Name: inducing acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation
Uploaded: 2019-07-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation at JoVE.com

המחברים רוצים להודות ליאן קליינר וסוזן שולץ על מתן תמיכה טכנית. המחברים מכירים בתמיכה המצוינת של מתקן הליבה של הזרם cy, בפקולטה לרפואה של אוניברסיטת בון. המחברים לא קיבלו מימון מארגון חיצוני כלשהו.  חלק מהנתונים שניתנו במקטע התוצאות ומתוארים באיור 3 כבר הוצגו בפרסום קודם8.

פרוטוקול בעלי חיים זה אושר על ידי הוועדה המקומית לטיפול בבעלי חיים (LANUV, רקלינגהאוזן, גרמניה; פרוטוקול 84-02.04.2015) ובוצע בהתאם הנחיות המכון הלאומי לבריאות לשימוש בעלי חיים חיים (הפרסום NIH No 85-23, תוקן 1996).
1. עלי השראה
<ol><li>השתמש במבוגר C57BL/6 עכברים בגילאים של כ 10-12 שבועות. הבית בעלי ה?...

<ol>
	<li>Fink, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+sepsis.">Animal models of sepsis.</a> Virulence. 5 (1), 143-153 (2014).</li><li>Lu, Y. -. C., Yeh, W. -. C., Ohashi, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS/TLR4+signal+transduction+pathway.">LPS/TLR4 signal transduction pathway.</a> Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).</li><li>Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+acute+lung+injury.">Animal models of acute lung injury.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (3), 379-399 (2008).</li><li>Rabelo, M. A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Lung+Injury+in+Response+to+Intratracheal+Instillation+of+Lipopolysaccharide+in+an+Animal+Model+of+Emphysema+Induced+by+Elastase.">Acute Lung Injury in Response to Intratracheal Instillation of Lipopolysaccharide in an Animal Model of Emphysema Induced by Elastase.</a> Inflammation. 41 (1), 174-182 (2018).</li><li>Liu, F., Li, W., Pauluhn, J., Tr&#252;bel, H., Wang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-induced+acute+lung+injury+in+rats:+comparative+assessment+of+intratracheal+instillation+and+aerosol+inhalation.">Lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats: comparative assessment of intratracheal instillation and aerosol inhalation.</a> Toxicology. 304, 158-166 (2013).</li><li>Rittirsch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Lung+Injury+Induced+by+Lipopolysaccharide+Is+Independent+of+Complement+Activation.">Acute Lung Injury Induced by Lipopolysaccharide Is Independent of Complement Activation.</a> Journal of Immunology. 180 (11), 7664-7672 (2008).</li><li>D'Alessio, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+CD25+Foxp3++Tregs+resolve+experimental+lung+injury+in+mice+and+are+present+in+humans+with+acute+lung+injury.">CD4+CD25+Foxp3+ Tregs resolve experimental lung injury in mice and are present in humans with acute lung injury.</a> The Journal of Clinical Investigation. 119 (10), 2898-2913 (2009).</li><li>Ehrentraut, H., Weisheit, C., Scheck, M., Frede, S., Hilbert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+murine+acute+lung+injury+induces+increase+of+pulmonary+TIE2-expressing+macrophages.">Experimental murine acute lung injury induces increase of pulmonary TIE2-expressing macrophages.</a> Journal of Inflammation. 15, 12 (2018).</li><li>Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+pulmonary+damage+induced+by+lipopolysaccharide+via+intranasal+instillation.">A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation.</a> Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).</li><li>Reutershan, J., Basit, A., Galkina, E. V., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+recruitment+of+neutrophils+into+lung+and+bronchoalveolar+lavage+fluid+in+LPS-induced+acute+lung+injury.">Sequential recruitment of neutrophils into lung and bronchoalveolar lavage fluid in LPS-induced acute lung injury.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 289 (5), 807-815 (2005).</li><li>Hoegl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+multifactorial+nature+of+ARDS+-+approach+to+model+murine+acute+lung+injury.">Capturing the multifactorial nature of ARDS - approach to model murine acute lung injury.</a> Physiological Reports. 6 (6), (2018).</li><li>Weisheit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ly6Clow+and+Not+Ly6Chigh+Macrophages+Accumulate+First+in+the+Heart+in+a+Model+of+Murine+Pressure-Overload.">Ly6Clow and Not Ly6Chigh Macrophages Accumulate First in the Heart in a Model of Murine Pressure-Overload.</a> PLoS ONE. 9 (11), (2014).</li><li>Grommes, J., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+Neutrophils+to+Acute+Lung+Injury.">Contribution of Neutrophils to Acute Lung Injury.</a> Molecular Medicine. 17 (3-4), 293-307 (2011).</li><li>M&#252;ller-Redetzky, H. C., Suttorp, N., Witzenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+pulmonary+endothelial+barrier+function+in+acute+inflammation:+mechanisms+and+therapeutic+perspectives.">Dynamics of pulmonary endothelial barrier function in acute inflammation: mechanisms and therapeutic perspectives.</a> Cell and Tissue Research. 355 (3), 657-673 (2014).</li><li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+apoptosis+in+lipopolysaccharide-induced+lung+injury+in+mice.">Endothelial cell apoptosis in lipopolysaccharide-induced lung injury in mice.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 117 (3), 202-208 (1998).</li><li>Doyen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+induced+by+inhaled+lipopolysaccharide+depends+on+particle+size+in+healthy+volunteers.">Inflammation induced by inhaled lipopolysaccharide depends on particle size in healthy volunteers.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 82 (5), 1371-1381 (2016).</li><li>Stephens, R. S., Johnston, L., Servinsky, L., Kim, B. S., Damarla, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tyrosine+kinase+inhibitor+imatinib+prevents+lung+injury+and+death+after+intravenous+LPS+in+mice.">The tyrosine kinase inhibitor imatinib prevents lung injury and death after intravenous LPS in mice.</a> Physiological Reports. 3 (11), (2015).</li><li>Yu, Y., Jing, L., Zhang, X., Gao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simvastatin+Attenuates+Acute+Lung+Injury+via+Regulating+CDC42-PAK4+and+Endothelial+Microparticles.">Simvastatin Attenuates Acute Lung Injury via Regulating CDC42-PAK4 and Endothelial Microparticles.</a> Shock. 47 (3), 378-384 (2017).</li></ol>

