Name: inducing acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation
Uploaded: 2019-07-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation at JoVE.com

De auteurs willen Jan kleiner en Susanne Schulz bedanken voor het verlenen van technische ondersteuning. De auteurs erkennen de uitstekende ondersteuning van de flow Cytometry core Facility aan de medische faculteit van de Universiteit van Bonn. De auteurs kregen geen financiering van een externe organisatie.  Een deel van de gegevens in de resultaten sectie en afgebeeld in Figuur 3 is reeds getoond in een vorige publicatie8.

Dit dierlijke protocol werd goedgekeurd door de lokale Commissie voor dierlijke zorg (LANUV, Recklinghausen, Duitsland; Protocol nr. 84-02.04.2015) en werd uitgevoerd overeenkomstig de nationale instituten van de richtlijnen van de gezondheid voor het gebruik van levende dieren (de publicatie van NIH Nr. 85-23, herziene versie van 1996).
1. ALI inductie
<ol><li>Gebruik volwassen C57BL/6 muizen op leeftijden van ongeveer 10-12 weken. Huis de dieren in individueel geventileerde kooien met grat...

<ol>
	<li>Fink, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+sepsis.">Animal models of sepsis.</a> Virulence. 5 (1), 143-153 (2014).</li><li>Lu, Y. -. C., Yeh, W. -. C., Ohashi, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS/TLR4+signal+transduction+pathway.">LPS/TLR4 signal transduction pathway.</a> Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).</li><li>Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+acute+lung+injury.">Animal models of acute lung injury.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (3), 379-399 (2008).</li><li>Rabelo, M. A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Lung+Injury+in+Response+to+Intratracheal+Instillation+of+Lipopolysaccharide+in+an+Animal+Model+of+Emphysema+Induced+by+Elastase.">Acute Lung Injury in Response to Intratracheal Instillation of Lipopolysaccharide in an Animal Model of Emphysema Induced by Elastase.</a> Inflammation. 41 (1), 174-182 (2018).</li><li>Liu, F., Li, W., Pauluhn, J., Tr&#252;bel, H., Wang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-induced+acute+lung+injury+in+rats:+comparative+assessment+of+intratracheal+instillation+and+aerosol+inhalation.">Lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats: comparative assessment of intratracheal instillation and aerosol inhalation.</a> Toxicology. 304, 158-166 (2013).</li><li>Rittirsch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Lung+Injury+Induced+by+Lipopolysaccharide+Is+Independent+of+Complement+Activation.">Acute Lung Injury Induced by Lipopolysaccharide Is Independent of Complement Activation.</a> Journal of Immunology. 180 (11), 7664-7672 (2008).</li><li>D'Alessio, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+CD25+Foxp3++Tregs+resolve+experimental+lung+injury+in+mice+and+are+present+in+humans+with+acute+lung+injury.">CD4+CD25+Foxp3+ Tregs resolve experimental lung injury in mice and are present in humans with acute lung injury.</a> The Journal of Clinical Investigation. 119 (10), 2898-2913 (2009).</li><li>Ehrentraut, H., Weisheit, C., Scheck, M., Frede, S., Hilbert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+murine+acute+lung+injury+induces+increase+of+pulmonary+TIE2-expressing+macrophages.">Experimental murine acute lung injury induces increase of pulmonary TIE2-expressing macrophages.</a> Journal of Inflammation. 15, 12 (2018).</li><li>Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+pulmonary+damage+induced+by+lipopolysaccharide+via+intranasal+instillation.">A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation.</a> Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).</li><li>Reutershan, J., Basit, A., Galkina, E. V., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+recruitment+of+neutrophils+into+lung+and+bronchoalveolar+lavage+fluid+in+LPS-induced+acute+lung+injury.">Sequential recruitment of neutrophils into lung and bronchoalveolar lavage fluid in LPS-induced acute lung injury.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 289 (5), 807-815 (2005).</li><li>Hoegl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+multifactorial+nature+of+ARDS+-+approach+to+model+murine+acute+lung+injury.">Capturing the multifactorial nature of ARDS - approach to model murine acute lung injury.</a> Physiological Reports. 6 (6), (2018).</li><li>Weisheit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ly6Clow+and+Not+Ly6Chigh+Macrophages+Accumulate+First+in+the+Heart+in+a+Model+of+Murine+Pressure-Overload.">Ly6Clow and Not Ly6Chigh Macrophages Accumulate First in the Heart in a Model of Murine Pressure-Overload.</a> PLoS ONE. 9 (11), (2014).</li><li>Grommes, J., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+Neutrophils+to+Acute+Lung+Injury.">Contribution of Neutrophils to Acute Lung Injury.</a> Molecular Medicine. 17 (3-4), 293-307 (2011).</li><li>M&#252;ller-Redetzky, H. C., Suttorp, N., Witzenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+pulmonary+endothelial+barrier+function+in+acute+inflammation:+mechanisms+and+therapeutic+perspectives.">Dynamics of pulmonary endothelial barrier function in acute inflammation: mechanisms and therapeutic perspectives.</a> Cell and Tissue Research. 355 (3), 657-673 (2014).</li><li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+apoptosis+in+lipopolysaccharide-induced+lung+injury+in+mice.">Endothelial cell apoptosis in lipopolysaccharide-induced lung injury in mice.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 117 (3), 202-208 (1998).</li><li>Doyen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+induced+by+inhaled+lipopolysaccharide+depends+on+particle+size+in+healthy+volunteers.">Inflammation induced by inhaled lipopolysaccharide depends on particle size in healthy volunteers.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 82 (5), 1371-1381 (2016).</li><li>Stephens, R. S., Johnston, L., Servinsky, L., Kim, B. S., Damarla, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tyrosine+kinase+inhibitor+imatinib+prevents+lung+injury+and+death+after+intravenous+LPS+in+mice.">The tyrosine kinase inhibitor imatinib prevents lung injury and death after intravenous LPS in mice.</a> Physiological Reports. 3 (11), (2015).</li><li>Yu, Y., Jing, L., Zhang, X., Gao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simvastatin+Attenuates+Acute+Lung+Injury+via+Regulating+CDC42-PAK4+and+Endothelial+Microparticles.">Simvastatin Attenuates Acute Lung Injury via Regulating CDC42-PAK4 and Endothelial Microparticles.</a> Shock. 47 (3), 378-384 (2017).</li></ol>

