Name: inducing acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation
Uploaded: 2019-07-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить Яна Кляйнера и Сюзанну Шульц за техническую поддержку. Авторы признают отличную поддержку потока цитометрии основной объект на медицинском факультете Боннского университета. Авторы не получали финансирования от какой-либо внешней организации.  Часть данных, приведенных в разделе результатов и изображенных на рисунке 3, уже была показана в предыдущей публикации8.

Этот протокол о животных был одобрен местным комитетом по уходу за животными (LANUV, Recklinghausen, Германия; протокол No 84-02.04.2015) и выполнен в соответствии с руководящими принципами Национальных институтов здравоохранения по использованию живых животных (публикация NIH No 85-23, пересмотренный 1996 г?...

<ol>
	<li>Fink, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+sepsis.">Animal models of sepsis.</a> Virulence. 5 (1), 143-153 (2014).</li><li>Lu, Y. -. C., Yeh, W. -. C., Ohashi, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS/TLR4+signal+transduction+pathway.">LPS/TLR4 signal transduction pathway.</a> Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).</li><li>Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+acute+lung+injury.">Animal models of acute lung injury.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (3), 379-399 (2008).</li><li>Rabelo, M. A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Lung+Injury+in+Response+to+Intratracheal+Instillation+of+Lipopolysaccharide+in+an+Animal+Model+of+Emphysema+Induced+by+Elastase.">Acute Lung Injury in Response to Intratracheal Instillation of Lipopolysaccharide in an Animal Model of Emphysema Induced by Elastase.</a> Inflammation. 41 (1), 174-182 (2018).</li><li>Liu, F., Li, W., Pauluhn, J., Tr&#252;bel, H., Wang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-induced+acute+lung+injury+in+rats:+comparative+assessment+of+intratracheal+instillation+and+aerosol+inhalation.">Lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats: comparative assessment of intratracheal instillation and aerosol inhalation.</a> Toxicology. 304, 158-166 (2013).</li><li>Rittirsch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Lung+Injury+Induced+by+Lipopolysaccharide+Is+Independent+of+Complement+Activation.">Acute Lung Injury Induced by Lipopolysaccharide Is Independent of Complement Activation.</a> Journal of Immunology. 180 (11), 7664-7672 (2008).</li><li>D'Alessio, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+CD25+Foxp3++Tregs+resolve+experimental+lung+injury+in+mice+and+are+present+in+humans+with+acute+lung+injury.">CD4+CD25+Foxp3+ Tregs resolve experimental lung injury in mice and are present in humans with acute lung injury.</a> The Journal of Clinical Investigation. 119 (10), 2898-2913 (2009).</li><li>Ehrentraut, H., Weisheit, C., Scheck, M., Frede, S., Hilbert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+murine+acute+lung+injury+induces+increase+of+pulmonary+TIE2-expressing+macrophages.">Experimental murine acute lung injury induces increase of pulmonary TIE2-expressing macrophages.</a> Journal of Inflammation. 15, 12 (2018).</li><li>Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+pulmonary+damage+induced+by+lipopolysaccharide+via+intranasal+instillation.">A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation.</a> Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).</li><li>Reutershan, J., Basit, A., Galkina, E. V., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+recruitment+of+neutrophils+into+lung+and+bronchoalveolar+lavage+fluid+in+LPS-induced+acute+lung+injury.">Sequential recruitment of neutrophils into lung and bronchoalveolar lavage fluid in LPS-induced acute lung injury.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 289 (5), 807-815 (2005).</li><li>Hoegl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+multifactorial+nature+of+ARDS+-+approach+to+model+murine+acute+lung+injury.">Capturing the multifactorial nature of ARDS - approach to model murine acute lung injury.</a> Physiological Reports. 6 (6), (2018).</li><li>Weisheit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ly6Clow+and+Not+Ly6Chigh+Macrophages+Accumulate+First+in+the+Heart+in+a+Model+of+Murine+Pressure-Overload.">Ly6Clow and Not Ly6Chigh Macrophages Accumulate First in the Heart in a Model of Murine Pressure-Overload.</a> PLoS ONE. 9 (11), (2014).</li><li>Grommes, J., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+Neutrophils+to+Acute+Lung+Injury.">Contribution of Neutrophils to Acute Lung Injury.</a> Molecular Medicine. 17 (3-4), 293-307 (2011).</li><li>M&#252;ller-Redetzky, H. C., Suttorp, N., Witzenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+pulmonary+endothelial+barrier+function+in+acute+inflammation:+mechanisms+and+therapeutic+perspectives.">Dynamics of pulmonary endothelial barrier function in acute inflammation: mechanisms and therapeutic perspectives.</a> Cell and Tissue Research. 355 (3), 657-673 (2014).</li><li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+apoptosis+in+lipopolysaccharide-induced+lung+injury+in+mice.">Endothelial cell apoptosis in lipopolysaccharide-induced lung injury in mice.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 117 (3), 202-208 (1998).</li><li>Doyen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+induced+by+inhaled+lipopolysaccharide+depends+on+particle+size+in+healthy+volunteers.">Inflammation induced by inhaled lipopolysaccharide depends on particle size in healthy volunteers.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 82 (5), 1371-1381 (2016).</li><li>Stephens, R. S., Johnston, L., Servinsky, L., Kim, B. S., Damarla, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tyrosine+kinase+inhibitor+imatinib+prevents+lung+injury+and+death+after+intravenous+LPS+in+mice.">The tyrosine kinase inhibitor imatinib prevents lung injury and death after intravenous LPS in mice.</a> Physiological Reports. 3 (11), (2015).</li><li>Yu, Y., Jing, L., Zhang, X., Gao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simvastatin+Attenuates+Acute+Lung+Injury+via+Regulating+CDC42-PAK4+and+Endothelial+Microparticles.">Simvastatin Attenuates Acute Lung Injury via Regulating CDC42-PAK4 and Endothelial Microparticles.</a> Shock. 47 (3), 378-384 (2017).</li></ol>