פולשני מינימלי, טיפול פשוט, ומהווה מאפיינים טובים הם תכונות מפתח של הגישה המוצגת כדי לגרום ALI במודל מכרסם קטן. השימוש LPS במקום חיידקים שלמים במודלים לבעלי חיים יש יתרונות. זהו תרכובת יציבה וטהורה, וניתן לאחסנם בצורה ליאופטוחה עד לשימוש. זהו ממריץ חזק עבור תגובות החיסונית מולדים באמצעות מסל?...

מודלים ניסיוניים לבעלי חיים הינם חיוניים במחקרים חיסוניים בסיסיים. מינהל של חיידקים שלמים או מרכיבים מיקרוביאלית נעשה שימוש תכוף במודלים בעלי חיים קטנים כדי לגרום לדלקת מקומית או מערכתית1. ליפופוליסכריד (LPS, או אנדוטוקסין חיידקי) הוא רכיב קיר תא ואנטיגן פני השטח של חיידקים גראם שליליים (למשל, בריקובאכניים, פסאודומונס spp.). המולקולה התרמויציבה והגדולה (משקל מולקולרי 1-4 x 106 kda) מורכב moiety השומנים (ליפיד a), אזור הליבה (oligosaccharide), ו-o רב סוכר (או אנטיגן o). ליפיד A, עם שרשראות חומצות שומן הידרופובי שלה, עוגנים את המולקולה לתוך קרום חיידקי ו סכסוכי (על השפלה של חיידקים) את הפעילות החיסונית רעילות של lps. בעקבות הכריכה לחלבון איגוד lps (LBP), lps: LBP מתחמי פסיקים CD14/TLR4/MD2 מורכבות הקולטן ממוקם על המשטח של סוגי תאים רבים, גרימת תגובה חזקה proinflammatory עם טרנסלוקציה גרעינית NF-κB והבאים upregulation ביטוי של ציטוקין2.
פגיעה חריפה בריאות (עלי) מוגדרת ככשל נשימתי חריף באמצעות בצקת בריאות דו-צדדית בהיעדר אי ספיקת לב3. מינהל דרכי הנשימה של lps היא דרך נפוצה כדי לגרום לדלקת ריאתי עלי4,5,6,7. למרות שהחומר הסטרילי אינו מתאים לחקר התערבויות פרמקולוגית במחלות זיהומיות, ניתן לענות על שאלות אימונולוגיות מכניסטיות בדיוק מספיק. הסטיזילציה של LPS לתוך קנה הנשימה גורמת תגובה דלקתית חזקה עם הפלישה לוקיציט, upregulation של ציטוקינים proinflammatory, ושיבוש של מחסום מכתשי-נימי בתוך שעות לימים, בהתאם למינון LPS3, 6,7.
הפרוטוקול המוצג מתאר נוהל צעד אחר צעד מפורט כדי לגרום לעלי בעכברים על ידי intratracheal לדבר. המודל אומת על ידי הערכת ביטוי ציטוקין, הפלישה נויטרופילים, ו מכתשיים הדליפה בתוך מכתשי כמתואר בעבר8.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1189px;" width="1189">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:653px;">1 ml syringes</td>
			<td style="width:289px;">BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td style="width:104px;">300013</td>
			<td style="width:143px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 ml syringes</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>309110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-CD115 (c-fms) APC</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>17-1152-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-CD11b (M1/70) - FITC</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>11-0112-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-CD45 (30-F11) - eF450</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>48-0451-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-F4/80 (BM-8) - PE Cy7</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>25-4801-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Gr1 (RB6-8C5)</td>
			<td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>552093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>45-5932-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7</td>
			<td>Bio Legend, San Diego, CA</td>
			<td>127623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Buprenorphine hydrochloride</td>
			<td>Indivior UK Limited, Berkshire, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C57BL/6 mice, female, 10 - 12 weeks old</td>
			<td>Charles River, Wilmongton, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td style="width:143px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaliBRITE APC-beads (6&#181;m)</td>
