Name: inducing acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation
Uploaded: 2019-07-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation at JoVE.com

Yazarlar teknik destek sağlamak için Jan Kleiner ve Susanne Schulz teşekkür etmek istiyorum. Yazarlar Bonn Üniversitesi Tıp Fakültesi akış sitometri çekirdek tesis mükemmel destek kabul. Yazarlar herhangi bir dış kuruluştan hiçbir fon aldı.  Sonuçlar bölümünde verilen ve Şekil 3 ' te tasvir edilen verilerin bir kısmı zaten önceki yayında8' de gösterildi.

Bu hayvan protokolü, yerel hayvan bakımı Komitesi (LANUV, Recklinghausen, Almanya; protokol No. 84-02.04.2015) tarafından onaylandı ve canlı hayvanların kullanımı için Ulusal Sağlık Enstitüleri kurallarına uygun olarak gerçekleştirildi (NıH yayını No. 85-23, revize 1996).
1. ALI indüksiyon
<ol><li>Yaklaşık 10-12 hafta yaşlarda yetişkin C57BL/6 fareler kullanın. Su ve standart kemirgen Chow ücretsiz erişim ile bireysel havalandırılmış kafeslerde hayvanları ev. ...

<ol>
	<li>Fink, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+sepsis.">Animal models of sepsis.</a> Virulence. 5 (1), 143-153 (2014).</li><li>Lu, Y. -. C., Yeh, W. -. C., Ohashi, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS/TLR4+signal+transduction+pathway.">LPS/TLR4 signal transduction pathway.</a> Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).</li><li>Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+acute+lung+injury.">Animal models of acute lung injury.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (3), 379-399 (2008).</li><li>Rabelo, M. A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Lung+Injury+in+Response+to+Intratracheal+Instillation+of+Lipopolysaccharide+in+an+Animal+Model+of+Emphysema+Induced+by+Elastase.">Acute Lung Injury in Response to Intratracheal Instillation of Lipopolysaccharide in an Animal Model of Emphysema Induced by Elastase.</a> Inflammation. 41 (1), 174-182 (2018).</li><li>Liu, F., Li, W., Pauluhn, J., Tr&#252;bel, H., Wang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-induced+acute+lung+injury+in+rats:+comparative+assessment+of+intratracheal+instillation+and+aerosol+inhalation.">Lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats: comparative assessment of intratracheal instillation and aerosol inhalation.</a> Toxicology. 304, 158-166 (2013).</li><li>Rittirsch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Lung+Injury+Induced+by+Lipopolysaccharide+Is+Independent+of+Complement+Activation.">Acute Lung Injury Induced by Lipopolysaccharide Is Independent of Complement Activation.</a> Journal of Immunology. 180 (11), 7664-7672 (2008).</li><li>D'Alessio, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+CD25+Foxp3++Tregs+resolve+experimental+lung+injury+in+mice+and+are+present+in+humans+with+acute+lung+injury.">CD4+CD25+Foxp3+ Tregs resolve experimental lung injury in mice and are present in humans with acute lung injury.</a> The Journal of Clinical Investigation. 119 (10), 2898-2913 (2009).</li><li>Ehrentraut, H., Weisheit, C., Scheck, M., Frede, S., Hilbert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+murine+acute+lung+injury+induces+increase+of+pulmonary+TIE2-expressing+macrophages.">Experimental murine acute lung injury induces increase of pulmonary TIE2-expressing macrophages.</a> Journal of Inflammation. 15, 12 (2018).</li><li>Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+pulmonary+damage+induced+by+lipopolysaccharide+via+intranasal+instillation.">A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation.</a> Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).</li><li>Reutershan, J., Basit, A., Galkina, E. V., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+recruitment+of+neutrophils+into+lung+and+bronchoalveolar+lavage+fluid+in+LPS-induced+acute+lung+injury.">Sequential recruitment of neutrophils into lung and bronchoalveolar lavage fluid in LPS-induced acute lung injury.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 289 (5), 807-815 (2005).</li><li>Hoegl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+multifactorial+nature+of+ARDS+-+approach+to+model+murine+acute+lung+injury.">Capturing the multifactorial nature of ARDS - approach to model murine acute lung injury.</a> Physiological Reports. 6 (6), (2018).</li><li>Weisheit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ly6Clow+and+Not+Ly6Chigh+Macrophages+Accumulate+First+in+the+Heart+in+a+Model+of+Murine+Pressure-Overload.">Ly6Clow and Not Ly6Chigh Macrophages Accumulate First in the Heart in a Model of Murine Pressure-Overload.</a> PLoS ONE. 9 (11), (2014).</li><li>Grommes, J., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+Neutrophils+to+Acute+Lung+Injury.">Contribution of Neutrophils to Acute Lung Injury.</a> Molecular Medicine. 17 (3-4), 293-307 (2011).</li><li>M&#252;ller-Redetzky, H. C., Suttorp, N., Witzenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+pulmonary+endothelial+barrier+function+in+acute+inflammation:+mechanisms+and+therapeutic+perspectives.">Dynamics of pulmonary endothelial barrier function in acute inflammation: mechanisms and therapeutic perspectives.</a> Cell and Tissue Research. 355 (3), 657-673 (2014).</li><li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+apoptosis+in+lipopolysaccharide-induced+lung+injury+in+mice.">Endothelial cell apoptosis in lipopolysaccharide-induced lung injury in mice.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 117 (3), 202-208 (1998).</li><li>Doyen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+induced+by+inhaled+lipopolysaccharide+depends+on+particle+size+in+healthy+volunteers.">Inflammation induced by inhaled lipopolysaccharide depends on particle size in healthy volunteers.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 82 (5), 1371-1381 (2016).</li><li>Stephens, R. S., Johnston, L., Servinsky, L., Kim, B. S., Damarla, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tyrosine+kinase+inhibitor+imatinib+prevents+lung+injury+and+death+after+intravenous+LPS+in+mice.">The tyrosine kinase inhibitor imatinib prevents lung injury and death after intravenous LPS in mice.</a> Physiological Reports. 3 (11), (2015).</li><li>Yu, Y., Jing, L., Zhang, X., Gao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simvastatin+Attenuates+Acute+Lung+Injury+via+Regulating+CDC42-PAK4+and+Endothelial+Microparticles.">Simvastatin Attenuates Acute Lung Injury via Regulating CDC42-PAK4 and Endothelial Microparticles.</a> Shock. 47 (3), 378-384 (2017).</li></ol>

