Name: inducing acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation
Uploaded: 2019-07-06T15:00:00
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著者らは、ヤン・クライナーとスザンヌ・シュルツに技術サポートを提供してくれたことに感謝したいと考えている。著者らは、ボン大学の医学部におけるフローサイトメトリーコア施設の優れたサポートを認めている。著者は外部組織から資金を受け取っていなかった。 結果セクションで示され、図 3に示されているデータの一部は、既に前のパブリケーション8に示されています。

この動物プロトコルは、動物の世話のための地元の委員会(LANUV、レックリングハウゼン、ドイツ、プロトコルNo.84-02.04.2015)によって承認され、生きた動物の使用のための国立衛生研究所のガイドラインに従って行われました(NIH出版物)。No.85-23,1996年改訂)。
1. ALI誘導
<ol><li>約10-12週の年齢で成人C57BL/6マウスを使用してください。水と標準的なげっ歯類チョウへの無料アク...

<ol>
	<li>Fink, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+sepsis.">Animal models of sepsis.</a> Virulence. 5 (1), 143-153 (2014).</li><li>Lu, Y. -. C., Yeh, W. -. C., Ohashi, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS/TLR4+signal+transduction+pathway.">LPS/TLR4 signal transduction pathway.</a> Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).</li><li>Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+acute+lung+injury.">Animal models of acute lung injury.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (3), 379-399 (2008).</li><li>Rabelo, M. A. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+pulmonary+damage+induced+by+lipopolysaccharide+via+intranasal+instillation.">A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation.</a> Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).</li><li>Reutershan, J., Basit, A., Galkina, E. V., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+recruitment+of+neutrophils+into+lung+and+bronchoalveolar+lavage+fluid+in+LPS-induced+acute+lung+injury.">Sequential recruitment of neutrophils into lung and bronchoalveolar lavage fluid in LPS-induced acute lung injury.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 289 (5), 807-815 (2005).</li><li>Hoegl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+multifactorial+nature+of+ARDS+-+approach+to+model+murine+acute+lung+injury.">Capturing the multifactorial nature of ARDS - approach to model murine acute lung injury.</a> Physiological Reports. 6 (6), (2018).</li><li>Weisheit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ly6Clow+and+Not+Ly6Chigh+Macrophages+Accumulate+First+in+the+Heart+in+a+Model+of+Murine+Pressure-Overload.">Ly6Clow and Not Ly6Chigh Macrophages Accumulate First in the Heart in a Model of Murine Pressure-Overload.</a> PLoS ONE. 9 (11), (2014).</li><li>Grommes, J., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+Neutrophils+to+Acute+Lung+Injury.">Contribution of Neutrophils to Acute Lung Injury.</a> Molecular Medicine. 17 (3-4), 293-307 (2011).</li><li>M&#252;ller-Redetzky, H. C., Suttorp, N., Witzenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+pulmonary+endothelial+barrier+function+in+acute+inflammation:+mechanisms+and+therapeutic+perspectives.">Dynamics of pulmonary endothelial barrier function in acute inflammation: mechanisms and therapeutic perspectives.</a> Cell and Tissue Research. 355 (3), 657-673 (2014).</li><li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+apoptosis+in+lipopolysaccharide-induced+lung+injury+in+mice.">Endothelial cell apoptosis in lipopolysaccharide-induced lung injury in mice.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 117 (3), 202-208 (1998).</li><li>Doyen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+induced+by+inhaled+lipopolysaccharide+depends+on+particle+size+in+healthy+volunteers.">Inflammation induced by inhaled lipopolysaccharide depends on particle size in healthy volunteers.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 82 (5), 1371-1381 (2016).</li><li>Stephens, R. S., Johnston, L., Servinsky, L., Kim, B. S., Damarla, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tyrosine+kinase+inhibitor+imatinib+prevents+lung+injury+and+death+after+intravenous+LPS+in+mice.">The tyrosine kinase inhibitor imatinib prevents lung injury and death after intravenous LPS in mice.</a> Physiological Reports. 3 (11), (2015).</li><li>Yu, Y., Jing, L., Zhang, X., Gao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simvastatin+Attenuates+Acute+Lung+Injury+via+Regulating+CDC42-PAK4+and+Endothelial+Microparticles.">Simvastatin Attenuates Acute Lung Injury via Regulating CDC42-PAK4 and Endothelial Microparticles.</a> Shock. 47 (3), 378-384 (2017).</li></ol>

最低の侵襲性、簡単な処理およびよい再現性は小さいげっ歯類モデルのALIを誘発するために提示されたアプローチの主要な特徴である。動物モデルにおける全細菌の代わりにLPSを使用すると、利点があります。それは安定した、純粋な化合物であり、使用するまで凍結乾燥された形態で貯えることができる。これは、TLR4経路を介した自然免疫応答のための強力な刺激剤であり、その生物学的...