Минимальная инвазивность, простая обработка и хорошая воспроизводимость являются ключевыми особенностями представленного подхода, чтобы побудить ALI в небольшой модели грызунов. Использование LPS вместо целых бактерий в животных моделях имеет свои преимущества. Это стабильное и чисто?...

Экспериментальные модели животных незаменимы в фундаментальных иммунных исследованиях. Администрация целых бактерий или микробных компонентов часто используется в небольшихмоделях животных, чтобы вызвать местное или системное воспаление 1. Липополисахарид (LPS, или бактериальный эндотоксин) является компонентом стенки клетки и поверхностным антигеном грамотрицательных бактерий (например, Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., или Legionella spp.). Термостабильная и большая молекула (молекулярный вес 1-4 х 106 кДА) состоит из липидного муати (Липид A), основной области (олигосахарид) и ополисахарида (или O антигена). Липид А, с его гидрофобными цепями жирных кислот, закрепляет молекулу в бактериальной мембране и опосредует (после деградации бактерий) иммунологическую активность и токсичность ЛПС. После связывания с связывающим белком LPS (LBP), комплексы LPS:LBP сводят сягирование рецепторного комплекса CD14/TLR4/MD2, расположенного на поверхности многих типов клеток, вызывая сильную провоспалительную реакцию с ядерной транслокацией NF-QB и последующее регулирование цитокинов выражение2.
Острая травма легких (АЛИ) определяется как острая гипоксемическая дыхательная недостаточность с двусторонним отеком легких при отсутствии сердечной недостаточности3. Администрация дыхательных путей LPS является распространенным способом вызвать воспаление легких и ALI4,5,6,7. Хотя стерильное вещество не подходит для изучения фармакологических вмешательств при инфекционных заболеваниях, на механистические иммунологические вопросы можно ответить с достаточной точностью. Привитие ЛПС в трахею вызывает надежную воспалительную реакцию с нашествием лейкоцитов, upregulation провоспалительных цитокинов, и нарушение альвеоло-капиллярного барьера в течение нескольких часов до нескольких дней, в зависимости от дозировки LPS3, 6,7.
Представленный протокол описывает подробную пошаговую процедуру, чтобы вызвать АЛИ у мышей путем внутричехального зависания ЛПС. Модель была подтверждена путем оценки экспрессии цитокинов, нейтрофилов гранулоцитов вторжения, и внутриальвеолярной утечки альбумин, как ранее описано8.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1189px;" width="1189">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:653px;">1 ml syringes</td>
			<td style="width:289px;">BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td style="width:104px;">300013</td>
			<td style="width:143px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 ml syringes</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>309110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-CD115 (c-fms) APC</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>17-1152-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-CD11b (M1/70) - FITC</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>11-0112-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-CD45 (30-F11) - eF450</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>48-0451-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-F4/80 (BM-8) - PE Cy7</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>25-4801-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Gr1 (RB6-8C5)</td>
			<td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>552093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>45-5932-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7</td>
			<td>Bio Legend, San Diego, CA</td>
			<td>127623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Buprenorphine hydrochloride</td>
			<td>Indivior UK Limited, Berkshire, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C57BL/6 mice, female, 10 - 12 weeks old</td>
			<td>Charles River, Wilmongton, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td style="width:143px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaliBRITE APC-beads (6&#181;m)</td>
			<td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>340487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:653px;">Canula 23 gauge 1&#39;&#39;</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>300800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:653px;">Canula 26 gauge 1/2&#39;&#39;</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>303800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell strainer 70 &#181;m</td>
			<td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase Type I</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>1148089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deoxyribonuclease II</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>D8764&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS), sterile</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (PBS), without calcium chloride and magnesium chloride, sterile</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS tubes, 5 ml</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>551579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11049-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane</td>
			<td>Baxter, Unterschlei&#223;heim, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O111:B4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>L2630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Green Kit</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>L23101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block&#8482;), Clone 2.4G2</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Red blood cell lysis buffer</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI-1640, with L-glutamine and sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>14060-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium azide (NaN3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue forceps</td>
			<td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11021-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:653px;">Tubes</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>30125150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Venous catheter, 22 gauge</td>
			<td>B.Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>4268091B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine hydrochloride</td>
			<td>Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducing acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation

