Name: inducing acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation
Uploaded: 2019-07-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation at JoVE.com

Författarna vill tacka Jan Kleiner och Susanne Schulz för att ha tillhandahållit teknisk support. Författarna erkänner det utmärkta stöd av flödet cytometri kärnan anläggningen vid den medicinska fakulteten vid Bonns universitet. Författarna erhöll ingen finansiering från någon extern organisation.  En del av de uppgifter som lämnats i resultat sektionen och som skildras i figur 3 har redan visats i en tidigare publikation8.

Detta djur protokoll godkändes av den lokala kommittén för djur vård (LANUV, Recklinghausen, Tyskland; protokoll nr 84-02.04.2015) och utfördes i enlighet med de nationella hälso instituten rikt linjer för användning av levande djur (NIH-publikation Nr 85-23, reviderad 1996).
1. ALI-induktion
<ol><li>Använd vuxen C57BL/6 möss i åldrarna ca 10-12 veckor. Hus djuren i individuellt ventilerade burar med fri till gång till vatten och standard gnagare Chow. Det är dock möjligt att u...

<ol>
	<li>Fink, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+sepsis.">Animal models of sepsis.</a> Virulence. 5 (1), 143-153 (2014).</li><li>Lu, Y. -. C., Yeh, W. -. C., Ohashi, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS/TLR4+signal+transduction+pathway.">LPS/TLR4 signal transduction pathway.</a> Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).</li><li>Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+acute+lung+injury.">Animal models of acute lung injury.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (3), 379-399 (2008).</li><li>Rabelo, M. A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Lung+Injury+in+Response+to+Intratracheal+Instillation+of+Lipopolysaccharide+in+an+Animal+Model+of+Emphysema+Induced+by+Elastase.">Acute Lung Injury in Response to Intratracheal Instillation of Lipopolysaccharide in an Animal Model of Emphysema Induced by Elastase.</a> Inflammation. 41 (1), 174-182 (2018).</li><li>Liu, F., Li, W., Pauluhn, J., Tr&#252;bel, H., Wang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-induced+acute+lung+injury+in+rats:+comparative+assessment+of+intratracheal+instillation+and+aerosol+inhalation.">Lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats: comparative assessment of intratracheal instillation and aerosol inhalation.</a> Toxicology. 304, 158-166 (2013).</li><li>Rittirsch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Lung+Injury+Induced+by+Lipopolysaccharide+Is+Independent+of+Complement+Activation.">Acute Lung Injury Induced by Lipopolysaccharide Is Independent of Complement Activation.</a> Journal of Immunology. 180 (11), 7664-7672 (2008).</li><li>D'Alessio, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+CD25+Foxp3++Tregs+resolve+experimental+lung+injury+in+mice+and+are+present+in+humans+with+acute+lung+injury.">CD4+CD25+Foxp3+ Tregs resolve experimental lung injury in mice and are present in humans with acute lung injury.</a> The Journal of Clinical Investigation. 119 (10), 2898-2913 (2009).</li><li>Ehrentraut, H., Weisheit, C., Scheck, M., Frede, S., Hilbert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+murine+acute+lung+injury+induces+increase+of+pulmonary+TIE2-expressing+macrophages.">Experimental murine acute lung injury induces increase of pulmonary TIE2-expressing macrophages.</a> Journal of Inflammation. 15, 12 (2018).</li><li>Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+pulmonary+damage+induced+by+lipopolysaccharide+via+intranasal+instillation.">A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation.</a> Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).</li><li>Reutershan, J., Basit, A., Galkina, E. V., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+recruitment+of+neutrophils+into+lung+and+bronchoalveolar+lavage+fluid+in+LPS-induced+acute+lung+injury.">Sequential recruitment of neutrophils into lung and bronchoalveolar lavage fluid in LPS-induced acute lung injury.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 289 (5), 807-815 (2005).</li><li>Hoegl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+multifactorial+nature+of+ARDS+-+approach+to+model+murine+acute+lung+injury.">Capturing the multifactorial nature of ARDS - approach to model murine acute lung injury.</a> Physiological Reports. 6 (6), (2018).</li><li>Weisheit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ly6Clow+and+Not+Ly6Chigh+Macrophages+Accumulate+First+in+the+Heart+in+a+Model+of+Murine+Pressure-Overload.">Ly6Clow and Not Ly6Chigh Macrophages Accumulate First in the Heart in a Model of Murine Pressure-Overload.</a> PLoS ONE. 9 (11), (2014).</li><li>Grommes, J., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+Neutrophils+to+Acute+Lung+Injury.">Contribution of Neutrophils to Acute Lung Injury.</a> Molecular Medicine. 17 (3-4), 293-307 (2011).</li><li>M&#252;ller-Redetzky, H. C., Suttorp, N., Witzenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+pulmonary+endothelial+barrier+function+in+acute+inflammation:+mechanisms+and+therapeutic+perspectives.">Dynamics of pulmonary endothelial barrier function in acute inflammation: mechanisms and therapeutic perspectives.</a> Cell and Tissue Research. 355 (3), 657-673 (2014).</li><li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+apoptosis+in+lipopolysaccharide-induced+lung+injury+in+mice.">Endothelial cell apoptosis in lipopolysaccharide-induced lung injury in mice.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 117 (3), 202-208 (1998).</li><li>Doyen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+induced+by+inhaled+lipopolysaccharide+depends+on+particle+size+in+healthy+volunteers.">Inflammation induced by inhaled lipopolysaccharide depends on particle size in healthy volunteers.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 82 (5), 1371-1381 (2016).</li><li>Stephens, R. S., Johnston, L., Servinsky, L., Kim, B. S., Damarla, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tyrosine+kinase+inhibitor+imatinib+prevents+lung+injury+and+death+after+intravenous+LPS+in+mice.">The tyrosine kinase inhibitor imatinib prevents lung injury and death after intravenous LPS in mice.</a> Physiological Reports. 3 (11), (2015).</li><li>Yu, Y., Jing, L., Zhang, X., Gao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simvastatin+Attenuates+Acute+Lung+Injury+via+Regulating+CDC42-PAK4+and+Endothelial+Microparticles.">Simvastatin Attenuates Acute Lung Injury via Regulating CDC42-PAK4 and Endothelial Microparticles.</a> Shock. 47 (3), 378-384 (2017).</li></ol>