Minimale invasieve, eenvoudige behandeling, en een goede reproduceerbaarheid zijn de belangrijkste kenmerken van de gepresenteerde aanpak om ALI te induceren in een klein knaagdier model. Het gebruik van LPS in plaats van hele bacteriën in diermodellen heeft voordelen. Het is een stabiele en zuivere verbinding en kan in gelyofiliseerde vorm tot gebruik worden opgeslagen. Het is een krachtige stimulans voor aangeboren immuunsysteem reacties via de TLR4 pathway, en de biologische activiteit kan gemakkelijk worden gekwanti...

Experimentele diermodellen zijn onmisbaar in fundamenteel immuun onderzoek. Toediening van hele bacteriën of microbiële componenten is vaak gebruikt in kleine diermodellen om lokale of systemische ontsteking te induceren1. Lipopolysaccharide (LPS, of bacteriële endotoxine) is een component van de celwand en het Oppervlakteantigeen van gram-negatieve bacteriën (b.v., Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., of Legionella spp.). De thermostable en grote molecule (molecuulgewicht 1-4 x 106 kDa) bestaat uit een lipide moiety (lipide a), kerngebied (oligosaccharide), en een o-polysaccharide (of o-antigeen). Lipide A, met zijn hydrofobe vetzuurketens, verankert het molecuul in een bacterieel membraan en bemiddelt (bij afbraak van bacteriën) de immunologische activiteit en de toxiciteit van LPS. Na binding aan de LPS bindende eiwitten (LBP), LPS: LBP complexen binden de CD14/TLR4/MD2 receptor complex gelegen op het oppervlak van vele soorten cellen, het induceren van een sterke proinflammatoire reactie met NF-κB nucleaire translocatie en latere upregulering van cytokine uitdrukking2.
Acute longschade (ALI) wordt gedefinieerd als acute hypoxemic respiratoir falen met bilaterale longoedeem in de afwezigheid van hartfalen3. Luchtweg toediening van LPS is een veel voorkomende manier om longontsteking en Ali4,5,6,7te induceren. Hoewel de steriele stof niet geschikt is om farmacologische interventies bij besmettelijke ziekten te bestuderen, kunnen mechanistische immunologische vragen met voldoende nauwkeurigheid worden beantwoord. Instillatie van LPS in de luchtpijp induceert een robuuste inflammatoire reactie met leukocyten invasie, upregulering van proinflammatoire cytokines, en verstoring van de alveolo-capillaire barrière binnen enkele uren tot dagen, afhankelijk van de LPS dosering3, 6,7.
Het gepresenteerde protocol beschrijft een gedetailleerde stap-voor-stap procedure om ALI te induceren in muizen door intratracheal LPS instillatie. Het model is gevalideerd door de beoordeling van cytokine-expressie, Neutrofiele granulocyt invasie, en intra-alveolaire albumine lekkage zoals eerder beschreven8.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1189px;" width="1189">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:653px;">1 ml syringes</td>
			<td style="width:289px;">BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td style="width:104px;">300013</td>
			<td style="width:143px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 ml syringes</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>309110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-CD115 (c-fms) APC</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>17-1152-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-CD11b (M1/70) - FITC</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>11-0112-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-CD45 (30-F11) - eF450</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>48-0451-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-F4/80 (BM-8) - PE Cy7</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>25-4801-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Gr1 (RB6-8C5)</td>
			<td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>552093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>45-5932-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7</td>
			<td>Bio Legend, San Diego, CA</td>
			<td>127623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Buprenorphine hydrochloride</td>
			<td>Indivior UK Limited, Berkshire, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C57BL/6 mice, female, 10 - 12 weeks old</td>
			<td>Charles River, Wilmongton, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td style="width:143px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaliBRITE APC-beads (6&#181;m)</td>
			<td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>340487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:653px;">Canula 23 gauge 1&#39;&#39;</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>300800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:653px;">Canula 26 gauge 1/2&#39;&#39;</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>303800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell strainer 70 &#181;m</td>
			<td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase Type I</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>1148089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deoxyribonuclease II</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>D8764&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS), sterile</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (PBS), without calcium chloride and magnesium chloride, sterile</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS tubes, 5 ml</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>551579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11049-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane</td>
			<td>Baxter, Unterschlei&#223;heim, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O111:B4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>L2630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Green Kit</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>L23101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block&#8482;), Clone 2.4G2</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Red blood cell lysis buffer</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI-1640, with L-glutamine and sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>14060-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium azide (NaN3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue forceps</td>
			<td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11021-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:653px;">Tubes</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>30125150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Venous catheter, 22 gauge</td>
			<td>B.Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>4268091B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine hydrochloride</td>
			<td>Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducing acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation

