Name: inducing acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation
Uploaded: 2019-07-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation at JoVE.com

Forfatterne ønsker at takke Jan Kleiner og Susanne Schulz for at yde teknisk støtte. Forfatterne anerkender den fremragende støtte af flow cytometri kerne facilitet på det medicinske fakultet ved Bonn Universitet. Forfatterne modtog ingen støtte fra nogen ekstern organisation.  En del af de data, der er angivet i resultatafsnittet og afbildet i figur 3 , er allerede vist i en tidligere publikation8.

Denne dyre protokol blev godkendt af den lokale Komité for dyrepasning (LANUV, Recklinghausen, Tyskland; protokol nr. 84-02.04.2015) og blev udført i overensstemmelse med de nationale Institut for sundhed retningslinjer for brug af levende dyr (NIH offentliggørelse Nr. 85-23, revideret 1996).
1. ALI induktion
<ol><li>Brug voksne C57BL/6-mus i en alder af ca. 10-12 uger. Hus dyrene i individuelt ventilerede bure med fri adgang til vand og standard gnaver Chow. Men det er muligt at udføre ...

<ol>
	<li>Fink, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+sepsis.">Animal models of sepsis.</a> Virulence. 5 (1), 143-153 (2014).</li><li>Lu, Y. -. C., Yeh, W. -. C., Ohashi, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS/TLR4+signal+transduction+pathway.">LPS/TLR4 signal transduction pathway.</a> Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).</li><li>Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+acute+lung+injury.">Animal models of acute lung injury.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (3), 379-399 (2008).</li><li>Rabelo, M. A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Lung+Injury+in+Response+to+Intratracheal+Instillation+of+Lipopolysaccharide+in+an+Animal+Model+of+Emphysema+Induced+by+Elastase.">Acute Lung Injury in Response to Intratracheal Instillation of Lipopolysaccharide in an Animal Model of Emphysema Induced by Elastase.</a> Inflammation. 41 (1), 174-182 (2018).</li><li>Liu, F., Li, W., Pauluhn, J., Tr&#252;bel, H., Wang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-induced+acute+lung+injury+in+rats:+comparative+assessment+of+intratracheal+instillation+and+aerosol+inhalation.">Lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats: comparative assessment of intratracheal instillation and aerosol inhalation.</a> Toxicology. 304, 158-166 (2013).</li><li>Rittirsch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Lung+Injury+Induced+by+Lipopolysaccharide+Is+Independent+of+Complement+Activation.">Acute Lung Injury Induced by Lipopolysaccharide Is Independent of Complement Activation.</a> Journal of Immunology. 180 (11), 7664-7672 (2008).</li><li>D'Alessio, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+CD25+Foxp3++Tregs+resolve+experimental+lung+injury+in+mice+and+are+present+in+humans+with+acute+lung+injury.">CD4+CD25+Foxp3+ Tregs resolve experimental lung injury in mice and are present in humans with acute lung injury.</a> The Journal of Clinical Investigation. 119 (10), 2898-2913 (2009).</li><li>Ehrentraut, H., Weisheit, C., Scheck, M., Frede, S., Hilbert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+murine+acute+lung+injury+induces+increase+of+pulmonary+TIE2-expressing+macrophages.">Experimental murine acute lung injury induces increase of pulmonary TIE2-expressing macrophages.</a> Journal of Inflammation. 15, 12 (2018).</li><li>Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+pulmonary+damage+induced+by+lipopolysaccharide+via+intranasal+instillation.">A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation.</a> Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).</li><li>Reutershan, J., Basit, A., Galkina, E. V., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+recruitment+of+neutrophils+into+lung+and+bronchoalveolar+lavage+fluid+in+LPS-induced+acute+lung+injury.">Sequential recruitment of neutrophils into lung and bronchoalveolar lavage fluid in LPS-induced acute lung injury.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 289 (5), 807-815 (2005).</li><li>Hoegl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+multifactorial+nature+of+ARDS+-+approach+to+model+murine+acute+lung+injury.">Capturing the multifactorial nature of ARDS - approach to model murine acute lung injury.</a> Physiological Reports. 6 (6), (2018).</li><li>Weisheit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ly6Clow+and+Not+Ly6Chigh+Macrophages+Accumulate+First+in+the+Heart+in+a+Model+of+Murine+Pressure-Overload.">Ly6Clow and Not Ly6Chigh Macrophages Accumulate First in the Heart in a Model of Murine Pressure-Overload.</a> PLoS ONE. 9 (11), (2014).</li><li>Grommes, J., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+Neutrophils+to+Acute+Lung+Injury.">Contribution of Neutrophils to Acute Lung Injury.</a> Molecular Medicine. 17 (3-4), 293-307 (2011).</li><li>M&#252;ller-Redetzky, H. C., Suttorp, N., Witzenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+pulmonary+endothelial+barrier+function+in+acute+inflammation:+mechanisms+and+therapeutic+perspectives.">Dynamics of pulmonary endothelial barrier function in acute inflammation: mechanisms and therapeutic perspectives.</a> Cell and Tissue Research. 355 (3), 657-673 (2014).</li><li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+apoptosis+in+lipopolysaccharide-induced+lung+injury+in+mice.">Endothelial cell apoptosis in lipopolysaccharide-induced lung injury in mice.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 117 (3), 202-208 (1998).</li><li>Doyen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+induced+by+inhaled+lipopolysaccharide+depends+on+particle+size+in+healthy+volunteers.">Inflammation induced by inhaled lipopolysaccharide depends on particle size in healthy volunteers.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 82 (5), 1371-1381 (2016).</li><li>Stephens, R. S., Johnston, L., Servinsky, L., Kim, B. S., Damarla, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tyrosine+kinase+inhibitor+imatinib+prevents+lung+injury+and+death+after+intravenous+LPS+in+mice.">The tyrosine kinase inhibitor imatinib prevents lung injury and death after intravenous LPS in mice.</a> Physiological Reports. 3 (11), (2015).</li><li>Yu, Y., Jing, L., Zhang, X., Gao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simvastatin+Attenuates+Acute+Lung+Injury+via+Regulating+CDC42-PAK4+and+Endothelial+Microparticles.">Simvastatin Attenuates Acute Lung Injury via Regulating CDC42-PAK4 and Endothelial Microparticles.</a> Shock. 47 (3), 378-384 (2017).</li></ol>

