Name: inducing acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation
Uploaded: 2019-07-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke Jan Kleiner og Susanne Schulz for å gi teknisk støtte. Forfatterne erkjenner utmerket støtte av flyten flowcytometri kjernen anlegget ved medisinsk fakultet Bonn University. Forfatterne fikk ingen støtte fra noen ekstern organisasjon.  Deler av dataene i resultat seksjonen og avbildet i Figur 3 er allerede vist i en tidligere publikasjon8.

Dette dyret protokollen ble godkjent av den lokale komiteen for dyr omsorg (LANUV, Recklinghausen, Tyskland; protokoll nr. 84-02.04.2015) og ble utført i samsvar med National Institutes of Health retningslinjer for bruk av levende dyr (NIH publikasjon Nr. 85-23, revidert 1996).
1. ALI induksjon
<ol><li>Bruk voksen C57BL/6 mus i alderen av ca 10-12 uker. Huset dyrene i individuelt ventilert bur med fri tilgang til vann og standard gnager Chow. Det er imidlertid mulig å utføre denne tilnær...

<ol>
	<li>Fink, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+sepsis.">Animal models of sepsis.</a> Virulence. 5 (1), 143-153 (2014).</li><li>Lu, Y. -. C., Yeh, W. -. C., Ohashi, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS/TLR4+signal+transduction+pathway.">LPS/TLR4 signal transduction pathway.</a> Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).</li><li>Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+acute+lung+injury.">Animal models of acute lung injury.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (3), 379-399 (2008).</li><li>Rabelo, M. A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Lung+Injury+in+Response+to+Intratracheal+Instillation+of+Lipopolysaccharide+in+an+Animal+Model+of+Emphysema+Induced+by+Elastase.">Acute Lung Injury in Response to Intratracheal Instillation of Lipopolysaccharide in an Animal Model of Emphysema Induced by Elastase.</a> Inflammation. 41 (1), 174-182 (2018).</li><li>Liu, F., Li, W., Pauluhn, J., Tr&#252;bel, H., Wang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-induced+acute+lung+injury+in+rats:+comparative+assessment+of+intratracheal+instillation+and+aerosol+inhalation.">Lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats: comparative assessment of intratracheal instillation and aerosol inhalation.</a> Toxicology. 304, 158-166 (2013).</li><li>Rittirsch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Lung+Injury+Induced+by+Lipopolysaccharide+Is+Independent+of+Complement+Activation.">Acute Lung Injury Induced by Lipopolysaccharide Is Independent of Complement Activation.</a> Journal of Immunology. 180 (11), 7664-7672 (2008).</li><li>D'Alessio, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+CD25+Foxp3++Tregs+resolve+experimental+lung+injury+in+mice+and+are+present+in+humans+with+acute+lung+injury.">CD4+CD25+Foxp3+ Tregs resolve experimental lung injury in mice and are present in humans with acute lung injury.</a> The Journal of Clinical Investigation. 119 (10), 2898-2913 (2009).</li><li>Ehrentraut, H., Weisheit, C., Scheck, M., Frede, S., Hilbert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+murine+acute+lung+injury+induces+increase+of+pulmonary+TIE2-expressing+macrophages.">Experimental murine acute lung injury induces increase of pulmonary TIE2-expressing macrophages.</a> Journal of Inflammation. 15, 12 (2018).</li><li>Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+pulmonary+damage+induced+by+lipopolysaccharide+via+intranasal+instillation.">A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation.</a> Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).</li><li>Reutershan, J., Basit, A., Galkina, E. V., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+recruitment+of+neutrophils+into+lung+and+bronchoalveolar+lavage+fluid+in+LPS-induced+acute+lung+injury.">Sequential recruitment of neutrophils into lung and bronchoalveolar lavage fluid in LPS-induced acute lung injury.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 289 (5), 807-815 (2005).</li><li>Hoegl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+multifactorial+nature+of+ARDS+-+approach+to+model+murine+acute+lung+injury.">Capturing the multifactorial nature of ARDS - approach to model murine acute lung injury.</a> Physiological Reports. 6 (6), (2018).</li><li>Weisheit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ly6Clow+and+Not+Ly6Chigh+Macrophages+Accumulate+First+in+the+Heart+in+a+Model+of+Murine+Pressure-Overload.">Ly6Clow and Not Ly6Chigh Macrophages Accumulate First in the Heart in a Model of Murine Pressure-Overload.</a> PLoS ONE. 9 (11), (2014).</li><li>Grommes, J., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+Neutrophils+to+Acute+Lung+Injury.">Contribution of Neutrophils to Acute Lung Injury.</a> Molecular Medicine. 17 (3-4), 293-307 (2011).</li><li>M&#252;ller-Redetzky, H. C., Suttorp, N., Witzenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+pulmonary+endothelial+barrier+function+in+acute+inflammation:+mechanisms+and+therapeutic+perspectives.">Dynamics of pulmonary endothelial barrier function in acute inflammation: mechanisms and therapeutic perspectives.</a> Cell and Tissue Research. 355 (3), 657-673 (2014).</li><li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+apoptosis+in+lipopolysaccharide-induced+lung+injury+in+mice.">Endothelial cell apoptosis in lipopolysaccharide-induced lung injury in mice.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 117 (3), 202-208 (1998).</li><li>Doyen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+induced+by+inhaled+lipopolysaccharide+depends+on+particle+size+in+healthy+volunteers.">Inflammation induced by inhaled lipopolysaccharide depends on particle size in healthy volunteers.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 82 (5), 1371-1381 (2016).</li><li>Stephens, R. S., Johnston, L., Servinsky, L., Kim, B. S., Damarla, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tyrosine+kinase+inhibitor+imatinib+prevents+lung+injury+and+death+after+intravenous+LPS+in+mice.">The tyrosine kinase inhibitor imatinib prevents lung injury and death after intravenous LPS in mice.</a> Physiological Reports. 3 (11), (2015).</li><li>Yu, Y., Jing, L., Zhang, X., Gao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simvastatin+Attenuates+Acute+Lung+Injury+via+Regulating+CDC42-PAK4+and+Endothelial+Microparticles.">Simvastatin Attenuates Acute Lung Injury via Regulating CDC42-PAK4 and Endothelial Microparticles.</a> Shock. 47 (3), 378-384 (2017).</li></ol>