Luchtweg toediening van lipopolysaccharide (LPS) is een veel voorkomende manier om longontsteking en acute longschade (ALI) studie in kleine diermodellen. Verschillende benaderingen zijn beschreven, zoals de inhalatie van vernevelde LP'S en nasale of intratracheal instillatie. Het gepresenteerde protocol beschrijft een gedetailleerde stap-voor-stap procedure om ALI te induceren in muizen door directe intratracheal LPS instillatie en uit te voeren FACS analyse van bloedmonsters, bronchoalveolaire lavage (BAL) vloeistof, en longweefsel. Na intraperitoneale sedatie, is de luchtpijp blootgesteld en LPS wordt toegediend via een 22 G veneuze katheter. Een robuuste en reproduceerbare inflammatoire reactie met leukocyten invasie, upregulering van proinflammatoire cytokines, en verstoring van de alveolo-capillaire barrière wordt geïnduceerd binnen enkele uren tot dagen, afhankelijk van de gebruikte LPS dosering. De inzameling van bloedsteekproeven, BAL vloeistof, en Long het oogsten, evenals de verwerking voor FACS analyse, worden beschreven in detail in het protocol. Hoewel het gebruik van de steriele LPS niet geschikt is om farmacologische interventies bij besmettelijke ziekten te bestuderen, biedt de beschreven aanpak minimale invasieve, eenvoudige handling en goede reproduceerbaarheid om mechanistische immunologische vragen te beantwoorden. Bovendien, dosis titratie, alsmede het gebruik van alternatieve LP'S preparaten of muis stammen kunnen modulatie van de klinische effecten, die kunnen vertonen verschillende graden van ALI ernst of vroege versus late begin van de ziektesymptomen.

De beschreven aanpak voor het induceren van ALI in muizen werd gevalideerd door de beoordeling van cytokine-expressie, Neutrofiele granulocyt infiltratie, en alveolo-capillaire barrière verstoring 24 h en 72 h na LPS instillatie. PBS-geïnjecteerde dieren diende als controle. Intratracheal LPS toediening geïnduceerde een robuuste Long proinflammatoire respons. De uitdrukking van TNF-α in longweefsel was beduidend upgereguleerd, het bereiken van een aanhoudende en meer dan 50-voudige toename ten opzichte van de control...

Watch this Scientific Journal Video about Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation at JoVE.com

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

Hier gepresenteerd is een stap-voor-stap procedure om acute longschade in muizen induceren door directe intratracheal lipopolysaccharide instillatie en uit te voeren FACS analyse van bloedmonsters, bronchoalveolaire lavage vloeistof, en longweefsel. Minimale invasieve, eenvoudige handling, goede reproduceerbaarheid, en titratie van de ziekte ernst zijn voordelen van deze aanpak.

Inducerende acute Long blessure bij muizen door directe Intratracheal lipopolysaccharide instillatie