基本的な免疫研究には実験動物モデルが欠かせません。全細菌または微生物成分の投与は、局所的または全身的な炎症を誘発する小動物モデルで頻繁に使用されている1.リポ多糖類(LPS、または細菌エンドトキシン)は、グラム陰性菌(例えば、腸内細菌科、シュードモナス属、またはレジオネラ属)の細胞壁成分および表面抗原である。熱安定および大きな分子(分子量1-4 x 106 kDa)は、脂質部分(脂質A)、コア領域(オリゴ糖)、およびO多糖類(またはO抗原)から構成される。脂質Aは、その疎水性脂肪酸鎖で、分子を細菌膜に固定し、LPSの免疫活性および毒性を仲介する(細菌の分解時に)。LPS結合タンパク質(LBP)への結合に続いて、LPS:LBP複合体は、多くの細胞タイプの表面に位置するCD14/TLR4/MD2受容体複合体をリゲートし、NF-κB核転位およびその後のアップレギュレーションとの強い炎症反応を誘発するサイトカイン発現の 2.
急性肺損傷(ALI)は、心不全3の不在における両側肺水腫を伴う急性低酸素呼吸不全として定義される。LPSの気道投与は、肺炎症およびALI4、5、6、7を誘導する一般的な方法である。無菌物質は感染症における薬理学的介入の研究には適していないが、機械的免疫学的な質問は十分な精度で答えられるかもしれない。気管へのLPSの注入は、LPS投与量3に応じて、白血病の侵入、炎症性サイトカインのアップレギュレーション、および数日以内にアルバオロ毛細血管障壁の破壊を伴う強い炎症反応を誘発する、 6,7.
提示されたプロトコルは、気管内LPSインスティレーションによってマウスにALIを誘導するための詳細なステップバイステップ手順を説明する。このモデルは、サイトカイン発現、好中球顆粒球侵襲、および前述の8.aveolarアルブミン漏出を評価することによって検証された。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1189px;" width="1189">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:653px;">1 ml syringes</td>
			<td style="width:289px;">BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td style="width:104px;">300013</td>
			<td style="width:143px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 ml syringes</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>309110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-CD115 (c-fms) APC</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>17-1152-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-CD11b (M1/70) - FITC</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>11-0112-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-CD45 (30-F11) - eF450</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>48-0451-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-F4/80 (BM-8) - PE Cy7</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>25-4801-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Gr1 (RB6-8C5)</td>
			<td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>552093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>45-5932-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7</td>
			<td>Bio Legend, San Diego, CA</td>
			<td>127623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Buprenorphine hydrochloride</td>
			<td>Indivior UK Limited, Berkshire, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C57BL/6 mice, female, 10 - 12 weeks old</td>
			<td>Charles River, Wilmongton, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td style="width:143px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaliBRITE APC-beads (6&#181;m)</td>
			<td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>340487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:653px;">Canula 23 gauge 1&#39;&#39;</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>300800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:653px;">Canula 26 gauge 1/2&#39;&#39;</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>303800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell strainer 70 &#181;m</td>
			<td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase Type I</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>1148089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deoxyribonuclease II</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>D8764&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS), sterile</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (PBS), without calcium chloride and magnesium chloride, sterile</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS tubes, 5 ml</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>551579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11049-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane</td>
			<td>Baxter, Unterschlei&#223;heim, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O111:B4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>L2630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Green Kit</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>L23101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block&#8482;), Clone 2.4G2</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Red blood cell lysis buffer</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI-1640, with L-glutamine and sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>14060-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium azide (NaN3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue forceps</td>
			<td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11021-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:653px;">Tubes</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>30125150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Venous catheter, 22 gauge</td>
			<td>B.Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>4268091B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine hydrochloride</td>
			<td>Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducing acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation

