية.إصلاح الماوس القتل الرحيم مع الشريط على طاولة عملية و قريبا تطهير الفراء على البطن مع 70٪ الإيثانول. افتح تجويف البطن بعناية في خط الوسط مع المقص والملاقط. إزالة أجزاء من الأمعاء لتحقيق الوصول إلى الوريد الكافا الحق السفلي إلى العمود الفقري في الشريان الأورطي البطن.حدد موقع عروق الكلى وأدخل قنية منحنية عيار 23 متصلة بحقنة ملليلتر واحدة في الوريد الكافا السفلي ، مباشرة تحت التقاء الأوردة. pirate 250 ميكرولترات من الدم ونقلها إلى أنبوب 1.5 ملليلتر مليئة 20 ميكرولترات من 0.5 EDTA مولا حل. يهز بلطف لتسهيل EDTA خلط ووضع أنبوب على الجليد.بالنسبة لـ bronchoalveolar lavage ، أعد ثلاث حقن ملليلتر ، كل منها 0.5 ملليلتر من PBS العقيم و 0.1 ملليلتر من الهواء. تطهير فرو الحلق مع الإيثانول 70٪ وفضح بعناية القصبة الهوائية مع مقص وملاقط. تعبئة القصبة الهوائية والتفاف خياطة حولها.ثقب القصبة الهوائية باستخدام مقص صغير وإدراج قسطرة الوريدية 22 قياس، وقطع إلى طول 20 ملليمتر. إصلاح القسطرة مع خياطة ويغرس 0.5 ملليلتر من برنامج تلفزيوني معقمة و0.1 ملليلتر من الهواء. استلهم السائل بعد 60 ثانية.كرر الإجراء مع حقنتين إضافيتين وجمع التعرق كله في أنبوب 15 ملليلتر على الجليد. فتح الصدر بعناية مع مقص وملاقط لحصاد الرئتين. قطع الحجاب الحاجز على طول هامش costal وقطع من خلال الأضلاع مع اثنين من شقوق جانبية.تجنب بعناية ثقب الرئتين. ارفع القص عن بُعدياً وأصلحه أو قم بإزالته. إعداد اثنين من 10 ملليلتر الحقن مع دافئ، 37 درجة مئوية PBS.إجراء شق صغير في البطين الأيسر. ثقب البطين الأيمن مع قنية قياس 26. ثم، تدفق الدورة الدموية الرئوية مع برنامج تلفزيوني مسخ مسبقا.كن على علم بالرئتين الهاي أثناء العملية. إزالة الفص الأيمن من الرئتين وقطع عليه إلى أنصاف. المفاجئ تجميد لهم في النيتروجين السائل تليها تخزين على المدى الطويل في ناقص 80 درجة مئوية لمزيد من التعبير الجيني وتحليل البروتين.إزالة الرئة اليسرى كلها وتجانس في لوحة 48 جيدا عن طريق تحديد الأنسجة مع مقص والملاقط. احتضان الأنسجة في مليلترين من عازلة الهضم في 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. تنفيذ مزيد من التجانس عن طريق الأنابيب بعناية قطع أنسجة الرئة صعودا وهبوطا.نقل عينات الدم إلى خمسة ملليلتر أنابيب FACS وخلط بلطف الدم مع مليلتر من خلايا الدم الحمراء العازلة. وضع الأنابيب على الجليد وإنهاء رد الفعل بعد دقيقتين عن طريق إضافة ملليلتر من الجليد البارد برنامج تلفزيوني. الطرد المركزي العينة لمدة خمس دقائق في 400 مرة ز والتخلص من الفائق.إعادة تعليق بيليه الخلية مع 60 ميكرولترات من العازلة FACS وعملية لبقعة FACS اللاحقة وفقا للبروتوكولات الموصوفة سابقا. سائل بال بال للطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 400 مرة ز. استلهم المابير ويجمّدها في النيتروجين السائل متبوعاً بتخزين طويل الأجل عند ناقص 80 درجة مئوية لمزيد من تحليل البروتين.بعد إعادة تعليق بيليه خلية بال مع مليلترين من المخزن المؤقت البارد FACS ، قم بنقل التعليق إلى أنبوب FACS من خمسة ملليلتر باستخدام فلتر شبكة 100 ميكرون لكبح الشعر. بعد الطرد المركزي للعينة مرة أخرى، resuspend بيليه مع 60 ميكرولترات من العازلة FACS وعملية لبقعة FACS اللاحقة وفقا للبروتوكولات الموصوفة سابقا. الآن، نقل أنسجة الرئة اليسرى المهضمة إلى أنبوب FACS 5 ملليلتر باستخدام مرشح شبكة 100 ميكرون لاستخراج كتل.