Minimal invasiveness, enkel håndtering, og god reproduserbarhet er viktige funksjoner i den presenterte tilnærmingen for å indusere ALI i en liten gnager modell. Bruk av LPS i stedet for hele bakterier i dyremodeller har fordeler. Det er en stabil og ren sammensatte og kan lagres i lyofilisert form til bruk. Det er en potent stimulerende for medfødte immunresponser via TLR4 veien, og dens biologiske aktivitet kan lett bli kvantifisert, tilrettelegge for titrering av sykdom alvorlighetsgrad med god reproduserbarhet. V...

Eksperimentelle dyremodeller er uunnværlig i grunnleggende immun forskning. Administrasjon av hele bakterier eller mikrobielle komponenter har blitt hyppig brukt i små dyremodeller for å indusere lokal eller systemisk betennelse1. Lipopolysakkarid (LPS, eller bakteriell endotoksin) er en cellevegg komponent og overflateantigen av gram-negative bakterier (f. eks, Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., eller Legionella spp.). Det thermostable og store molekylet (molekylvekt 1-4 x 106 KDA) består av en lipid moiety (lipid a), kjerne region (Oligosaccharide), og en o polysakkarid (eller O antigen). Lipid A, med sine hydrofobe fettsyrer kjeder, forankrer molekylet til en bakteriell membran og formidler (ved nedbrytning av bakterier) den immunologiske aktivitet og toksisitet av LPS. Etter binding til LPS bindende protein (LBP), LPS: LBP komplekser ombinde CD14/TLR4/MD2 reseptoren komplekset ligger på overflaten av mange celletyper, inducing en sterk proinflammatoriske reaksjon med NF-KB kjernefysiske translokasjon og påfølgende oppregulering av cytokin uttrykk2.
Akutt lungeskade (ALI) er definert som akutt hypoksemirespirasjonssvikt respirasjonssvikt med bilateral lungeødem i fravær av hjertesvikt3. Luftveis administrering av LPS er en vanlig måte å indusere lungebetennelse og Ali4,5,6,7. Selv om det sterile stoffet ikke er egnet til å studere Pharmacologic intervensjoner i smittsomme sykdommer, kan mekanistisk immunologiske spørsmål besvares med tilstrekkelig presisjon. Drypping av LPS inn i luftrøret induserer en robust inflammatorisk reaksjon med leukocytter invasjon, oppregulering av proinflammatoriske cytokiner, og forstyrrelse av alveolo-kapillær barriere i løpet av timer til dager, avhengig av LPS dosering3, 6,7.
Den presenterte protokollen beskriver en detaljert trinn-for-trinn prosedyre for å indusere ALI i mus ved intratrakeal LPS drypping. Modellen har blitt validert ved å vurdere cytokin uttrykk, nøytrofile granulocytt invasjon, og intra-alveolære albumin lekkasje som tidligere beskrevet8.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1189px;" width="1189">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:653px;">1 ml syringes</td>
			<td style="width:289px;">BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td style="width:104px;">300013</td>
			<td style="width:143px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 ml syringes</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>309110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-CD115 (c-fms) APC</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>17-1152-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-CD11b (M1/70) - FITC</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>11-0112-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-CD45 (30-F11) - eF450</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>48-0451-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-F4/80 (BM-8) - PE Cy7</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>25-4801-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Gr1 (RB6-8C5)</td>
			<td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>552093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>45-5932-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7</td>
			<td>Bio Legend, San Diego, CA</td>
			<td>127623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Buprenorphine hydrochloride</td>
			<td>Indivior UK Limited, Berkshire, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C57BL/6 mice, female, 10 - 12 weeks old</td>
			<td>Charles River, Wilmongton, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td style="width:143px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaliBRITE APC-beads (6&#181;m)</td>