Администрация дыхательных путей липополисахарида (LPS) является распространенным способом изучения воспаления легких и острой травмы легких (ALI) в малых моделей животных. Были описаны различные подходы, такие как вдыхание аэрозольных ЛПС, а также носовое или внутримагистральное заволакивание. Представленный протокол описывает подробную пошаговую процедуру, чтобы вызвать АЛИ у мышей путем прямого внутрипеченого зависания ЛПС и выполнения анализа FACS образцов крови, бронхоальвеолярной провай (BAL) жидкости и легочной ткани. После интраперитонеальной седации трахея подвергается воздействию и LPS вводится через 22 G венозного катетера. Надежная и воспроизводимая воспалительная реакция с нашествием лейкоцитов, upregulation провоспалительных цитокинов, и нарушение альвеоло-капиллярного барьера индуцируется в течение нескольких часов до нескольких дней, в зависимости от дозы LPS используется. Сбор образцов крови, BAL жидкости, и вырубка легких, а также обработки для анализа FACS, подробно описаны в протоколе. Хотя использование стерильных LPS не подходит для изучения фармакологических вмешательств при инфекционных заболеваниях, описанный подход предлагает минимальную инвазивность, простое обращение и хорошую воспроизводимость для ответа на механистические иммунологические вопросы. Кроме того, доза титрации, а также использование альтернативных препаратов LPS или мыши штаммов позволяют модуляции клинических эффектов, которые могут проявлять различные степени али тяжести или раннего против позднего начала симптомов заболевания.

Описанный подход к индуцированию АЛИ у мышей был подтвержден путем оценки экспрессии цитокинов, инфильтрации нейтрофилов гранулоцитов и нарушения альвеоло-капиллярного барьера 24 ч и 72 ч после закапывания ЛПС. PBS-инъекционных животных служил ими. Внутриартериальный lpS администрации ин...

Watch this Scientific Journal Video about Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation at JoVE.com

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

Представлено здесь пошаговая процедура, чтобы вызвать острую травму легких у мышей путем прямого внутричехального липополисахарида закапывания и для выполнения FACS анализ образцов крови, бронхоальвеолярной жидкости для вавания, и легочной ткани. Минимальная инвазивность, простая обработка, хорошая воспроизводимость, и титрование тяжести заболевания являются преимуществами этого подхода.