			<td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>340487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:653px;">Canula 23 gauge 1&#39;&#39;</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>300800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:653px;">Canula 26 gauge 1/2&#39;&#39;</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>303800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell strainer 70 &#181;m</td>
			<td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase Type I</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>1148089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deoxyribonuclease II</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>D8764&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS), sterile</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (PBS), without calcium chloride and magnesium chloride, sterile</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS tubes, 5 ml</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>551579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11049-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane</td>
			<td>Baxter, Unterschlei&#223;heim, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O111:B4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>L2630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Green Kit</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>L23101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block&#8482;), Clone 2.4G2</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Red blood cell lysis buffer</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI-1640, with L-glutamine and sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>14060-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium azide (NaN3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue forceps</td>
			<td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11021-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:653px;">Tubes</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>30125150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Venous catheter, 22 gauge</td>
			<td>B.Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>4268091B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine hydrochloride</td>
			<td>Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducing acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation

מינהל דרכי הנשימה של ליפופוליסכד (LPS) היא דרך נפוצה לחקר דלקת ריאות ופגיעה בריאות חריפה (ALI) במודלים של בעלי חיים קטנים. היבטים שונים תוארו, כגון האינהלציה של aerosolized LPS, כמו גם אפי או intrracheal הסטילציה. הפרוטוקול המוצג מתאר נוהל צעד אחר צעד מפורט כדי לגרום לעלי בעכברים על ידי ישיר intratracheal לחות ולבצע ניתוח FACS של דגימות דם, ברונמישיים ששטיפה (BAL) נוזל, ורקמות ריאות. לאחר הרגעה הצפק פנימי, קנה הנשימה נחשף ו-LPS מנוהל באמצעות צנתר הווריד 22 G. תגובה דלקתית חזקה ומיועלת עם הפלישה הלוקוטית, upregulation של ציטוקינים proinflammatory, ושיבוש של מחסום מכתשי-נימים מושרה בתוך שעות לימים, בהתאם למינון LPS בשימוש. איסוף דגימות דם, נוזל בל וקצירת ריאות, כמו גם עיבוד לניתוח FACS, מתוארים בפרוטרוט בפרוטוקול. למרות שהשימוש ב-LPS סטרילי אינו מתאים לחקר התערבויות פרמקולוגית במחלות זיהומיות, הגישה המתוארת מציעה החלטיות מינימלית, טיפול פשוט, ומענה טוב למענה על שאלות אימונולוגיות מכניסטיות. יתר על כן, מינון המינון, כמו גם שימוש אלטרנטיבי LPS ההכנות או זנים העכבר לאפשר אפנון של ההשפעות הקליניות, אשר יכול להציג דרגות שונות של החומרה ALI או מוקדם לעומת התפרצות מאוחרת של תסמיני המחלה.