Minimal invasivitet, enkel håndtering, og god reproducerbarhed er centrale elementer i den præsenterede tilgang til at inducere ALI i en lille gnaver model. Brugen af LPS i stedet for hele bakterier i dyremodeller har fordele. Det er en stabil og ren sammensatte og kan opbevares i lyofiliseret form indtil brug. Det er en potent stimulerende for medfødte immunrespons via TLR4 pathway, og dens biologiske aktivitet kan let kvantificeres, lette titrering af sygdommens sværhedsgrad med god reproducerbarhed. Desuden, bruge...

Eksperimentelle dyremodeller er uundværlige i grundlæggende immun forskning. Administration af hele bakterier eller mikrobielle komponenter er ofte blevet brugt i små dyremodeller til at inducere lokal eller systemisk inflammation1. Lipopolysaccharid (LPS eller bakteriel endotoksin) er en cellevægkomponent og et overflade antigen af gramnegative bakterier (f. eks. Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp. eller legionella spp.). Det termo stabile og store molekyle (molekylvægt 1-4 x 106 kDa) består af en lipid-del (lipid a), kerneregion (oligosaccharid) og et o-polysaccharid (eller o-antigen). Lipid A, med dens hydrofobe fedtsyre kæder, forankrer molekylet i en bakteriel membran og medierer (ved nedbrydning af bakterier) den immunologiske aktivitet og toksicitet af LPS. Efter binding til LPS binding protein (LBP), LPS: LBP komplekser fast CD14/TLR4/MD2 receptor kompleks placeret på overfladen af mange celletyper, inducerer en stærk proinflammatorisk reaktion med NF-κb nukleare translokation og efterfølgende Opregulering af cytokinekspression2.
Akut lungeskade (ALI) er defineret som akut hypoksimisk respirationssvigt med bilateralt lungeødem i fravær af hjerteinsufficiens3. Luftvejs administration af LPS er en almindelig måde at fremkalde pulmonal inflammation og Ali4,5,6,7. Selv om det sterile stof ikke er egnet til at studere farmakologiske interventioner i smitsomme sygdomme, kan mekanistiske immunologiske spørgsmål besvares med tilstrækkelig præcision. Instillation af LPS i luftrøret inducerer en robust inflammatorisk reaktion med leukocyt invasion, upregulering af proinflammatoriske cytokiner, og afbrydelse af alveolo-kapillar barrieren inden for timer til dage, afhængigt af LPS dosering3, 6,7.
Den præsenterede protokol beskriver en detaljeret trin-for-trin procedure til at inducere Ali i mus ved intratrakeal LPS instillation. Modellen er blevet valideret ved at vurdere cytokin-ekspression, neutrofile granulocyt-invasion og intra-alveolær albumin lækage som tidligere beskrevet8.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1189px;" width="1189">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:653px;">1 ml syringes</td>
			<td style="width:289px;">BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td style="width:104px;">300013</td>
			<td style="width:143px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 ml syringes</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>309110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-CD115 (c-fms) APC</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>17-1152-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-CD11b (M1/70) - FITC</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>11-0112-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-CD45 (30-F11) - eF450</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>48-0451-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-F4/80 (BM-8) - PE Cy7</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>25-4801-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Gr1 (RB6-8C5)</td>
			<td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>552093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>45-5932-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7</td>
			<td>Bio Legend, San Diego, CA</td>
			<td>127623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Buprenorphine hydrochloride</td>
			<td>Indivior UK Limited, Berkshire, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C57BL/6 mice, female, 10 - 12 weeks old</td>
			<td>Charles River, Wilmongton, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td style="width:143px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaliBRITE APC-beads (6&#181;m)</td>