			<td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>340487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:653px;">Canula 23 gauge 1&#39;&#39;</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>300800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:653px;">Canula 26 gauge 1/2&#39;&#39;</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>303800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell strainer 70 &#181;m</td>
			<td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase Type I</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>1148089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deoxyribonuclease II</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>D8764&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS), sterile</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (PBS), without calcium chloride and magnesium chloride, sterile</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS tubes, 5 ml</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>551579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11049-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane</td>
			<td>Baxter, Unterschlei&#223;heim, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O111:B4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>L2630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Green Kit</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>L23101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block&#8482;), Clone 2.4G2</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Red blood cell lysis buffer</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI-1640, with L-glutamine and sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>14060-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium azide (NaN3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue forceps</td>
			<td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11021-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:653px;">Tubes</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>30125150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Venous catheter, 22 gauge</td>
			<td>B.Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>4268091B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine hydrochloride</td>
			<td>Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducing acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation

Luftveis administrering av lipopolysakkarid (LPS) er en vanlig måte å studere lungebetennelse og akutt lungeskade (ALI) i små dyremodeller. Ulike tilnærminger har blitt beskrevet, slik som inhalasjon av aerosolized LPS samt nasal eller intratrakeal drypping. Den presenterte protokollen beskriver en detaljert trinn-for-trinn prosedyre for å indusere ALI i mus ved direkte intratrakeal LPS drypping og utføre FACS analyse av blodprøver, lunges tømming (BAL) væske, og lunge vev. Etter intraperitoneal sedasjon, luftrøret er eksponert og LPS administreres via en 22 G venøs kateter. En robust og reproduserbar inflammatorisk reaksjon med leukocytter invasjon, oppregulering av proinflammatoriske cytokiner, og forstyrrelse av alveolo-kapillær barriere er indusert i løpet av timer til dager, avhengig av LPS dosering brukt. Innsamling av blodprøver, BAL-væske, og lunge høsting, samt behandling for FACS analyse, er beskrevet i detalj i protokollen. Selv om bruken av den sterile LPS-en ikke er egnet til å studere Pharmacologic intervensjoner i smittsomme sykdommer, tilbyr den beskrevne tilnærmingen minimalt invasiveness, enkel håndtering og god reproduserbarhet for å besvare mekanistisk immunologiske spørsmål. Videre, dosetitrering samt bruk av alternative LPS preparater eller mus stammer tillate modulering av de kliniske effektene, som kan vise ulike grader av ALI alvorlighetsgrad eller tidlig g. sen utbruddet av sykdomssymptomer.

Den beskrevne tilnærmingen til å indusere ALI i mus ble validert ved å vurdere cytokin uttrykk, nøytrofile granulocytt infiltrasjon, og alveolo-kapillær barriere avbrudd 24 h og 72 h etter LPS drypping. PBS-injisert dyr fungerte som kontroll. Intratrakeal LPS administrasjon indusert en robust lunge proinflammatoriske respons. Uttrykk for TNF-α i lungevevet var signifikant upregulated, nådde en varig og mer enn 50-fold økning sammenlignet med kontroll dyrene [RQ (TNF-α/18s); 24 h: 53,7 (SD = 11,6); 72 h: 55,0 (SD...