Minimal invasivitet, enkel hantering och god reproducerbarhet är viktiga inslag i den presenterade metoden för att inducera ALI i en liten gnagare modell. Användning av LPS i stället för hela bakterier i djur modeller har fördelar. Det är en stabil och ren förening och kan lagras i frystorkad form fram till användning. Det är en potent stimulerande för medfödda immun svar via TLR4 vägen, och dess biologiska aktivitet kan lätt kvantifieras, under lätta titrering av sjukdomens svårighets grad med god reprod...

Experimentella djur modeller är oumbärliga i grundläggande immun forskning. Administrering av hela bakterier eller mikrobiella komponenter har ofta använts i små djur modeller för att framkalla lokal eller systemisk inflammation1. Lipopolysaccharide (LPS, eller bakteriell endotoxin) är en cell vägg komponent och ytantigen av Gramnegativa bakterier (t. ex. Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., eller Legionella spp.). Termostabila och stora molekylen (molekyl vikt 1-4 x 106 kDa) består av en Lipiddel (lipid a), kärn region (oligosackarid) och en o-polysackarider (eller o-antigen). Lipid A, med sina hydrofoba fett syror kedjor, förankrar molekylen i ett bakterie membran och förmedlar (vid nedbrytning av bakterier) den immunologiska aktiviteten och toxiciteten hos LPS. Efter bindning till LPS bindande protein (LBP), LPS: LBP komplex ligera CD14/TLR4/MD2 receptor komplex ligger på ytan av många cell typer, inducera en stark proinflammatorisk reaktion med NF-κb nukleär translokationen och efterföljande uppreglering av cytokin uttryck2.
Akut lung skada (ALI) definieras som akut hypoxemisk respiratorisk svikt med bilateralt lungödem i avsaknad av hjärt svikt3. Luftvägs administrering av LPS är ett vanligt sätt att inducera pulmonell inflammation och Ali4,5,6,7. Även om det sterila ämnet inte lämpar sig för att studera farmakologiska interventioner vid infektions sjukdomar, kan mekanistiska immunologiska frågor besvaras med tillräcklig precision. Instillation av LPS i luft strupen inducerar en robust inflammatorisk reaktion med leukocytinvasion, uppreglering av proinflammatoriska cytokiner, och störningar av alveolo-kapillär barriären inom några timmar till dagar, beroende på LPS dosering3, 6,7.
Det presenterade protokollet beskriver en detaljerad steg-för-steg-procedur för att inducera Ali hos möss genom intratrakeal LPS instillation. Modellen har validerats genom att bedöma cytokin uttryck, neutrofila granulocyt invasion, och intra-alveolära albuminläckage som tidigare beskrivits8.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1189px;" width="1189">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:653px;">1 ml syringes</td>
			<td style="width:289px;">BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td style="width:104px;">300013</td>
			<td style="width:143px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 ml syringes</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>309110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-CD115 (c-fms) APC</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>17-1152-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-CD11b (M1/70) - FITC</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>11-0112-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-CD45 (30-F11) - eF450</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>48-0451-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-F4/80 (BM-8) - PE Cy7</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>25-4801-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Gr1 (RB6-8C5)</td>
			<td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>552093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>45-5932-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7</td>
			<td>Bio Legend, San Diego, CA</td>
			<td>127623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Buprenorphine hydrochloride</td>
			<td>Indivior UK Limited, Berkshire, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C57BL/6 mice, female, 10 - 12 weeks old</td>
			<td>Charles River, Wilmongton, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td style="width:143px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaliBRITE APC-beads (6&#181;m)</td>