			<td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>340487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:653px;">Canula 23 gauge 1&#39;&#39;</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>300800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:653px;">Canula 26 gauge 1/2&#39;&#39;</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>303800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell strainer 70 &#181;m</td>
			<td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase Type I</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>1148089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deoxyribonuclease II</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>D8764&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS), sterile</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (PBS), without calcium chloride and magnesium chloride, sterile</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS tubes, 5 ml</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>551579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11049-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane</td>
			<td>Baxter, Unterschlei&#223;heim, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O111:B4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>L2630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Green Kit</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>L23101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block&#8482;), Clone 2.4G2</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Red blood cell lysis buffer</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI-1640, with L-glutamine and sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>14060-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium azide (NaN3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue forceps</td>
			<td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11021-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:653px;">Tubes</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>30125150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Venous catheter, 22 gauge</td>
			<td>B.Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>4268091B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine hydrochloride</td>
			<td>Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducing acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation

Luftvejs administration af lipopolysaccharid (LPS) er en almindelig måde at studere lungebetændelse og akut lungeskade (ALI) i små dyremodeller. Forskellige tilgange er blevet beskrevet, såsom indånding af aerosoliserede LPS samt nasal eller intratrakeale instillation. Den præsenterede protokol beskriver en detaljeret trin-for-trin procedure til at inducere Ali i mus ved direkte intratrakeal LPS instillation og udføre FACS analyse af blodprøver, bronchoalveolær skylning (bal) væske, og lungevævet. Efter intraperitoneal sedation er luftrøret eksponeret, og LPS administreres via et 22 G venøs kateter. En robust og reproducerbar inflammatorisk reaktion med leukocyt invasion, upregulering af proinflammatoriske cytokiner, og afbrydelse af alveolo-kapillar barrieren induceres inden for timer til dage, afhængigt af den anvendte LPS dosering. Indsamling af blodprøver, BAL-væske, og lunge høst, samt behandling af FACS analyse, er beskrevet i detaljer i protokollen. Selv om brugen af den sterile LPS ikke er egnet til at studere farmakologiske interventioner i smitsomme sygdomme, den beskrevne tilgang tilbyder minimal invasivitet, enkel håndtering, og god reproducerbarhed til at besvare mekanistiske immunologiske spørgsmål. Desuden giver dosistitrering samt brug af alternative LPS præparater eller muse stammer mulighed for graduering af de kliniske virkninger, som kan udvise forskellige grader af ALI sværhedsgrad eller tidligt vs. forsinket indtræden af sygdomssymptomer.

Den beskrevne tilgang til at inducere ALI i mus blev valideret ved at vurdere cytokinekspression, neutrofile granulocyt infiltration og alveolo-kapillar barriere forstyrrelse 24 h og 72 h efter LPS instillation. PBS-injicerede dyr tjente som kontrol. Intratracheal LPS administration inducerede en robust pulmonal proinflammatorisk respons. Ekspression af TNF-α i lungevæv var signifikant upreguleret og nåede en vedvarende og mere end 50 gange større sammenlignet med kontroldyr [RQ (TNF-α/18s); 24 h: 53,7 (SD = 11,6); ...