リポ多糖類(LPS)の気道投与は、小動物モデルにおける肺炎症および急性肺損傷(ALI)を研究する一般的な方法である。エアロゾル化LPSの吸入、鼻または気管内刺激など、様々なアプローチが記載されている。提示されたプロトコルは、直接気管内LPS浸透によってマウスにALIを誘導し、血液サンプル、気管支藻胞洗浄(BAL)流体、および肺組織のFACS分析を行う詳細なステップバイステップ手順を説明する。食肉中の静下後、気管が露出し、LPSは22G静脈カテーテルを介して投与される。白血病細胞の侵入、炎症性サイトカインのアップレギュレーション、およびアルベオロ毛細血管バリアの破壊を伴う堅牢で再現可能な炎症反応は、使用されるLPS投与量に応じて、数時間以内に誘発される。血液サンプルの収集、BAL流体、および肺採取、ならびにFACS分析のための処理は、プロトコルで詳細に説明されています。無菌LPSの使用は、感染症における薬理学的介入を研究するのに適していないが、記載されたアプローチは、最小限の侵襲性、簡単な取り扱い、および機械的免疫学的な質問に答えるために良好な再現性を提供する。さらに、用量滴定だけでなく、代替LPS製剤またはマウス株の使用は、ALIの重症度または疾患症状の早期発症の異なる程度を示すことができる臨床効果の変調を可能にする。

マウスにおけるALIを誘導する記載のアプローチは、サイトカイン発現、好中球顆粒球浸潤、および肺静脈毛細血管障害破壊24時間およびLPS浸潤後72時間を評価することによって検証された。PBS注入動物は、コントロールとして役立った。気管内LPS投与は、強い肺炎症反応を誘発した。肺組織におけるTNF-αの発現は有意にアップレギュレートされ、対照動物[RQ(TNF-α/18s);24時間:53.7(SD=11.6)、72 h:55.0(...

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Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

ここでは、直接気管内リポ多糖類の含有によってマウスの急性肺損傷を誘発し、血液サンプル、気管支藻胞洗浄液、および肺組織のFACS分析を行うステップバイステップの手順です。最小限の侵襲性、簡単な処理、良好な再現性、および疾患の重症度の滴定は、このアプローチの利点です。