הגישה המתוארת כדי לגרום ALI בעכברים היה מאומת על ידי הערכת ביטוי cy, הסתננות נויטרופילים, ומחסום מכתשי-נימים הפרעה 24 h ו 72 h לאחר LPS הפרעות. בעלי חיים מוזרקים. שימשו כשליטה ממשלת intratracheal LPS הנגרמת תגובה יציבה הריאות הריאתי. ביטוי של TNF-α ברקמת הריאה היה upregulated באופן משמעותי, הגעה מתמשכת ויותר 50-קיפ...

Watch this Scientific Journal Video about Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation at JoVE.com

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

הציג כאן הוא צעד אחר צעד הליך כדי לגרום לפציעה ריאה חריפה בעכברים על ידי ישירה intratracheal ליפוסכאלפסיד ולבצע ניתוח FACS של דגימות דם, ברונמכתשי נוזל ששטיפה, ורקמות ריאות. מיניציה מינימלית, טיפול פשוט, תוכנות טובה, ו טיטור של חומרת המחלה הם יתרונות של גישה זו.

גרימת פציעה חריפה של הריאה בעכברים על ידי הישירה ליפופוליסכראסטיליאלגרלציה

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

מודלים אמינים של בעלי חיים הם מרכיבים חיוניים במחקר בסיסי. גישת המורין שלנו מאפשרת לענות על שאלות אימונולוגיות על המכיניסטים והקינטיקה של התפתחות פגיעה חריפה בריאות ביונקים. זעיר פולשניות, טיפול פשוט, כמו גם רבייה טובה הם היתרונות העיקריים של טכניקה זו.בנוסף, עם טיטריון מינון, אנחנו יכולים לווסת את האפקט הקליני. טכניקה זו משקפת את המצב הקליני של חולים עם פגיעה חמורה בריאות ומאפשרת לחקור את המנגנונים הבסיסיים. לאחסן lipopolysaccharide, או LPS, ב aliquots בריכוז של חמישה מיליגרם למיליליטר במינוס 20 מעלות צלזיוס.להזרמה תוך-אצ'יאלית, לדלל את LPS מופשר מלוחים פוספט סטריליים לריכוז סופי של 2, 000 מיקרוגרם למיליליטר. חותכים קטטר ור הווריד 22-מד לאורך של 20 מילימטרים. מניחים את העכבר במצב נוטה על שולחן מבוקר טמפרטורה כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של 37 מעלות צלזיוס.בעקבות הרדמה כמתואר בפרוטוקול הטקסט, להחיל חומר סיכה עיניים סטרילי כדי למנוע התפלה של קרניות תחת הרדמה. הרם את חותכי הראש והקרס על פס אופקי ממוקם כחמישה סנטימטרים מעל השולחן בעוד הישבן נשאר בקשר הדוק עם השולחן. להאריך את הצוואר בזווית של 90 מעלות יחסית לשולחן.מניחים מקור אור קר על העור מעל הגרון כדי לעזור לדמיין את מיתרי הקול ולכוון קנה הנשימה. החזק את הלשון עם מעצורים כדי ליישר את הגרון לתנאי צנרור קלים יותר. הדמיה וזיהוי נאותים של הגרון הם קריטיים כדי להבטיח מיקום תוך-רשאלי נכון של הקטטר.מקור אור קר חיצוני מסייע בשלב זה. הכנס את הקטטר כ 10 מילימטרים לתוך קנה הנשימה. ודא כי הכניסה אינה עמוקה מדי, כמו זה יגרום החדרה חד צדדית של נוזל לתוך הסופת הראשית הימנית או השמאלית.אם מתרחשת התנגדות של הגרון, לסגת קטטר כמה מילימטרים לפני התקדמות שוב. עכשיו, להזריק MPBS מדולל LPS באמצעות פיפטה. נפח מוזרק תלוי במשקל גוף העכבר.חבר מזרק והוסף בולוס של 50 מיקרוליטרים של אוויר כדי להבטיח את נפח הנוזל המלא מופץ בריאות. הסר לאט את הקטטר. שמור על פלג הגוף העליון של העכבר במצב זקוף במשך 30 שניות, כדי למנוע דליפה של הנוזל מקנה הנשימה.