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

Betrouwbare diermodellen zijn cruciale onderdelen van fundamenteel onderzoek. Onze murine-aanpak maakt het beantwoorden van immunologische vragen over de mechanistiek en kinetiek van acute longletselontwikkeling bij zoogdieren mogelijk. Minimale invasieve, eenvoudige behandeling, evenals een goede reproduceerbaarheid zijn de belangrijkste voordelen van deze techniek.Bovendien kunnen we met dosistitratie het klinische effect moduleren. Deze techniek weerspiegelt de klinische situatie van patiënten met ernstig longletsel en maakt het mogelijk om de onderliggende mechanismen te onderzoeken. Bewaar lipopolysaccharide, of LPS, in aliquots bij een concentratie van vijf milligram per milliliter bij min 20 graden Celsius.Verdun voor intratracheale instillatie de ontdooide LPS in steriel fosfaat gebufferde zoutoplossing tot een uiteindelijke concentratie van 2.000 microgram per milliliter. Snijd een 22-gauge veneuze katheter tot een lengte van 20 millimeter. Plaats de muis in de gevoelige positie op een temperatuurgecontroleerde tafel om een lichaamstemperatuur van 37 graden Celsius te behouden.Na anesthesie zoals beschreven in het tekstprotocol, breng steriel oogheelkundig smeermiddel toe om uitdroging van hoornvliezen onder anesthesie te voorkomen. Til de kop en haak snijtanden op een horizontale balk geplaatst ongeveer vijf centimeter boven de tafel, terwijl de voorpoten blijven in nauw contact met de tafel. Breid de nek uit in een hoek van 90 graden ten opzichte van de tafel.Plaats een koude lichtbron op de huid boven het strottenhoofd om de stembanden te visualiseren en te streven naar de luchtpijp. Houd de tong met tangen om de keel recht te maken voor gemakkelijkere intubatie voorwaarden. Een goede visualisatie en identificatie van het strottenhoofd zijn van cruciaal belang om een correcte intratracheale plaatsing van de katheter te garanderen.Een externe koude lichtbron helpt bij deze stap. Steek de katheter ongeveer 10 millimeter in de luchtpijp. Zorg ervoor dat het inbrengen niet te diep is, omdat dit zal resulteren in eenzijdige instillatie van vloeistof in de rechter- of linker hoofdbronchus.Als er weerstand van het strottenhoofd optreedt, trekt u de katheter een paar millimeter in voordat u weer oprukt. Nu, injecteer de LPS-verdunde MPBS met behulp van een pipet. Het geïnjecteerde volume is afhankelijk van het lichaamsgewicht van de muis.Sluit een spuit aan en voeg een bolus van 50 microliters lucht toe om ervoor te zorgen dat het volledige vloeibare volume in de longen wordt verdeeld. Verwijder de katheter langzaam. Houd het bovenlichaam van de muis gedurende 30 seconden rechtop om lekkage van de vloeistof uit de luchtpijp te voorkomen.Bevestig de geëuthanaseerde muis met tape op een operatietafel en desinfecteer de vacht kort over de buik met 70% ethanol. Open de buikholte voorzichtig in de mediane lijn met een schaar en een pincet. Verwijder delen van de darm om toegang te krijgen tot de vena cava inferieur recht op de wervelkolom in de abdominale aorta.Zoek de nieraderen en steek een gebogen, 23-gauge canule aangesloten op een een milliliter spuit in de vena cava inferieur, direct onder