			<td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>340487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:653px;">Canula 23 gauge 1&#39;&#39;</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>300800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:653px;">Canula 26 gauge 1/2&#39;&#39;</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>303800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell strainer 70 &#181;m</td>
			<td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase Type I</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>1148089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deoxyribonuclease II</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>D8764&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS), sterile</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (PBS), without calcium chloride and magnesium chloride, sterile</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS tubes, 5 ml</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>551579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11049-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane</td>
			<td>Baxter, Unterschlei&#223;heim, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O111:B4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>L2630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Green Kit</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>L23101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block&#8482;), Clone 2.4G2</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Red blood cell lysis buffer</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI-1640, with L-glutamine and sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>14060-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium azide (NaN3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue forceps</td>
			<td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11021-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:653px;">Tubes</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>30125150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Venous catheter, 22 gauge</td>
			<td>B.Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>4268091B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine hydrochloride</td>
			<td>Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducing acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation

Luftvägs administrering av lipopolysackarid (LPs) är ett vanligt sätt att studera pulmonell inflammation och akut lung skada (Ali) i små djur modeller. Olika metoder har beskrivits, såsom inandning av aerosolized LPS samt nasal eller intratrakeal instillation. Det presenterade protokollet beskriver ett detaljerat steg-för-steg-förfarande för att inducera Ali hos möss genom direkt intratrakeal LPS instillation och utföra FACS analys av blodprover, bronkoalveolar sköljning (bal) vätska, och lung vävnad. Efter intraperitoneal sedering exponeras luft strupen och LPS administreras via en 22 G ven kateter. En robust och reproducerbar inflammatorisk reaktion med leukocytinvasion, uppreglering av proinflammatoriska cytokiner, och störningar av alveolo-kapillär barriären induceras inom några timmar till dagar, beroende på LPS dosering används. Insamling av blod prov, BAL vätska, och lung skörd, samt bearbetning för FACS analys, beskrivs i detalj i protokollet. Även om användningen av sterila LPS inte lämpar sig för att studera farmakologiska interventioner vid infektions sjukdomar, erbjuder den beskrivna metoden minimal invasivitet, enkel hantering och god reproducerbarhet för att besvara mekanistiska immunologiska frågor. Dessutom, dostitrering samt användning av alternativa LPS preparat eller mus stammar tillåta modulering av de kliniska effekterna, som kan uppvisa olika grader av ALI svårighets grad eller tidigt vs. sen debut av sjukdoms symtomen.

Den beskrivna metoden för att inducera ALI hos möss validerades genom att bedöma cytokin uttryck, neutrofila granulocyt infiltration, och alveolo-kapillär barriär störningar 24 h och 72 h efter LPS instillation. PBS-injicerade djur fungerade som kontroll. Intratracheal LPS administrering inducerade en robust pulmonell proinflammatorisk respons. Uttryck för TNF-α i lung vävnad var signifikant uppreglerad, uppnådde en ihållande och mer än 50-faldig ökning jämfört med kontroll djuren [RQ (TNF-α/18s); 24 h: 5...