תקן את העכבר המתת ים עם קלטת על שולחן הניתוחים וזמן קצר לחטא את הפרווה מעל הבטן עם 70% אתנול. פתח את חלל הבטן בזהירות בקו החציוני עם מספריים פינצטה. הסר חלקים של המעי כדי להשיג גישה לוונה קאווה נחות הזכות לעמוד החוליות באבי העורקים הבטן.אתר את ורידים בכליות ולהכניס מכופף, 23-מד cannula מחובר מזרק מיליליטר אחד לתוך וריד קאווה נחות, ישירות מתחת להתכנסות של ורידים. שאפו 250 מיקרוליטרים של דם והעברו לצינור 1.5 מיליליטר מלא ב-20 מיקרוליטרים של תותב EDTA טוחן 0.5. לנער בעדינות כדי להקל על ערבוב EDTA ולשים את הצינור על קרח.עבור lavage ברונכואלוולאר, להכין שלושה מזרקים מיליליטר אחד, כל אחד עם 0.5 מיליליטר של PBS סטרילי ו 0.1 מיליליטר של אוויר. לחטא את הפרווה של הגרון עם 70% אתנול בזהירות לחשוף את קנה הנשימה עם מספריים פינצטה. לגייס את קנה הנשימה ולעטוף תפר סביבו.לנקב את קנה הנשימה באמצעות מיקרו מספריים ולהכניס קטטר ורסי 22-מד, לחתוך לאורך של 20 מילימטרים. לתקן את הקטטר עם תפר ולהחדיר 0.5 מיליליטר של PBS סטרילי ו 0.1 מיליליטר של אוויר. שאף את הנוזל לאחר 60 שניות.חזור על ההליך עם שני מזרקים נוספים ולאסוף את כל שאף בצינור 15 מיליליטר על קרח. בזהירות לפתוח את בית החזה עם מספריים פינצטה כדי לקצור את הריאות. חותכים את הסרעפת לאורך השוליים costal לחתוך דרך הצלעות עם שני חתכים משניים.בזהירות להימנע מנקב את הריאות. הרם את עצם החזה בקרניות ותקן או הסר אותו. הכינו שני מזרקים של 10 מיליליטר עם PBS חם של 37 מעלות.לעשות חתך קטן לחדר השמאלי. לנקב את החדר הימני עם cannula 26-מד. לאחר מכן, לשטוף את זרימת הדם ריאתי עם PBS מחומם מראש.שים לב שהריאות הופכות חיוורות במהלך ההליך. מוציאים את האונה הימנית של הריאות וחותכים אותה לחצאים. הצמד להקפיא אותם חנקן נוזלי ואחריו אחסון לטווח ארוך במינוס 80 מעלות צלזיוס לביטוי גנים נוסף וניתוח חלבון.הסר את כל הריאה השמאלית והומוגניזציה אותו בצלחת 48 היטב על ידי טחון הרקמה עם מספריים פינצטה. דגירה הרקמה בשני מיליליטר של חיץ עיכול ב 37 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות. בצע הומוגניזציה נוספת על ידי צינורות בזהירות חתיכות רקמת הריאה למעלה ולמטה.מעבירים את דגימות הדם לחמישה צינורות FACS מיליליטר ומערבבים בעדינות את הדם עם שני מיליליטר של חיץ תותבת תא דם אדום. שים את הצינורות על קרח ולסיים את התגובה לאחר שתי דקות על ידי הוספת שני מיליליטר של PBS קר כקרח. צנטריפוגה המדגם במשך חמש דקות ב 400 פעמים g ולהשליך את העל טבעי.תן שימוש חוזר לכדור התא עם 60 מיקרוליטרים של מאגר FACS ותהליך הכתמת FACS עוקבת בהתאם לפרוטוקולים שתוארו קודם לכן. נוזל BAL צנטריפוגה במשך חמש דקות ב 400 פעמים g. שאף את העל-טבעי והקפיא אותו בחנקן נוזלי ואחריו אחסון ארוך טווח במינוס 80 מעלות צלזיוס לניתוח חלבון נוסף.