Watch this Scientific Journal Video about Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation at JoVE.com

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

Her presenteres en trinnvis fremgangsmåte for å indusere akutt lungeskade hos mus ved direkte intratrakeal lipopolysakkarid drypping og for å utføre FACS analyse av blodprøver, lunges tømming og lunge vev. Minimal invasiveness, enkel håndtering, god reproduserbarhet og titrering av alvorlighetsgraden av sykdommen er fordelene med denne tilnærmingen.

Inducing akutt lungeskade i mus ved direkte Intratrakeal lipopolysakkarid drypping

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

Pålitelige dyremodeller er viktige komponenter i grunnleggende forskning. Vår murine tilnærming gjør det mulig å svare på immunologiske spørsmål om mekanistiske og kinetikk av akutt lungeskadeutvikling hos pattedyr. Minimal invasivitet, enkel håndtering, samt god reproduserbarhet er de viktigste fordelene med denne teknikken.I tillegg, med dosetitrering, kan vi modulere den kliniske effekten. Denne teknikken speiler den kliniske situasjonen til pasienter med alvorlig lungeskade og gjør det mulig å undersøke de underliggende mekanismene. Oppbevar lipopolysakkarid, eller LPS, i aliquots med en konsentrasjon på fem milligram per milliliter ved minus 20 grader Celsius.For intratrakeal instillasjon fortynnes de tinte LPS-ene i steril fosfatbufret saltvann til en endelig konsentrasjon på 2000 mikrogram per milliliter. Klipp et 22-gauge venekateter til en lengde på 20 millimeter. Plasser musen i utsatt posisjon på et temperaturkontrollert bord for å opprettholde en kroppstemperatur på 37 grader Celsius.Etter anestesi som beskrevet i tekstprotokollen, bruk sterilt oftalmisk smøremiddel for å forhindre utskalking av hornhinnen under anestesi. Løft hodet og kroksnålene på en horisontal stang plassert omtrent fem centimeter over bordet mens forsagene forblir i nær kontakt med bordet. Super-utvide nakken i en 90 graders vinkel i forhold til bordet.Plasser en kald lyskilde på huden over strupehodet for å visualisere stemmebåndene og sikte på luftrøret. Hold tungen med tang for å rette halsen for lettere intubasjonsforhold. Riktig visualisering og identifisering av strupehodet er avgjørende for å sikre riktig intratrakeal plassering av kateteret.En ekstern kald lyskilde hjelper i dette trinnet. Sett kateteret ca. 10 millimeter inn i luftrøret. Sørg for at innsettingen ikke er for dyp, da dette vil resultere i ensidig drypping av væske inn i høyre eller venstre hovedbronchus.Hvis motstanden i strupehodet oppstår, trekk kateteret tilbake noen få millimeter før du går videre igjen. Nå injiserer du de LPS-fortynnede MPBS ved hjelp av en pipette. Det injiserte volumet avhenger av musens kroppsvekt.Koble til en sprøyte og tilsett en bolus på 50 mikroliter luft for å sikre at hele væskevolumet fordeles i lungene. Fjern kateteret langsomt. Hold musens overkropp i oppreist stilling i 30 sekunder for å unngå lekkasje av væsken fra luftrøret.Fest den eutaniserte musen med tape på et operasjonsbord og desinfiserer snart pelsen over magen med 70% etanol. Åpne bukhulen nøye i medianlinjen med saks og pinsett. Fjern deler av tarmen for å oppnå tilgang til vena cava dårligere rett til vertebralkolonnen i abdominal aorta.Finn nyreårene og sett inn en bøyd, 23-gauge kanyle koblet til en en milliliter sprøyte i vena cava inferior, rett under samløpet av venene. Aspirer 250 mikroliter blod og overfør til et 1,5 milliliter rør fylt med 20 mikroliter 0,5 molar EDTA-oppløsning. Rist forsiktig for å lette EDTA-blandingen og legg røret på is.For bronkoalveolærskylling, klargjør tre en milliliter sprøyter, hver med 0,5 milliliter steril PBS og 0,1 milliliter luft. Desinfiser pelsen i halsen med 70% etanol og utsett forsiktig luftrøret med saks og pinsett. Mobiliser luftrøret og vikle en sutur rundt den.Punkter luftrøret ved hjelp av mikrosaks og sett inn et 22-gauge venøs kateter, kuttet til en lengde på 20 millimeter. Fest kateteret med en sutur og innpod 0,5 milliliter steril PBS og 0,1 milliliter luft. Aspirer væsken etter 60 sekunder.Gjenta prosedyren med de to ekstra sprøytene og samle hele aspiraten i et 15 milliliter rør på is. Åpne forsiktig thoraxen med saks og pinsett for å høste lungene. Skjær membranen langs kostnadsmarginen og skjær gjennom ribbeina med to laterale snitt.Unngå å punktere lungene forsiktig. Løft brystbenet kranielt og fest eller fjern den. Forbered to 10 ml sprøyter med varme, 37 grader Celsius PBS.Lag et lite snitt i venstre ventrikkel. Punkter høyre ventrikkel med en 