إنهاء عملية الهضم عن طريق إضافة مليلترين من الجليد الباردة FACS العازلة قبل الطرد المركزي العينة لمدة خمس دقائق في 400 مرة ز. تخلص من المُتطَرَّح والمُنَقّط في البيليه بـ 60 ميكرولترات من العازلة في القوات المسلحة الكونغولية وعملية تلطيخ FACS اللاحقة وفقًا للبروتوكولات الموصوفة سابقًا. لتحليل FACS، إضافة 20 ميكرولترات من CD16/CD32 مانع الأجسام المضادة حل ل60 ميكرولترات من الخلايا في أنبوب 5 ملليلتر.احتضان الخلايا في أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة لمنع الربط غير محدد من الغلوبولين المناعي لمستقبلات Fc. وفي الوقت نفسه، إعداد مزيج رئيسي مع العازلة FACS والأجسام المضادة، كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد حجب، لا يغسل الخلايا.إضافة 20 ميكرولترات من الجسم المضاد مزيج سيد لكل عينة للحصول على حجم النهائي من 100 ميكرولترات. احتضان العينات لمدة 20 دقيقة، في الظلام، في أربع درجات مئوية. اغسل كل عينة بميليلتر واحد من مخزن احتياطي القوات المسلحة الكونغولية والطرد المركزي كما كان من قبل.تخلص من المُنَاطِع و ينقِر البيليه بمخزن FACS إلى تركيز الخلايا المناسبة لقياسات FACS. وأخيراً، أضف أرقاماً ثابتة من خرزات المعايرة المترافقة مع الفلوروكرروم المتاحة تجارياً إلى كل عينة لتحديد أرقام الخلايا المطلقة. تنفيذ عملية استئصال الخلايا التدفق باستخدام استراتيجية الغاتة هو مبين في بروتوكول النص للدم، BAL، وخلايا الأنسجة.24 وكذلك 72 ساعة بعد تقطير داخل منطقة المراقبة ، والتعبير عن TNF ألفا في أنسجة الرئة كان أعلى تنظيما كبيرا ، لتصل إلى زيادة مستمرة وأكثر من 50 أضعاف بالمقارنة مع الحيوانات السيطرة. غزو الكريات البيض في الأنسجة والفضاء السنخي هو السمة المميزة والسمة لتطوير إصابة الرئة الحادة. وكشف تحليل FACS عن تسلل كبير للميقابيب العدلات إلى الخلات الرئوية، مع زيادة عدد الخلايا المطلقة بمقدار تسعة أضعاف تقريبا مقارنة بالضوابط بعد 24 ساعة.انخفض عدد الحبيبات العدلات المطلقة قليلاً بعد 72 ساعة ، ومع ذلك ، ظلت زيادة العامل مقارنة بالضوابط. واتساقا مع تسلل المحببات الميكروبات الخلالي، زاد التعبير MMP-9 في أنسجة الرئة بأكمله زيادة كبيرة أيضا خلال فترة المراقبة الكلية. لم يتم فقط زيادة حبيبات العدلات في أنسجة الرئة، ولكن أيضا في السائل BAL.وكانت الزيادة أضعاف بالمقارنة مع الحيوانات السيطرة أكثر وضوحا مما كانت عليه في أنسجة الرئة. وذمة الرئة بسبب ضعف شديد في الحاجز الحويolocapillary هو pathognomonic لتطوير إصابة الرئة الحادة. تحليل محتوى الألبومات في سائل BAL من قبل ELISA كشف عن فقدان كبير لوظيفة الحاجز في 24 ساعة و 72 ساعة بعد تقطير LPS.وضع القسطرة السليم أمر بالغ الأهمية للتلقين الثنائي لللبس. غالباً ما تشير التغيرات في أنماط التنفس، مثل السعال أو اللهاث، إلى تقطير السائل داخل الجسم. بعد تحريض إصابات الرئة الحادة، يمكن إجراء عدد من الخطوات اللاحقة، مثل تحليل FACS، PCR، كشف البروتين، للإجابة على الأسئلة البحثية ذات الصلة.