Индуцирование острая травма легких у мышей путем прямого внутричехального липополисахарида интиллация

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

Надежные модели животных являются важнейшими компонентами фундаментальных исследований. Наш муринский подход позволяет отвечать на иммунологические вопросы о механистистии и кинетике развития острой травмы легких у млекопитающих. Минимальная инвазивность, простая управляемость, а также хорошая воспроизводимость являются основными преимуществами этой техники.Кроме того, с титрами дозы, мы можем модулировать клинический эффект. Этот метод отражает клиническое положение пациентов с тяжелой травмой легких и позволяет исследовать основные механизмы. Храните липополисахарид, или LPS, в алицитах при концентрации в пять миллиграммов на миллилитр при температуре минус 20 градусов по Цельсию.Для интратрахеальной инститации разбавляют размороженные LPS в стерильном фосфате буферного солевого раствора до конечной концентрации 2000 микрограмм на миллилитр. Вырезать 22-калибровочный венозный катетер длиной 20 миллиметров. Поместите мышь в положение, контролируемое температурой, чтобы поддерживать температуру тела 37 градусов по Цельсию.После анестезии, как описано в текстовом протоколе, применять стерильные офтальмологические смазки для предотвращения высыхания роговицы под наркозом. Поднимите резцы головы и крючка на горизонтальной полосе, расположенной примерно на пять сантиметров над столом, в то время как предвидели остаются в тесном контакте со столом. Супер-расширить шею в 90 градусов угол по отношению к столу.Поместите холодный источник света на кожу над гортани, чтобы помочь визуализировать голосовые связки и стремиться к трахее. Держите язык с типсами, чтобы выпрямить горло для облегчения условий инутубации. Правильная визуализация и идентификация гортани имеют решающее значение для обеспечения правильного интратрахального размещения катетера.Внешний источник холодного света помогает в этом шаге. Вставьте катетер примерно на 10 миллиметров в трахею. Убедитесь, что вставка не слишком глубока, так как это приведет к одностороннему закапывания жидкости в правый или левый основной бронх.Если сопротивление гортани происходит, втягивать катетер несколько миллиметров, прежде чем продвигаться снова. Теперь ввимите LPS-разбавленный MPBS с помощью пипетки. Впрыскиваемый объем зависит от массы тела мыши.Подключите шприц и добавьте болюс из 50 микролитров воздуха, чтобы обеспечить полный объем жидкости распределяется в легких. Медленно удалите катетер. Держите верхнюю часть тела мыши в вертикальном положении в течение 30 секунд, чтобы избежать утечки жидкости из трахеи.Исправить усыпляемой мыши с лентой на столе операции и вскоре дезинфицировать мех над животом с 70%этанола. Откройте брюшную полость тщательно в средней линии с ножницами и пинцетом. Удалите части кишечника для достижения доступа к полости вены уступает право позвоночного столба в брюшной аорты.Найдите вены почек и вставьте согнутую канюлю 23-го калибра, соединенную с одномиллилитровый шприц, в вену кавы ниже, прямо под слиянием вен. Аспирировать 250 микролитров крови и передавать в 1,5 миллилитровую трубку, наполненную 20 микролитров 0,5 моларного раствора ЭДТА. Встряхните осторожно, чтобы облегчить смешивание EDTA и положить трубку на лед.Для бронхоальвеолярного лаважа приготовьте три одноми миллилитровых шприца, каждый из которых будет с 0,5 миллилитров стерильного PBS и 0,1 миллилитров воздуха. Дезинфицировать мех горла с 70% этанола и тщательно подвергать трахеи с ножницами и пинцетом. Мобилизовать трахею и обернуть шов вокруг него.Проколите трахею с помощью микро-ножниц и вставьте 22-калибровочный венозный катетер, разрезанный на длину 20 миллиметров. Зафиксировать катетер с помощью шва и привить 0,5 миллилитров стерильных PBS и 0,1 миллилитра воздуха. Аспирировать жидкость через 60 секунд.Повторите процедуру с дополнительными двумя шприцами и соберите весь аспират в 15 миллилитровую трубку на льду. Аккуратно откройте грудную клетку ножницами и пинцетом, чтобы собрать легкие. Вырезать диафрагму вдоль стоимости маржи и прорезать ребра с двумя боковой разрезов.Тщательно избегайте проколов легких. Поднимите грудину черепно-мозговой и исправить или удалить его. Приготовьте два 10 миллилитровых шприца с теплыми, 37 градусами по Цельсию PBS.Сделайте небольшой разрез в левый желудочек. Проколите правый желудочек 26-калиберной канюлей. Затем промыть легочной циркуляции с предварительно разогретой PBS.Имейте в виду, легкие бледнеют во время процедуры. Удалить правую долей легких и разрезать его на половинки. Привязать заморозить их в жидком азоте с последующим долгосрочным хранением при температуре минус 80 градусов по Цельсию для дальнейшего экспрессии генов и анализа белка.