Watch this Scientific Journal Video about Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation at JoVE.com

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

Presenteras här är en steg-för-steg förfarande för att framkalla akut lung skada hos möss genom direkt intratrakeal lipopolysackarid instillation och att utföra FACS analys av blodprover, bronkoalveolära sköljning vätska, och lung vävnad. Minimal invasivitet, enkel hantering, god reproducerbarhet och titrering av sjukdomens svårighets grad är fördelar med denna metod.

Inducera akut lung skada hos möss genom direkt Intratracheal Lipopolysaccharide instillation

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

Tillförlitliga djurmodeller är avgörande komponenter i grundforskningen. Vår murine strategi tillåter att svara på immunologiska frågor om mekanistics och kinetik av akut lungskada utveckling hos däggdjur. Minimal invasivitet, enkel hantering, samt god reproducerbarhet är de viktigaste fördelarna med denna teknik.Dessutom, med dos titrering, kan vi modulera den kliniska effekten. Denna teknik speglar den kliniska situationen för patienter med svår lungskada och gör det möjligt att undersöka de underliggande mekanismerna. Förvara lipopolysackarid, eller LPS, i alikvoter vid en koncentration på fem milligram per milliliter vid minus 20 grader Celsius.För instillation av intratrakeal, späd den tinade LPS i steril fosfatbuffrad koksaltlösning till en slutkoncentration på 2, 000 mikrogram per milliliter. Skär en 22-gauge venkateter till en längd av 20 millimeter. Placera musen i utsatt position på ett temperaturkontrollerat bord för att hålla en kroppstemperatur på 37 grader Celsius.Efter anestesi som beskrivs i textprotokollet, tillämpa sterila oftalmiska smörjmedel för att förhindra avsikning av hornhinnor under anestesi. Lyft huvudet och hakens framtåe på en horisontell stång placerad ungefär fem centimeter ovanför bordet medan framtårsorna förblir i nära kontakt med bordet. Super-förlänga halsen i en 90 graders vinkel i förhållande till bordet.Placera en kall ljuskälla på huden ovanför struphuvudet för att visualisera stämbanden och sikta på luftstrupen. Håll tungan med tång för att räta ut halsen för enklare intubation villkor. Korrekt visualisering och identifiering av struphuvudet är kritiska för att försäkra korrekt intratrakeal placering av katetern.En extern kall ljuskälla hjälper i detta steg. För in katetern cirka 10 millimeter i luftstrupen. Se till att införandet inte är för djupt, eftersom detta kommer att resultera i ensidig instillation av vätska i höger eller vänster huvudbronchus.Om struphuvudets motstånd uppstår, dra tillbaka katetern några millimeter innan du avancerar igen. Injicera nu LPS-utspädd MPBS med hjälp av en pipett. Den injicerade volymen beror på musens kroppsvikt.Anslut en spruta och tillsätt en bolus på 50 mikroliter luft för att säkerställa att den kompletta vätskevolymen fördelas i lungorna. Ta långsamt bort katetern. Håll musens överkropp i upprätt läge i 30 sekunder för att undvika läckage av vätskan från luftstrupen.Fixera den avlivade musen med tejp på ett operationsbord och kort desinficera pälsen över buken med 70%etanol. Öppna bukhålan försiktigt i medianlinjen med sax och pincett. Ta bort delar av tarmen för att uppnå tillgång till vena cava sämre rätt till kotpelaren i bukaortan.Lokalisera njurvenerna och sätt in en böjd, 23-gauge kanyl ansluten till en milliliter spruta i vena cava sämre, direkt under sammanflödet av venerna. Aspirera 250 mikroliter blod och överföra till en 1,5 milliliter rör fylld med 20 mikroliter av 0,5 molar EDTA lösning. Skaka försiktigt för att underlätta EDTA-blandning och lägg röret på is.För bronchoalveolar lavage, förbereda tre en milliliter sprutor, var och en med 0,5 milliliter steril PBS och 0,1 milliliter luft. Desinficera pälsen i halsen med 70%etanol och exponera försiktigt luftstrupen med sax och pincett. Mobilisera luftstrupen och linda en sutur runt den.Punktera luftstrupen med hjälp av mikrosax och sätt in en 22-gauge venkateter, skuren till en längd av 20 millimeter. Fixera katetern med en sutur och ingjuta 0,5 milliliter steril PBS och 0,1 milliliter luft. Aspirera vätskan efter 60 sekunder.Upprepa proceduren med de ytterligare två sprutorna och samla hela aspiraten i ett 15 milliliter rör på is. Öppna försiktigt bröstkorgen med sax och pincett för att skörda lungorna. Skär membranet längs costal marginalen och skär genom revbenen med två laterala snitt.Undvik försiktigt punktering av lungorna. Lyft bröstbenet kranialt och fixera eller ta bort det. Förbered två 10 milliliter sprutor med varma, 37 grader Celsius PBS.Gör ett litet snitt i den vänstra ventrikeln. Punktera höger kammare med en 26-gauge kanyl. Spola sedan lungcirkulationen med en förvärvd PBS.Var medveten om lungorna blir bleka under förfarandet. Ta bort lungornas högra lob och skär den i halvor. Snap frysa dem i flytande kväve följt av långvarig lagring vid minus 80 grader Celsius för ytterligare genuttryck och proteinanalys.Ta bort hela vänstra lungan och homogenisera den i en 48-brunnsplatta genom att hacka vävnaden med sax och pincett. Inkubera vävnaden i två milliliter av matsmältningsbuffert vid 37 grader Celsius i 60 minuter. Utför ytterligare homogenisering genom att försiktigt pipettera lungvävnadsbitarna upp och ner.