Research

JoVE Journal

Medicine

Pressure Controlled Ventilation to Induce Acute Lung Injury in Mice

التهوية الضغط الشواهد للحث على إصابة الرئة الحادة في الفئران

Murine models are extensively used to investigate acute injuries of different organs systems (1-34). Acute lung injury (ALI), which occurs with prolonged ...

Ischemia-reperfusion Model of Acute Kidney Injury and Post Injury Fibrosis in Mice

نقص التروية-ضخه نموذج من إصابة الكلى الحاد والتليف آخر الاصابات في الفئران

Ischemia-reperfusion induced acute kidney injury (IR-AKI) is widely used as a model of AKI in mice, but results are often quite variable with high, often ...

Acute Brain Trauma in Mice Followed By Longitudinal Two-photon Imaging

الصدمة الحادة الدماغ في الفئران تليها الطولية التصوير ثنائي الفوتون

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no ...

Minimal Invasive Surgical Procedure of Inducing Myocardial Infarction in Mice

الحد الأدنى من الإجراءات الجراحية للتحريض احتشاء عضلة القلب في الفئران

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last ...

Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Intubation-mediated Intratracheal IMIT Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

بوساطة التنبيب داخل الرغامى (IMIT) تقطير: وموسع والرئة محدد نظام تسليم

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences ...

Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research

تقطير والتثبيت طرق مفيدة في الرئة ماوس لأبحاث السرطان

The ability to instill live agents, cells, or chemicals directly into the lung without injuring or killing the mice is an important tool in lung cancer ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

فتح القصبة الهوائية المعدة حمض الطموح فأري موديل الحاد الرئة إصابة النتائج في القصوى الحاد غير قاتل الرئة الإصابات

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...

A Pleural Effusion Model in Rats by Intratracheal Instillation of Polyacrylate/Nanosilica

نموذج انصباب الجنبي في الفئران بتقطير تحسن من بولياكريلاتي/نانوسيليكا

Pleural effusion is a prevalent clinical finding of many pulmonary diseases. Having a useful animal pleural effusion model is very important to study ...

Inducing Acute Liver Injury in Rats via Carbon Tetrachloride (CCl4) Exposure Through an Orogastric Tube

Inducing Acute Liver Injury in Rats via Carbon Tetrachloride CCl4 Exposure Through an Orogastric Tube

تحفيز إصابة الكبد الحادة في الفئران عبر رابع كلوريد الكربون (CCl4)التعرض من خلال أنبوب الأوروالمعدة

Acute liver injury (ALI) plays a crucial role in the development of hepatic failure, which is characterized by severe liver dysfunction including ...

Intratracheal Instillation of Stem Cells in Term Neonatal Rats

تقطير داخل الجسم للخلايا الجذعية في فئران حديثي الولادة

Prolonged exposure to high concentrations of oxygen leads to inflammation and acute lung injury, which is similar to human bronchopulmonary dysplasia ...