直接気管内リポ多糖刺激によるマウスの急性肺損傷の誘導

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

信頼性の高い動物モデルは、基礎研究の重要な要素です。私たちのマウスアプローチは、哺乳類における急性肺損傷の発達のメカニズムと運動に関する免疫学的質問に答えることを可能にする。この技術の主な利点は、侵襲性、シンプルなハンドリング、および良好な再現性です。さらに、用量滴定により、臨床効果を調節することができる。この技術は、重度の肺損傷を有する患者の臨床状況を反映し、基礎となるメカニズムを調査することを可能にする。リポ多糖(LPS)を1ミリリットル当たり5ミリグラムの濃度でアリコートにマイナス20度で保存する。気管内の内植え付けの場合は、解凍したLPSを無菌リン酸緩衝生理食塩水で希釈し、1ミリリットル当たり2,000マイクログラムの最終濃度にします。22ゲージの静脈カテーテルを20ミリメートルの長さに切ります。温度調節テーブルの上の起こりやすい位置にマウスを置き、体温を摂氏37度に保ちます。テキストプロトコルに記載されている麻酔に続いて、麻酔下での角膜の乾燥を防ぐために無菌眼用潤滑剤を塗布する。表の約5センチメートル上に位置する水平バーの頭とフック切歯を持ち上げ、前足はテーブルと密接に接触したままにします。テーブルに対して90度の角度で首を超伸ばします。喉頭の上の皮膚に冷たい光源を置き、声帯を視覚化し、気管を目指します。より簡単な挿管状態のために喉をまっすぐにするために鉗子で舌を保持します。喉頭の適切な可視化と同定は、カテーテルの正しい気管内配置を保証するために重要である。外部のコールド 光源は、この手順で役立ちます。約10ミリメートルのカテーテルを気管に入れる。挿入が深すぎないようにして、右または左の主気管支に液体を一方的に引き込む。喉頭の抵抗が生じた場合は、カテーテルを数ミリメートル引き込んでから再び進む。次に、ピペットを使用してLPS希釈MPBSを注入します。注入された容積はマウスの体重によって異なる。注射器を接続し、50マイクロリットルの空気のボーラスを加えて、完全な液体量が肺に分配されるようにします。カテーテルをゆっくり取り外します。気管からの液体の漏出を避けるために、マウスの上半身を30秒間直立した位置に保ちます。手術台の上にテープで安楽死させたマウスを固定し、すぐに70%エタノールで腹部の上に毛皮を消毒します。はさみとピンセットで中央線で慎重に腹腔を開きます。腹部大動脈の椎骨柱に右静脈の右にアクセスを達成するために腸の一部を削除します。腎臓静脈を見つけ、静脈の合流点のすぐ下の静脈の下の静脈の下に、1ミリリットルの注射器に接続された曲がった23ゲージのカニューレを静脈の下に挿入する。250マイクロリットルの血液を吸引し、0.5モルEDTA溶液の20マイクロリットルで満たされた1.5ミリリットルのチューブに移す。EDTAの混合を容易にするために穏やかに振り、氷の上にチューブを置きます。気管支肺胞洗浄の場合は、3つの1ミリリットルの注射器を調製し、それぞれに0.5ミリリットルの無菌PBSと0.1ミリリットルの空気を入れる。70%エタノールで喉の毛皮を消毒し、慎重にはさみとピンセットで気管を露出させます。気管を動員し、その周りに縫合糸を包みます。マイクロハサミを使用して気管を穿刺し、22ゲージの静脈カテーテルを挿入し、20ミリメートルの長さにカットします。縫合糸でカテーテルを固定し、無菌PBSの0.5ミリリットルと空気の0.1ミリリットルを植え付ける。60秒後に流体を吸引する。追加の2つの注射器で手順を繰り返し、氷の上の15ミリリットルのチューブに全体の吸引を収集します。慎重に肺を収穫するためにはさみとピンセットで胸郭を開きます。横隔膜を肋間に沿って切り、2つの横切りで肋骨を切り裂く。慎重に肺を穿刺しないでください。胸骨をクラニに持ち上げ、固定または取り外します。暖かい、摂氏37度のPBSで2つの10ミリリットルの注射器を準備します。左心室に小さな切開を行います。右心室を26ゲージのカニューレで穿刺する。次いで、肺循環を事前に温めたPBSで洗い流します。処置中に肺が青白くなるのに注意してください。肺の右葉を取り出し、半分に切ります。スナップは液体窒素でそれらを凍結し、続いてマイナス80°Cで長期保存して、さらなる遺伝子発現とタンパク質分析を行います。左肺全体を取り除き、はさみとピンセットで組織を細かく刻んで48ウェルプレートで均質化します。37°Cで2ミリリットルの消化バッファーで組織を60分間インキュベートします。肺組織片を上下に慎重にピペット処理することにより、さらなる均質化を行う。血液サンプルを5ミリリットルのFACSチューブに移し、2ミリリットルの赤血球リシスバッファーで血液を穏やかに混合します。氷の上にチューブを置き、氷冷PBSの2ミリリットルを追加することによって2分後に反応を終了します。試料を400倍gで5分間遠心し、上清を捨てる。60マイクロリットルのFACSバッファを有する細胞ペレットを再懸濁し、前述のプロトコルに従って後述のFACS染色処理を行う。遠心BAL液を400回gで5分間用いた。上清を吸引し、液体窒素で凍結し、その後マイナス80°Cで長期保存してさらなるタンパク質分析を行います。2ミリリットルの冷たいFACSバッファーでBAL細胞ペレットを再懸濁した後、100ミクロンのメッシュフィルターを使用して5ミリリットルのFACSチューブにサスペンションを移してヘアを拘束します。再度サンプルを遠心処理した後、60マイクロリットルのFACSバッファを用いてペレットを再懸濁し、前述のプロトコルに従って後述のFACS染色処理を行います。次に、消化した左肺組織を5ミリリットルのFACSチューブに移し、100ミクロンのメッシュフィルターを使用して塊を抽出します。400回gで5分間サンプルを遠心する前に、氷冷FACSバッファーの2ミリリットルを追加することによって消化プロセスを終了します。上清を捨て、上記のプロトコルに従って後のFACS染色のためのFACSバッファおよびプロセスの60マイクロリットルでペレットを再中断します。FACS 分析では、CD16/CD32 抗体ブロッキング溶液を 20 マイクロリットルの 5 ミリリットルチューブの 60 マイクロリットルの細胞に加えます。Fc受容体への免疫グロブリンの非特異的結合をブロックするために、摂氏4度で細胞を15分間インキュベートします。一方、テキストプロトコルに記載されているように、FACSバッファーおよび抗体を用いてマスターミックスを調製する。ブロッキング後、細胞を洗浄しないでください。1サンプルあたり20マイクロリットルの抗体マスターミックスを加えると、100マイクロリットルの最終体積を得られます。サンプルを暗闇の中で摂氏4度で20分間インキュベートします。各サンプルをFACSバッファーと遠心分離機を1ミリリットルで洗浄します。上清を捨て、FACS測定のために適切な細胞濃度にFACSバッファーを使用してペレットを再中断します。最後に、各サンプルに市販のフルオロクロム結合キャリブレーションビーズの固定数を追加して、絶対細胞数を決定します。血液、BAL、および組織細胞のテキストプロトコルに示されている格言戦略を使用してフローサイトメトリーを実行します。24時間と72時間後の気管内点眼点眼は、肺組織におけるTNF-αの発現が著しくアップレギュレートされ、対照動物に比べて持続し、50倍以上の増加に達した。組織および歯槽腔へのロイコサイト浸潤は、急性肺損傷の発症の特徴であり、特徴的である。FACS分析は肺間組球への好中球顆粒球の有意な浸潤を明らかにし、絶対細胞数は24時間後の対照と比較してほぼ9倍に増加した。無数好中球顆粒球数は72時間後にわずかに減少したが、対照と比較して因子の増加は残った。間質性好中球顆粒球浸潤と一致し、肺組織全体におけるMMP-9発現も同様に全観察期間にわたって有意に増加した。好中球顆粒球は肺組織だけでなくBAL液でも増加した。コントロール動物と比較して折り目の増加は、肺組織よりも顕著であった。肺胞毛管バリアの重篤な障害による肺浮腫は、急性肺損傷の発症のための病理性である。ELISAによるBAL液中のアルブミン含量の分析は、LPSの植え付け後24時間および72時間でのバリア機能の有意な損失を明らかにした。LPSの両側の植え付けには、適切なカテーテルの配置が重要です。咳やあえぎなどの呼吸パターンの変化は、しばしば、液体の正しい気管内点眼の点眼を示す。急性肺損傷の誘導後、FACS解析、PCR、タンパク質検出などの多くの後続のステップを、それぞれの研究課題に答えるために行われ得る。