לאחר שימוש חוזר גלולת התא BAL עם שני מיליליטר של חיץ FACS קר, להעביר את ההשעיה לתוך צינור FACS חמישה מיליליטר באמצעות מסנן רשת 100 מיקרון כדי לרסן את השערות. לאחר צנטריפוגה המדגם שוב, resuspend את גלולה עם 60 microliters של חיץ FACS ותהליך הכתמת FACS הבאים על פי פרוטוקולים שתוארו קודם לכן. עכשיו, להעביר את רקמת הריאה השמאלית מתעכל לתוך צינור FACS חמישה מיליליטר באמצעות מסנן רשת 100 מיקרון כדי לחלץ גושים.לסיים את תהליך העיכול על ידי הוספת שני מיליליטר של חיץ FACS קר כקרח לפני צנטריפוגה המדגם במשך חמש דקות ב 400 פעמים g. להשליך את supernatant ולתלות מחדש את גלולה עם 60 microliters של מאגר FACS ותהליך עבור כתמים FACS הבאים על פי פרוטוקולים שתוארו קודם לכן. לניתוח FACS, הוסיפו 20 מיקרוליטרים של פתרון חסימת נוגדנים CD16/CD32 ל-60 מיקרוליטר של תאים בצינור של חמישה מיליליטר.דגירה התאים בארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי לחסום כריכה לא ספציפית של אימונוגלובולין לקולטנים Fc. בינתיים, הכינו תמהיל ראשי עם מאגר FACS ונוגדנים, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר החסימה, אין לשטוף את התאים.הוסף 20 מיקרוליטרים של תערובת אב נוגדנים לכל מדגם כדי להשיג נפח סופי של 100 מיקרוליטר. דגירה הדגימות במשך 20 דקות, בחושך, בארבע מעלות צלזיוס. לשטוף כל מדגם עם מיליליטר אחד של חיץ FACS וצנטריפוגה כמו קודם.השלך את העל-טבעי והתן מחדש את גלולת החיץ עם מאגר FACS לריכוז התאים המתאים למדידות FACS. לבסוף, הוסף מספר קבוע של חרוזי כיול מסחריים זמינים בזוגות פלואורוכרום לכל מדגם כדי לקבוע מספרי תאים מוחלטים. בצע ציטומטריית זרימה באמצעות אסטרטגיית gating המוצגת בפרוטוקול הטקסט עבור תאי דם, BAL ורקמות.24, כמו גם 72 שעות לאחר החדרה תוך-אצ'ית, הביטוי של TNF-אלפא ברקמת הריאה היה מוסדר באופן משמעותי, להגיע לעלייה מתמשכת יותר מ 50-פי לעומת חיות הבקרה. פלישת לאוציט לתוך רקמות וחלל מכתביים היא סימן היכר ומאפיין להתפתחות של פגיעה חריפה ריאות. ניתוח FACS חשף חדירה משמעותית של גרנולוציטים נויטרופילים לתוך interstitium הריאות, עם ספירת תאים מוחלטת גדל כמעט פי תשעה לעומת הפקדים לאחר 24 שעות.ספירת גרנולוציטים נויטרופילים מוחלטת ירדה מעט לאחר 72 שעות, עם זאת, עליית הפקטור בהשוואה לפקדים נשארה. בקנה אחד עם חדירת גרנולוציטים נויטרופילים interstitial, ביטוי MMP-9 ברקמת הריאה כולה גדל באופן משמעותי במהלך תקופת התצפית הכוללת. גרנולוציטים נויטרופילים לא רק גדלו ברקמת הריאה, אלא גם בנוזל BAL.עליית הקיפול בהשוואה לבעלי חיים שולטים הייתה בולטת יותר מאשר ברקמת הריאה. בצקת ריאות עקב פגיעה חמורה של מחסום alveolocapillary הוא פתוגנומוני להתפתחות של פגיעה ריאות חריפה. ניתוח של תוכן אלבומן בנוזל BAL על ידי ELISA חשף אובדן משמעותי של תפקוד מחסום ב 24 שעות ו 72 שעות לאחר החדרת LPS.מיקום קטטר נכון הוא חיוני להחדיר דו-צדדית של LPS. לעתים קרובות, שינויים בדפוסי הנשימה, כגון שיעול או התנשפות, מצביעים על ההטבה האינטראצ'ית הנכונה של הנוזל. לאחר אינדוקציה של פגיעה חריפה בריאות, מספר צעדים הבאים, כגון ניתוח FACS, PCR, זיהוי חלבון, עשוי להתבצע כדי לענות על שאלות המחקר המתאימות.