26-gauge kanyle. Skyll deretter lungesirkulasjonen med en forhåndsoppvarmet PBS.Vær oppmerksom på lungene som blir bleke under prosedyren. Fjern høyre flik av lungene og kutt den i halvdeler. Snap fryse dem i flytende nitrogen etterfulgt av langsiktig lagring på minus 80 grader Celsius for ytterligere genuttrykk og proteinanalyse.Fjern hele venstre lunge og homogenisere den i en 48-brønns plate ved å hakke vevet med saks og pinsett. Inkuber vevet i to milliliter fordøyelsesbuffer ved 37 grader Celsius i 60 minutter. Utfør ytterligere homogenisering ved å nøye pipettering lungevevsbitene opp og ned.Overfør blodprøvene til fem milliliter FACS-rør og bland forsiktig blodet med to milliliter rødblodcellelysbuffer. Sett rørene på is og avslutt reaksjonen etter to minutter ved å legge til to milliliter iskald PBS. Sentrifuger prøven i fem minutter ved 400 ganger g og kast supernatanten.Gjenoppussette cellepellet med 60 mikroliter FACS buffer og prosess for påfølgende FACS farging i henhold til tidligere beskrevne protokoller. Sentrifuge BAL væske i fem minutter ved 400 ganger g. Aspirer det overnaturante og frys det i flytende nitrogen etterfulgt av langsiktig lagring ved minus 80 grader Celsius for videre proteinanalyse.Etter resususpending bal celle pellet med to milliliter kald FACS buffer, overføre suspensjonen til en fem milliliter FACS rør ved hjelp av en 100 mikron mesh filter for å begrense hår. Etter å ha sentrifugert prøven igjen, gjenbruke pellet med 60 mikroliter FACS buffer og prosess for påfølgende FACS farging i henhold til tidligere beskrevne protokoller. Nå overfører du det fordøyde venstre lungevevet til et fem milliliter FACS-rør ved hjelp av et 100 mikron mesh-filter for å trekke ut klumper.Avslutt fordøyelsesprosessen ved å legge til to milliliter iskald FACS-buffer før du sentrifuger prøven i fem minutter ved 400 ganger g. Kast den overnaturlige og gjenoppuss pelleten med 60 mikroliter FACS-buffer og prosess for etterfølgende FACS-farging i henhold til tidligere beskrevne protokoller. For en FACS-analyse, legg til 20 mikroliter CD16/CD32 antistoffblokkeringsløsning til 60 mikroliter celler i et fem milliliter rør.Inkuber cellene ved fire grader Celsius i 15 minutter for å blokkere uspesifikk binding av immunoglobulin til Fc reseptorer. I mellomtiden kan du forberede en hovedblanding med FACS-buffer og antistoffer, som beskrevet i tekstprotokollen. Etter blokkering, ikke vask cellene.Tilsett 20 mikroliter antistoffmalblanding per prøve for å få et endelig volum på 100 mikroliter. Inkuber prøvene i 20 minutter, i mørket, ved fire grader Celsius. Vask hver prøve med en milliliter FACS buffer og sentrifuge som før.Kast den overnaturlige og resuspend pellet med FACS buffer til riktig cellekonsentrasjon for FACS målinger. Til slutt legger du til faste antall kommersielt tilgjengelige fluorokrom-koblet kalibreringsperler til hver prøve for å bestemme absolutte cellenumre. Utfør strømningscytometri ved hjelp av gating strategien vist i tekstprotokollen for blod, BAL, og vevceller.24 samt 72 timer etter intratrakeal instillasjon, uttrykk for TNF-alfa i lungevev var betydelig oppregulert, nå en vedvarende og mer enn 50 ganger økning sammenlignet med kontroll dyrene. Leucocyte invasjon i vev og alveolær plass er et kjennetegn og karakteristisk for utviklingen av akutt lungeskade. FACS-analyse viste en signifikant infiltrasjon av nøytrofile granulocytter i lungeinterstitiumet, med absolutt celletall som har økt nesten ni ganger sammenlignet med kontrollene etter 24 timer.Absolutt nøytrofil granulocytt teller noe redusert etter 72 timer, men faktorøkningen sammenlignet med kontrollene forble. I samsvar med interstitiell nøytrofil granulocyttinfiltrasjon ble MMP-9-uttrykket i hele lungevevet også betydelig økt i løpet av den totale observasjonsperioden. Nøytrofile granulocytter ble ikke bare økt i lungevevet, men også i BAL-væsken.Økningen i folden sammenlignet med kontrolldyr var mer uttalt enn i lungevevet. Lungeødem på grunn av alvorlig svekkelse av alveolokapillærbarrieren er patognomonic for utvikling av akutt lungeskade. Analyse av albumeninnhold i BAL væske av ELISA viste et betydelig tap av barrierefunksjon ved 24 timer og 72 timer etter LPS-drypping.Riktig kateterplassering er avgjørende for bilateral drypping av LPS. Ofte indikerer endringer i respiratoriske mønstre, som hoste eller gisper, riktig intratrakeal instillasjon av væsken. Etter induksjon av akutt lungeskade kan en rekke påfølgende trinn, som FACS-analyse, PCR, en proteindeteksjon, utføres for å svare på de respektive forskningsspørsmålene.