de samenvloeiing van de aderen. Aspirate 250 microliter bloed en breng over in een buis van 1,5 milliliter gevuld met 20 microliter edta-oplossing van 0,5 molaire. Schud voorzichtig om EDTA mengen te vergemakkelijken en zet de buis op ijs.Voor bronchoalveolar lavage, bereiden drie een milliliter spuiten, elk met 0,5 milliliter steriele PBS en 0,1 milliliter lucht. Desinfecteer de vacht van de keel met 70% ethanol en leg de luchtpijp voorzichtig bloot met een schaar en pincet. Mobiliseer de luchtpijp en wikkel er een hechting omheen.Puncteer de luchtpijp met behulp van een microschaar en steek een 22-gauge veneuze katheter, gesneden tot een lengte van 20 millimeter. Bevestig de katheter met een hechting en inboezeel 0,5 milliliter steriele PBS en 0,1 milliliter lucht. De vloeistof na 60 seconden aanzuigen.Herhaal de procedure met de extra twee spuiten en verzamel de hele aanzuigen in een buis van 15 milliliter op ijs. Open de thorax voorzichtig met een schaar en een pincet om de longen te oogsten. Snijd het middenrif langs de costal marge en snijd door de ribben met twee laterale insnijdingen.Vermijd voorzichtig het doorboren van de longen. Til het borstbeen cranially en vast te stellen of te verwijderen. Bereid twee 10 milliliter spuiten met warme, 37 graden Celsius PBS.Maak een kleine incisie in de linker ventrikel. Prik de rechter ventrikel met een 26-gauge canule. Spoel vervolgens de longcirculatie door met een voorverwarmde PBS.Wees je ervan bewust dat de longen bleek worden tijdens de procedure. Verwijder de rechter kwab van de longen en snijd het in tweeën. Snap bevriezen ze in vloeibare stikstof, gevolgd door langdurige opslag op min 80 graden Celsius voor verdere genexpressie en eiwitanalyse.Verwijder de hele linkerlong en homogeniseren in een 48-put plaat door het mengen van het weefsel met een schaar en pincet. Incubeer het weefsel in twee milliliter spijsverteringsbuffer bij 37 graden Celsius gedurende 60 minuten. Voer verdere homogenisatie uit door de stukjes longweefsel voorzichtig op en neer te pipetten.Breng de bloedmonsters over in vijf milliliter FACS-buizen en meng het bloed voorzichtig met twee milliliters rode bloedcellysebuffer. Zet de buizen op ijs en beëindig de reactie na twee minuten door twee milliliter ijskoude PBS toe te voegen. Centrifugeren het monster gedurende vijf minuten op 400 keer g en gooi het supernatant weg.Resuspend de cel pellet met 60 microliters van FACS buffer en proces voor latere FACS vlekken volgens eerder beschreven protocollen. Centrifuge BAL vloeistof gedurende vijf minuten op 400 keer g. Aspirate de supernatant en bevriezen in vloeibare stikstof, gevolgd door langdurige opslag op min 80 graden Celsius voor verdere eiwitanalyse.Na het opnieuw in gebruik brengen van de BAL-celpellet met twee milliliter koude FACS-buffer, breng je de suspensie over in een 5 milliliter FACS-buis met behulp van een 100 micron meshfilter om haren te bedwingen. Na het opnieuw centrifugeren van het monster, resuspend de pellet met 60 microliters van FACS buffer en proces voor latere FACS vlekken volgens eerder beschreven protocollen. Breng nu het verteerde linker longweefsel over in een 5 milliliter FACS buis met behulp