Удалить все левое легкое и гомогенизировать его в 48-хорошо пластины путем заминки ткани с ножницами и пинцетом. Инкубировать ткани в два миллилитров буфера пищеварения при 37 градусов по Цельсию в течение 60 минут. Выполните дальнейшую гомогенизацию, тщательно трубя куски легочной ткани вверх и вниз.Перенесите образцы крови в пять миллилитров facS трубки и аккуратно смешать кровь с двумя миллилитров буфера лиза красных кровяных телец. Положите трубки на лед и прекратить реакцию через две минуты, добавив два миллилитров ледяной PBS. Центрифуга образца в течение пяти минут при 400 раз g и отказаться от супернатанта.Повторное окрашивание клеточных гранул с 60 микролитров буфера FACS и процесс последующего окрашивания FACS в соответствии с ранее описанными протоколами. Центрифуга BAL жидкости в течение пяти минут при 400 раз г. Аспирировать супернатант и заморозить его в жидком азоте с последующим долгосрочным хранением при температуре минус 80 градусов по Цельсию для дальнейшего анализа белка.После повторного использования гранулы клетки BAL с двумя миллилитров холодного буфера FACS, передать подвеску в пятими миллилитров FACS трубки с помощью 100 микрон сетки фильтр для сдерживания волос. После центрифугирования образца снова, повторно гранулы с 60 микролитров буфера FACS и процесс для последующего окрашивания FACS в соответствии с ранее описанными протоколами. Теперь перенесите переваренную левую легочную ткань в пятими миллилитровую трубку FACS с помощью фильтра сетки емкостью 100 микрон для извлечения комков.Прекратите процесс пищеварения, добавив два миллилитров ледяного буфера FACS перед центрифугой образца в течение пяти минут при 400 г. Откажитесь от супернатанта и перерасходуйте гранулы с помощью 60 микролитров буфера FACS и обработать для последующего окрашивания FACS в соответствии с ранее описанными протоколами. Для анализа FACS добавьте 20 микролитров раствора антител CD16/CD32 в 60 микролитров клеток в пятими миллилитровую трубку.Инкубировать клетки при четырех градусах по Цельсию в течение 15 минут, чтобы блокировать неспецифическое связывание иммуноглобулина с рецепторами Fc. Между тем, подготовить мастер смесь с facS буфера и антител, как описано в текстовом протоколе. После блокировки не мыть клетки.Добавьте 20 микролитров смеси антител на образец, чтобы получить окончательный объем в 100 микролитров. Инкубировать образцы в течение 20 минут, в темноте, при четырех градусах по Цельсию. Вымойте каждый образец с одним миллилитров буфера FACS и центрифуги, как и раньше.Отбросьте супернатант и повторно поместьте гранулы с буфером FACS в соответствующую концентрацию клеток для измерений FACS. Наконец, добавьте фиксированные числа коммерчески доступных бусинок с флюорохромной калибровкой к каждому образцу, чтобы определить абсолютные числа клеток. Выполняйте цитометрию потока, используя стратегию гэтинга, показанную в текстовом протоколе для клеток крови, BAL и тканей.24, а также 72 часов после внутритрахеальной закапывания, экспрессия ТНФ-альфа в легочной ткани была значительно upregulated, достигнув устойчивого и более чем в 50 раз больше по сравнению с контроль животных. Вторжение лейкоцитов в ткани и альвеолярное пространство является отличительной чертой и характерной чертой для развития острой травмы легких. Анализ FACS выявил значительное проникновение нейтрофилов гранулоцитов в желудок интерстициум, при этом абсолютное количество клеток увеличилось почти в девять раз по сравнению с контролем после 24 часов.Абсолютный отсчет нейтрофилов гранулоцитов несколько снизился через 72 часа, однако, увеличение фактора по сравнению с контролем осталось. В соответствии с интерстициальной инфильтрацией нейтрофилов гранулоцитов, экспрессия MMP-9 во всей ткани легких также была значительно увеличена за весь период наблюдения. Нейтрофильные гранулоциты были увеличены не только в легочной ткани, но и в жидкости BAL.Увеличение створ по сравнению с контрольных животных было более выраженным, чем в легочной ткани. Отек легких из-за тяжелого нарушения альвеолокапильярийного барьера является патогномоническим для развития острой травмы легких. Анализ содержания альбумена в жидкости BAL elISA выявил значительную потерю барьерной функции через 24 часа и 72 часа после закапывания LPS.Правильное размещение катетера имеет решающее значение для двустороннего закапывания LPS. Часто изменения в дыхательных моделях, таких как кашель или задыхаясь, указывают на правильное интратрахеальной закапывания жидкости. После индукции острой травмы легких, ряд последующих шагов, таких как анализ FACS, ПЦР, обнаружение белка, могут быть выполнены, чтобы ответить на соответствующие вопросы исследования.