Watch this Scientific Journal Video about Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation at JoVE.com

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

Præsenteret her er en trin-for-trin procedure til at fremkalde akut lungeskade i mus ved direkte intratrakeal lipopolysaccharid instillation og til at udføre FACS analyse af blodprøver, bronchoalveolær skylning væske, og lungevæv. Minimal invasivitet, enkel håndtering, god reproducerbarhed, og titrering af sygdommens sværhedsgrad er fordele ved denne tilgang.

Inducerende akut lungeskade i mus ved direkte Intratracheal Lipopolysaccharid instillation

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

Pålidelige dyremodeller er afgørende komponenter i grundforskningen. Vores murine tilgang giver mulighed for at besvare immunologiske spørgsmål om mekanistiske og kinetik af akut lungeskade udvikling hos pattedyr. Minimal invasiv, enkel håndtering, samt god reproducerbarhed er de vigtigste fordele ved denne teknik.Desuden kan vi med dosistitrering modulere den kliniske effekt. Denne teknik afspejler den kliniske situation for patienter med svær lungeskade og gør det muligt at undersøge de underliggende mekanismer. Store lipopolysaccharid, eller LPS, i aliquots ved en koncentration på fem milligram per milliliter ved minus 20 grader Celsius.Ved intratracheal inddrykning fortyndes den optøede LPS i sterilt fosfatbufferet saltvand til en endelig koncentration på 2.000 mikrogram pr. milliliter. Skær et 22-gauge venekateter til en længde på 20 millimeter. Placer musen i den udsatte position på et temperaturstyret bord for at opretholde en kropstemperatur på 37 grader Celsius.Efter anæstesi som beskrevet i tekstprotokollen, anvende sterile oftalmologiske smøremiddel for at forhindre udsivning af hornherne under anæstesi. Løft hoved- og krogfortænderne på en vandret bjælke placeret ca. fem centimeter over bordet, mens forptogerne forbliver i tæt kontakt med bordet. Super-forlænge halsen i en 90 graders vinkel i forhold til bordet.Placer en kold lyskilde på huden over strubehovedet for at hjælpe med at visualisere stemmebåndene og sigte mod luftrøret. Hold tungen med snævninger til at rette halsen for lettere intubation betingelser. Korrekt visualisering og identifikation af strubehovedet er afgørende for at sikre korrekt intratracheal placering af kateteret.En ekstern kold lyskilde hjælper i dette trin. Sæt kateteret ca. 10 millimeter ind i luftrøret. Sørg for, at indsætningen ikke er for dyb, da dette vil resultere i ensidig inddrypning af væske i højre eller venstre hovedbronki.Hvis strubehovedets modstand opstår, skal kateteret trækkes tilbage et par millimeter, før det rykker frem igen. Nu injicere LPS-fortyndet MPBS ved hjælp af en pipette. Den injicerede volumen afhænger af musens kropsvægt.Tilslut en sprøjte og tilsæt en bolus på 50 mikroliter luft for at sikre, at hele væskemængden fordeles i lungerne. Fjern langsomt kateteret. Hold musens overkrop oprejst i 30 sekunder for at undgå udsivning af væsken fra luftrøret.Fastgør den aflivede mus med tape på et operationsbord, og desinficere pelsen hurtigt over maven med 70 % ethanol. Åbn bughulen forsigtigt i midterlinjen med saks og pincet. Fjern dele af tarmen for at opnå adgang til vena cava ringere ret til rygsøjlen i abdominal aorta.Find nyre venerne og indsætte en bøjet, 23-gauge kanyle forbundet til en en milliliter sprøjte i vena cava ringere, direkte under sammenløbet af venerne. Aspirere 250 mikroliter blod og overføres til et 1,5 milliliterrør fyldt med 20 mikroliter 0,5 molar EDTA-opløsning. Ryst forsigtigt for at lette EDTA-blanding og læg røret på is.For bronchoalveolar lavage, forberede tre en milliliter sprøjter, hver med 0,5 milliliter sterile PBS og 0,1 milliliter luft. Desinficere pelsen af halsen med 70% ethanol og forsigtigt udsætte luftrøret med en saks og pincet. Mobilisere luftrøret og wrap en sutur omkring det.Punkter luftrøret med mikrosaks og indsæt et 22-gauge venekateter, skåret til en længde på 20 millimeter. Kateteret fastgøres med sutur og indsuges 0,5 milliliter steril PBS og 0,1 milliliter luft. Aspirere væsken efter 60 sekunder.Proceduren gentages med de yderligere to sprøjter, og hele aspiratet opsamls i et 15 milliliterrør på is. Åbn forsigtigt brystkassen med en saks og pincet til at høste lungerne. Skær mellemgulvet langs den costal margin og skær gennem ribbenene med to laterale snit.Undgå forsigtigt at punktere lungerne. Løft brystbenet kranielly og fastsætte eller fjerne det. Forbered to 10 milliliter sprøjter med varme, 37 grader Celsius PBS.Lav et lille snit i venstre hjertekammer. Punkter højre hjertekammer med en 26-gauge