van een 100 micron mesh filter om klonten te extraheren.Beëindig het verteringsproces door twee milliliter ijskoude FACS-buffer toe te voegen voordat het monster vijf minuten op 400 keer g wordt gecentrifugd. Gooi de supernatant weg en verleg de pellet met 60 microliter facs-buffer en proces voor latere FACS-vlekken volgens eerder beschreven protocollen. Voeg voor een FACS-analyse 20 microliters cd16/CD32-antilichaamblokkeringsoplossing toe aan 60 microliter cellen in een buis van vijf milliliter.Incubeer de cellen op vier graden Celsius gedurende 15 minuten om niet-specifieke binding van immunoglobuline aan de Fc-receptoren te blokkeren. Bereid ondertussen een mastermix voor met FACS-buffer en antilichamen, zoals beschreven in het tekstprotocol. Na het blokkeren, niet wassen van de cellen.Voeg 20 microliter antilichaammastermix per monster toe om een uiteindelijk volume van 100 microliters te verkrijgen. Broed de monsters gedurende 20 minuten, in het donker, op vier graden Celsius. Was elk monster met een milliliter FACS buffer en centrifuge als voorheen.Gooi de supernatant weg en zet de pellet opnieuw op met FACS-buffer naar de juiste celconcentratie voor FACS-metingen. Voeg ten slotte vaste aantallen commercieel beschikbare fluorchrome-gekoppelde kalibratiekralen toe aan elk monster om absolute celnummers te bepalen. Voer stroomcytometrie uit met behulp van de gatingstrategie in het tekstprotocol voor bloed, BAL en weefselcellen.24 evenals 72 uur na intratracheale instillatie, was de expressie van TNF-alpha in longweefsel aanzienlijk upregulated, het bereiken van een aanhoudende en meer dan 50-voudige toename in vergelijking met de controledieren. Leucocyten invasie in weefsel en alveolaire ruimte is een kenmerk en kenmerkend voor de ontwikkeling van acute longletsel. FACS analyse bleek een aanzienlijke infiltratie van neutrofiele granulocyten in de long interstitium, met absolute cel telling zijn toegenomen bijna negen keer in vergelijking met de controles na 24 uur.Het aantal absolute neutrofiele granulocyten is na 72 uur licht gedaald, maar de factortoename ten opzichte van de controles bleef. In overeenstemming met interstitiële neutrofiele granulocyte-infiltratie, werd de MMP-9-expressie in hele longweefsel eveneens aanzienlijk toegenomen tijdens de totale observatieperiode. Neutrofiele granulocyten werden niet alleen verhoogd in het longweefsel, maar ook in de BAL-vloeistof.De vouwtoename ten opzichte van controledieren was meer uitgesproken dan in het longweefsel. Longoedeem als gevolg van ernstige aantasting van de alveolocapillaire barrière is pathognomonic voor de ontwikkeling van acute longletsel. Analyse van albumen inhoud in BAL vloeistof door ELISA bleek een aanzienlijk verlies van barrière functie op 24 uur en 72 uur na LPS instillatie.Een goede katheterplaatsing is cruciaal voor bilaterale instillatie van LPS. Vaak wijzen veranderingen in ademhalingspatronen, zoals hoesten of hijgen, op een correcte intratracheale instillatie van de vloeistof. Na inductie van acute longletsels kunnen een aantal volgende stappen, zoals FACS-analyse, PCR, een eiwitdetectie, worden uitgevoerd om de respectieve onderzoeksvragen te beantwoorden.