Research

JoVE Journal

Medicine

Pressure Controlled Ventilation to Induce Acute Lung Injury in Mice

לחץ אוורור מבוקר כדי לגרום פגיעה ריאות חריפה על עכברים

Murine models are extensively used to investigate acute injuries of different organs systems (1-34). Acute lung injury (ALI), which occurs with prolonged ...

Ischemia-reperfusion Model of Acute Kidney Injury and Post Injury Fibrosis in Mice

דגם איסכמיה reperfusion של פגיעה חריפה בכליות ופגיעים ההודעה פיברוזיס בעכברים

Ischemia-reperfusion induced acute kidney injury (IR-AKI) is widely used as a model of AKI in mice, but results are often quite variable with high, often ...

Acute Brain Trauma in Mice Followed By Longitudinal Two-photon Imaging

טראומה מוחית חריפה בעכברים אחריו שני פוטונים הדמיה אורכית

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no ...

Minimal Invasive Surgical Procedure of Inducing Myocardial Infarction in Mice

נוהל כירורגי זעיר פולשנית של גרימת אוטם שריר הלב בעכברים

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last ...

Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Intubation-mediated Intratracheal IMIT Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Intratracheal החדרת תיווך אינטובציה (IMIT): מערכת לא פולשני, ריאות ספציפי משלוח

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences ...

Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research

שיטות החדרה וקיבוע שימושיות בחקר סרטן ריאות עכבר

The ability to instill live agents, cells, or chemicals directly into the lung without injuring or killing the mice is an important tool in lung cancer ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

להרחיב הנשמת קיבת חומצה שאיפת Murine הדגם של פגיעה החריפה ריאות תוצאות ב מקסימלי חריפה קטלנית פגיעת ריאות

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...

A Pleural Effusion Model in Rats by Intratracheal Instillation of Polyacrylate/Nanosilica

מודל תפליט פלאורלי בחולדות על ידי החדרה Intratracheal של Polyacrylate/Nanosilica

Pleural effusion is a prevalent clinical finding of many pulmonary diseases. Having a useful animal pleural effusion model is very important to study ...

Inducing Acute Liver Injury in Rats via Carbon Tetrachloride (CCl4) Exposure Through an Orogastric Tube

Inducing Acute Liver Injury in Rats via Carbon Tetrachloride CCl4 Exposure Through an Orogastric Tube

גרימת פגיעה חמורה בכבד חולדות באמצעות פחמן טטרכללוריד (CCl4) חשיפה באמצעות צינורית אורוקיבה

Acute liver injury (ALI) plays a crucial role in the development of hepatic failure, which is characterized by severe liver dysfunction including ...

Intratracheal Instillation of Stem Cells in Term Neonatal Rats

בלתי מתאים של תאי גזע בתוך מונח של חולדות הנוטרסית

Prolonged exposure to high concentrations of oxygen leads to inflammation and acute lung injury, which is similar to human bronchopulmonary dysplasia ...