kanyle. Skyl derefter lungecirkulationen med en forvardet PBS.Vær opmærksom på lungerne bliver blege under proceduren. Fjern den højre lap af lungerne og skær det i halve. Snap fryse dem i flydende nitrogen efterfulgt af langtidsopbevaring ved minus 80 grader Celsius for yderligere genekspression og proteinanalyse.Fjern hele venstre lunge og homogenisere det i en 48-brønd plade ved at hakke vævet med en saks og pincet. Inkuber vævet i to milliliter fordøjelsesbuffer ved 37 grader Celsius i 60 minutter. Udfør yderligere homogenisering ved omhyggeligt pipettering lungevæv stykker op og ned.Blodprøverne overføres til facs-rør med fem milliliter, og blodet blandes forsigtigt med to milliliter lysisbuffer for røde blodlegemer. Læg rørene på is og afslut reaktionen efter to minutter ved at tilsætte to milliliter iskold PBS. Centrifuge prøven i fem minutter ved 400 gange g og kassér supernatanten.Resuspend cell pellet med 60 mikroliter af FACS buffer og proces for efterfølgende FACS farvning i henhold til tidligere beskrevne protokoller. Centrifuge BAL væske i fem minutter ved 400 gange g. Inspirer supernatanten og frys det i flydende nitrogen efterfulgt af langtidsopbevaring ved minus 80 grader Celsius for yderligere proteinanalyse.Efter opslænkning af BAL-cellepellet med to milliliter kold FACS-buffer overføres suspensionen til et mikseret FACS-rør med fem milliliterglas ved hjælp af et 100 mikron meshfilter for at fastholde hårene. Efter centrifugering af prøven igen, resuspend pellet med 60 mikroliter af FACS buffer og proces for efterfølgende FACS farvning i henhold til tidligere beskrevne protokoller. Nu overføre fordøjet venstre lungevæv i en fem milliliter FACS rør ved hjælp af en 100 mikron mesh filter til at udtrække klumper.Afslut fordøjelsesprocessen ved at tilsætte to milliliter iskold FACS-buffer, før prøven centrifugeres i fem minutter ved 400 gange g. Kassér supernatanten og opslæmm pellet med 60 mikroliter FACS buffer og proces for efterfølgende FACS farvning i henhold til tidligere beskrevne protokoller. For en FACS analyse, tilføje 20 mikroliter af CD16/CD32 antistof blokering løsning til 60 mikroliter af celler i en fem milliliter rør.Inkuber cellerne ved fire grader Celsius i 15 minutter for at blokere uspecifikke binding af immunglobulin til Fc-receptorerne. I mellemtiden forberede en master mix med FACS buffer og antistoffer, som beskrevet i tekstprotokollen. Efter blokering, må cellerne ikke vaskes.Der tilsættes 20 mikroliter antistofmasterblanding pr. prøve for at opnå et endeligt volumen på 100 mikroliter. Inkuber prøverne i 20 minutter, i mørke, ved fire grader Celsius. Hver prøve vaskes med en milliliter FACS-buffer og centrifuge som før.Supernatanten kasseres, og pelletpens med FACS-bufferen skal revanteres til den relevante cellekoncentration til FACS-målinger. Endelig tilsættes faste numre af kommercielt tilgængelige fluorromedyrme-koblede kalibreringsperler til hver prøve for at bestemme absolutte celletal. Udfør flowcytometri ved hjælp af den gatingstrategi, der er vist i tekstprotokollen for blod-, BAL- og vævsceller.24 samt 72 timer efter intratracheal instillation, ekspression af TNF-alpha i lungevæv blev betydeligt upregulated, nå en vedvarende og mere end 50-dobling i forhold til kontroldyr. Leucocyt invasion i væv og alveolær rum er et kendetegn og karakteristisk for udviklingen af akut lungeskade. FACS analyse afslørede en betydelig infiltration af neutrofile granulocytter i lunge interstitium, med absolut celletal er steget næsten ni gange i forhold til kontrollerne efter 24 timer.Absolut neutrofil granulocyttal faldt en smule efter 72 timer, men faktorstigningen i forhold til kontrollerne forblev. I overensstemmelse med interstitiel neutrofil granulocyt infiltration, MMP-9 udtryk i hele lungevæv blev ligeledes steget betydeligt i løbet af den samlede observationsperiode. Neutrofile granulocytter blev ikke kun øget i lungevævet, men også i BAL-væsken.Folden stigning i forhold til kontrol dyr var mere udtalt end i lungevæv. Lungeødem på grund af svær svækkelse af alveolocapillary barrieren er patognomonic til udvikling af akut lungeskade. Analyse af albumen indhold i BAL væske af ELISA afslørede et betydeligt tab af barriere funktion på 24 timer og 72 timer efter LPS instillation.Korrekt kateterplacering er afgørende for bilateral inddrypning af LPS. Ofte, ændringer i respiratoriske mønstre, såsom hoste eller gisper, indikerer korrekt intratracheal instillation af væsken. Efter induktion af akut lungeskade kan der udføres en række efterfølgende trin, såsom FACS-analyse, PCR, en proteindetektion, for at besvare de respektive forskningsspørgsmål.