Research

JoVE Journal

Medicine

Pressure Controlled Ventilation to Induce Acute Lung Injury in Mice

Murine models are extensively used to investigate acute injuries of different organs systems (1-34). Acute lung injury (ALI), which occurs with prolonged ...

Ischemia-reperfusion Model of Acute Kidney Injury and Post Injury Fibrosis in Mice

Iskemi-reperfusjon Modell av akutt nyreskade og Post Injury fibrose i Mus

Ischemia-reperfusion induced acute kidney injury (IR-AKI) is widely used as a model of AKI in mice, but results are often quite variable with high, often ...

Acute Brain Trauma in Mice Followed By Longitudinal Two-photon Imaging

Akutt Brain Trauma i Mus fulgt av Langsgående To-foton Imaging

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no ...

Minimal Invasive Surgical Procedure of Inducing Myocardial Infarction in Mice

Minimal Invasive Kirurgisk prosedyre for å indusere hjerteinfarkt i Mus

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last ...

Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Intubation-mediated Intratracheal IMIT Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Intubasjon-mediert intratrakeal (IMIT) Instillasjon: En Noninvasiv, Lung-spesifikke Delivery System

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences ...

Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research

Drypping og fiksering Nyttig i Mouse Lung Cancer Research

The ability to instill live agents, cells, or chemicals directly into the lung without injuring or killing the mice is an important tool in lung cancer ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

Åpne trakeostomi magesyre aspire Murine modell av akutt lungeskade Resultater i Maximal Akutt-dødelige lungeskade

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...

A Pleural Effusion Model in Rats by Intratracheal Instillation of Polyacrylate/Nanosilica

En Pleural effusjon modell i rotter ved Intratracheal instillasjon av Polyacrylate/Nanosilica

Pleural effusion is a prevalent clinical finding of many pulmonary diseases. Having a useful animal pleural effusion model is very important to study ...

Inducing Acute Liver Injury in Rats via Carbon Tetrachloride (CCl4) Exposure Through an Orogastric Tube

Inducing Acute Liver Injury in Rats via Carbon Tetrachloride CCl4 Exposure Through an Orogastric Tube

Indusere akutt leverskade hos rotter via karbon tetrachloride (CCl4) Eksponering gjennom et orogastrisk rør

Acute liver injury (ALI) plays a crucial role in the development of hepatic failure, which is characterized by severe liver dysfunction including ...

Intratracheal Instillation of Stem Cells in Term Neonatal Rats

Intratrakeal instillasjon av stamceller i term neonatal rotter

Prolonged exposure to high concentrations of oxygen leads to inflammation and acute lung injury, which is similar to human bronchopulmonary dysplasia ...