Research

JoVE Journal

Medicine

Pressure Controlled Ventilation to Induce Acute Lung Injury in Mice

Druk gecontroleerde ventilatie te Acute Lung Injury in Muizen Braken

Murine models are extensively used to investigate acute injuries of different organs systems (1-34). Acute lung injury (ALI), which occurs with prolonged ...

Ischemia-reperfusion Model of Acute Kidney Injury and Post Injury Fibrosis in Mice

Ischemie-reperfusie model van Acute Kidney Injury en Post Letsel Fibrosis in Muizen

Ischemia-reperfusion induced acute kidney injury (IR-AKI) is widely used as a model of AKI in mice, but results are often quite variable with high, often ...

Acute Brain Trauma in Mice Followed By Longitudinal Two-photon Imaging

Acute Brain Trauma in Muizen gevolgd door Longitudinale Twee-foton Imaging

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no ...

Minimal Invasive Surgical Procedure of Inducing Myocardial Infarction in Mice

Minimaal invasieve chirurgische procedure voor het induceren van Myocardinfarct in Muizen

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last ...

Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Intubation-mediated Intratracheal IMIT Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Intubatie-gemedieerde Intratracheaal (IMIT) Blaasinstillatie: een niet-invasieve, Lung-specifieke Delivery System

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences ...

Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research

Instillatie en Fixatie Methoden Nuttig in Mouse Lung Cancer Research

The ability to instill live agents, cells, or chemicals directly into the lung without injuring or killing the mice is an important tool in lung cancer ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

Open Tracheostomie Maagzuur Aspiration muizenmodel van Acute Lung Injury Resultaten in Maximal Acute Lung Injury nonlethal

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...

A Pleural Effusion Model in Rats by Intratracheal Instillation of Polyacrylate/Nanosilica

Een Model van de pleurale effusie bij ratten door intratracheale instillatietest van polyacrylaat/Nanosilica

Pleural effusion is a prevalent clinical finding of many pulmonary diseases. Having a useful animal pleural effusion model is very important to study ...

Inducing Acute Liver Injury in Rats via Carbon Tetrachloride (CCl4) Exposure Through an Orogastric Tube

Inducing Acute Liver Injury in Rats via Carbon Tetrachloride CCl4 Exposure Through an Orogastric Tube

Acute leverschade bij ratten veroorzaken via Carbon Tetrachloride (CCl4)Blootstelling via een Orogastrische buis

Acute liver injury (ALI) plays a crucial role in the development of hepatic failure, which is characterized by severe liver dysfunction including ...

Intratracheal Instillation of Stem Cells in Term Neonatal Rats

Intratracheale instillatie van stamcellen in term neonatale ratten

Prolonged exposure to high concentrations of oxygen leads to inflammation and acute lung injury, which is similar to human bronchopulmonary dysplasia ...