Research

JoVE Journal

Medicine

Pressure Controlled Ventilation to Induce Acute Lung Injury in Mice

マウスにおける急性肺障害を誘発するために圧力制御された換気

Murine models are extensively used to investigate acute injuries of different organs systems (1-34). Acute lung injury (ALI), which occurs with prolonged ...

Ischemia-reperfusion Model of Acute Kidney Injury and Post Injury Fibrosis in Mice

マウスにおける急性腎障害とポスト傷害線維の虚血再灌流モデル

Ischemia-reperfusion induced acute kidney injury (IR-AKI) is widely used as a model of AKI in mice, but results are often quite variable with high, often ...

Acute Brain Trauma in Mice Followed By Longitudinal Two-photon Imaging

縦二光子イメージングに続いてマウスの急性脳外傷

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no ...

Minimal Invasive Surgical Procedure of Inducing Myocardial Infarction in Mice

マウスにおける心筋梗塞を誘発する低侵襲手術手順

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last ...

Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Intubation-mediated Intratracheal IMIT Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

挿管媒介気管内（IMIT）点眼：非侵襲的、肺特異的送達システム

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences ...

Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research

マウス肺癌研究における有用な点滴や固定方法

The ability to instill live agents, cells, or chemicals directly into the lung without injuring or killing the mice is an important tool in lung cancer ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

最大急性非致死肺損傷における急性肺損傷の結果のオープン気管切開胃酸吸引マウスモデル

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...

A Pleural Effusion Model in Rats by Intratracheal Instillation of Polyacrylate/Nanosilica

ポリアクリル酸/ナノシリカの気管内投与によるラットの胸水貯留モデル

Pleural effusion is a prevalent clinical finding of many pulmonary diseases. Having a useful animal pleural effusion model is very important to study ...

Inducing Acute Liver Injury in Rats via Carbon Tetrachloride (CCl4) Exposure Through an Orogastric Tube

Inducing Acute Liver Injury in Rats via Carbon Tetrachloride CCl4 Exposure Through an Orogastric Tube

四塩化炭素(CCl4)を介したラットの急性肝損傷を誘発する(CCl4)オロ胃管による暴露

Acute liver injury (ALI) plays a crucial role in the development of hepatic failure, which is characterized by severe liver dysfunction including ...

Intratracheal Instillation of Stem Cells in Term Neonatal Rats

期産期新生児ラットにおける幹細胞の気管内植在

Prolonged exposure to high concentrations of oxygen leads to inflammation and acute lung injury, which is similar to human bronchopulmonary dysplasia ...