Överför blodproven till fem milliliter FACS-rör och blanda försiktigt blodet med två milliliter av röda blodkroppar lys buffert. Sätt rören på is och avsluta reaktionen efter två minuter genom att lägga till två milliliter iskall PBS. Centrifugera provet i fem minuter vid 400 gånger g och kassera supernatanten.Resuspend cell pelleten med 60 mikroliter av FACS buffert och process för efterföljande FACS färgning enligt tidigare beskrivna protokoll. Centrifugera BAL vätska i fem minuter vid 400 gånger g. Aspirera supernatanten och fryser den i flytande kväve följt av långtidslagring vid minus 80 grader Celsius för ytterligare proteinanalys.Efter resuspending balcellen pelleten med två milliliter av kall FACS buffert, överföra suspensionen till en fem milliliter FACS rör med hjälp av en 100 micron mesh filter för att hålla fast hårstrån. Efter centrifugering provet igen, återanvända pelleten med 60 mikroliter av FACS buffert och process för efterföljande FACS färgning enligt tidigare beskrivna protokoll. Nu, överföra den smälta vänstra lungvävnaden i en fem milliliter FACS rör med hjälp av en 100 micron mesh filter för att extrahera klumpar.Avsluta matsmältningen genom att tillsätta två milliliter iskall FACS buffert innan centrifugering provet i fem minuter vid 400 gånger g. Kassera supernatanten och resuspend pelleten med 60 mikroliter av FACS-buffert och process för efterföljande FACS-färgning enligt tidigare beskrivna protokoll. För en FACS-analys, tillsätt 20 mikroliter cd16/CD32 antikroppsblockeringslösning till 60 mikroliterceller i ett fem milliliterrör.Inkubera cellerna i fyra grader Celsius i 15 minuter för att blockera ospecifik bindning av immunglobulin till Fc-receptorerna. Under tiden, förbereda en master mix med FACS buffert och antikroppar, som beskrivs i textprotokollet. Efter blockering, tvätta inte cellerna.Tillsätt 20 mikroliter av antikroppsmästarmix per prov för att få en slutlig volym på 100 mikroliter. Inkubera proverna i 20 minuter, i mörker, vid fyra grader Celsius. Tvätta varje prov med en milliliter FACS-buffert och centrifug som tidigare.Kassera supernatanten och resuspend pelleten med FACS-buffert till lämplig cellkoncentration för FACS-mätningar. Lägg slutligen till fasta antal av kommersiellt tillgängliga fluorokrom-kopplade kalibreringspärlor till varje prov för att bestämma absoluta cellnummer. Utför flödescytometri med hjälp av den gatingstrategi som visas i textprotokollet för blod, BAL och vävnadsceller.24 samt 72 timmar efter intratrakeal instillation, var uttryck för TNF- alfa i lungvävnad betydligt uppreglerad, nå en ihållande och mer än 50-faldig ökning jämfört med kontroll djur. Leucocyte invasionen i vävnad och alveolar utrymme är ett kännetecken och karakteristiska för utvecklingen av akut lungskada. FACS analys visade en betydande infiltration av neutrophile granulocyter i lunga interstitium, med absolut cellen räkna har ökat nästan nio-faldigt jämfört med kontrollerna efter 24 timmar.Absolut neutrophile granulocyte räkna minskade något efter 72 timmar, dock faktorn öka jämfört med kontrollerna kvar. Överensstämmer med varordnat neutrophile granulocyte infiltration, MMP-9 uttryck i hela lungvävnad var likaså avsevärt ökat under den totala observationsperioden. Neutrofil granulocyter var inte bara ökat i lungvävnaden, men också i DEN BAL vätska.Veckökningen jämfört med kontrolldjur var mer uttalad än i lungvävnaden. Lung ödem på grund av allvarliga nedskrivningar av alveolocapillary barriären är patognomon för utvecklingen av akut lung skada. Analys av albumen innehåll i BAL vätska av ELISA visade en betydande förlust av barriärfunktionen på 24 timmar och 72 timmar efter LPS instillation.Korrekt kateter placering är avgörande för bilaterala instillation av LPS. Ofta indikerar förändringar i andningsmönster, såsom hosta eller flämtande, korrekt intratrakeal instillation av vätskan. Efter induktion av akut lungskada, ett antal efterföljande steg, såsom FACS analys, PCR, ett protein upptäckt, kan utföras för att besvara respektive forskning frågor.