Research

JoVE Journal

Medicine

Pressure Controlled Ventilation to Induce Acute Lung Injury in Mice

Murine models are extensively used to investigate acute injuries of different organs systems (1-34). Acute lung injury (ALI), which occurs with prolonged ...

Ischemia-reperfusion Model of Acute Kidney Injury and Post Injury Fibrosis in Mice

Iskæmireperfusion Model akut nyreskade og Post Injury Fibrose i mus

Ischemia-reperfusion induced acute kidney injury (IR-AKI) is widely used as a model of AKI in mice, but results are often quite variable with high, often ...

Acute Brain Trauma in Mice Followed By Longitudinal Two-photon Imaging

Akut Brain Trauma i Mus Efterfulgt af Longitudinal To-foton Imaging

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no ...

Minimal Invasive Surgical Procedure of Inducing Myocardial Infarction in Mice

Minimal Invasive Kirurgisk Procedure inducere myokardieinfarkt i mus

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last ...

Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Intubation-mediated Intratracheal IMIT Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Intubation-medieret Intratracheal (IMIT) Instillation: en noninvasiv, Lunge-specifik Delivery System

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences ...

Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research

Inddrypning og fikseringsmetoder Nyttige i muselunge Cancer Research

The ability to instill live agents, cells, or chemicals directly into the lung without injuring or killing the mice is an important tool in lung cancer ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

Åbent Tracheostomituber Gastric Acid Aspiration murin model af akut lungeskade Resultater i Maximal Akut ikke-letale Lung Injury

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...

A Pleural Effusion Model in Rats by Intratracheal Instillation of Polyacrylate/Nanosilica

En Pleural Effusion Model i rotter ved intratrakeal Instillation af polyacrylat/Nanosilica

Pleural effusion is a prevalent clinical finding of many pulmonary diseases. Having a useful animal pleural effusion model is very important to study ...

Inducing Acute Liver Injury in Rats via Carbon Tetrachloride (CCl4) Exposure Through an Orogastric Tube

Inducing Acute Liver Injury in Rats via Carbon Tetrachloride CCl4 Exposure Through an Orogastric Tube

Inducerende akut leverskade hos rotter via tetrachlormethan (CCl4)Eksponering gennem et orogastrisk rør

Acute liver injury (ALI) plays a crucial role in the development of hepatic failure, which is characterized by severe liver dysfunction including ...

Intratracheal Instillation of Stem Cells in Term Neonatal Rats

Intratracheal instillation af stamceller i termer neonatal rotter

Prolonged exposure to high concentrations of oxygen leads to inflammation and acute lung injury, which is similar to human bronchopulmonary dysplasia ...