Research

JoVE Journal

Medicine

Pressure Controlled Ventilation to Induce Acute Lung Injury in Mice

Давление контролируемой вентиляции, чтобы вызвать острого повреждения легких у мышей

Murine models are extensively used to investigate acute injuries of different organs systems (1-34). Acute lung injury (ALI), which occurs with prolonged ...

Ischemia-reperfusion Model of Acute Kidney Injury and Post Injury Fibrosis in Mice

Ишемии-реперфузии Модель острого почечного повреждения и фиброза после травмы у мышей

Ischemia-reperfusion induced acute kidney injury (IR-AKI) is widely used as a model of AKI in mice, but results are often quite variable with high, often ...

Acute Brain Trauma in Mice Followed By Longitudinal Two-photon Imaging

Острая травма мозга у мышей с последующим продольного двухфотонного изображений

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no ...

Minimal Invasive Surgical Procedure of Inducing Myocardial Infarction in Mice

Минимально инвазивная хирургическая процедура индукции инфаркта миокарда у мышей

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last ...

Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Intubation-mediated Intratracheal IMIT Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Интубация опосредованного Интратрахеального (IMIT) Инстилляции: неинвазивный, легких конкретных Система доставки

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences ...

Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research

Закапывания и фиксация методы полезны в мышь легких исследования рака

The ability to instill live agents, cells, or chemicals directly into the lung without injuring or killing the mice is an important tool in lung cancer ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

Открыть Трахеостомия Желудочный кислота Аспирация мышиной модели острого повреждения легких Результаты в Максимальный Острый несмертельного повреждения легких

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...

A Pleural Effusion Model in Rats by Intratracheal Instillation of Polyacrylate/Nanosilica

Модель плеврального выпота в крыс на трахею инстилляции полиакрилат/Nanosilica

Pleural effusion is a prevalent clinical finding of many pulmonary diseases. Having a useful animal pleural effusion model is very important to study ...

Inducing Acute Liver Injury in Rats via Carbon Tetrachloride (CCl4) Exposure Through an Orogastric Tube

Inducing Acute Liver Injury in Rats via Carbon Tetrachloride CCl4 Exposure Through an Orogastric Tube

Индуцирование Острая травма печени у крыс через углеродный тетрахлорид (CCl4) Воздействие через орогастрическую трубку

Acute liver injury (ALI) plays a crucial role in the development of hepatic failure, which is characterized by severe liver dysfunction including ...

Intratracheal Instillation of Stem Cells in Term Neonatal Rats

Интрачехное закапывание стволовых клеток в термине неонатальных крыс

Prolonged exposure to high concentrations of oxygen leads to inflammation and acute lung injury, which is similar to human bronchopulmonary dysplasia ...