Research

JoVE Journal

Medicine

Pressure Controlled Ventilation to Induce Acute Lung Injury in Mice

Tryckstyrd ventilation för att framkalla akut lungskada hos möss

Murine models are extensively used to investigate acute injuries of different organs systems (1-34). Acute lung injury (ALI), which occurs with prolonged ...

Ischemia-reperfusion Model of Acute Kidney Injury and Post Injury Fibrosis in Mice

Ischemi-reperfusion modell av akut Kidneyskadan och efter skada Fibros i möss

Ischemia-reperfusion induced acute kidney injury (IR-AKI) is widely used as a model of AKI in mice, but results are often quite variable with high, often ...

Acute Brain Trauma in Mice Followed By Longitudinal Two-photon Imaging

Akut Brain Trauma hos möss följt av Longitudinal Två-foton Imaging

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no ...

Minimal Invasive Surgical Procedure of Inducing Myocardial Infarction in Mice

Minimal invasiv kirurgisk procedur att inducera hjärtinfarkt hos möss

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last ...

Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Intubation-mediated Intratracheal IMIT Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Intubation-medierad Intratrakeal (IMIT) Instillation: en icke-invasiv, Lung specifik Delivery System

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences ...

Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research

Ingivningsmängder och Fixering metoder som är användbara i Mus Lung Cancer Research

The ability to instill live agents, cells, or chemicals directly into the lung without injuring or killing the mice is an important tool in lung cancer ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

Öppna Trakeostomituber Gastric Acid aspiration Murina Modell av akut lungskada Resultat i Maximal Akut nonlethal Lung Injury

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...

A Pleural Effusion Model in Rats by Intratracheal Instillation of Polyacrylate/Nanosilica

En pleurautgjutning modell hos råttor vid intratrakeal Instillation av polyakrylat/Nanosilica

Pleural effusion is a prevalent clinical finding of many pulmonary diseases. Having a useful animal pleural effusion model is very important to study ...

Inducing Acute Liver Injury in Rats via Carbon Tetrachloride (CCl4) Exposure Through an Orogastric Tube

Inducing Acute Liver Injury in Rats via Carbon Tetrachloride CCl4 Exposure Through an Orogastric Tube

Inducera akut leverskada hos råttor via koltetraklorid (CCl4) Exponering genom en orogastric Tube

Acute liver injury (ALI) plays a crucial role in the development of hepatic failure, which is characterized by severe liver dysfunction including ...

Intratracheal Instillation of Stem Cells in Term Neonatal Rats

Intratrakeal instillation av stamceller i term neonatal råttor

Prolonged exposure to high concentrations of oxygen leads to inflammation and acute lung injury, which is similar to human bronchopulmonary dysplasia ...