Minimal invasiveness, basit elleçleme ve iyi yeniden Üretilebilirlik, küçük bir kemirgen modelde ALI 'yi teşvik etmek için sunulan yaklaşımın temel özellikleridir. Hayvan modellerinde tüm bakterilerin yerine LPS kullanımı avantajları vardır. İstikrarlı ve saf bir bileşiktir ve kullanımına kadar liyofilize formda depolanabilir. Bu TLR4 yolu ile doğuştan gelen immün tepkiler için güçlü bir uyarıcı olduğunu, ve biyolojik aktivite kolayca nicelik olabilir, iyi reproducibility ile hastalığın ...

Deneysel hayvan modelleri temel bağışıklık araştırmalarında vazgeçilmez. Tüm bakterilerin veya mikrobiyal bileşenlerin yönetilmesi, yerel veya sistemik inflamasyona yol açan küçük hayvan modellerinde sıklıkla kullanılmıştır1. Lipopolysaccharide (LPS veya bakteriyel endotoksin) bir hücre duvar bileşeni ve gram-negatif bakterilerin yüzey antijeni (örn., Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., veya Legionella spp.). Termostabil ve büyük molekül (Moleküler Ağırlık 1-4 x 106 kDa) bir lipid kısım (lipid a), çekirdek bölge (oligosaccharide) ve bir o polisakkarit (veya o antijen) oluşur. Lipid A, hidrofobik yağ asidi zincirleri ile, molekül bir bakteriyel membran ve arabulucuları (bakterilerin bozulması üzerine) immünolojik aktivite ve LPS toksisitesi ile çapa. LPS bağlama proteini (LBP), LPS: LBP kompleksleri, birçok hücre türlerinin yüzeyinde bulunan CD14/TLR4/MD2 reseptör kompleksine bağlanarak, NF-κB nükleer translokasyon ve sonraki upregülasyonu ile güçlü bir proinflamatuar reaksiyon inducing sitokin ifadesi2.
Akut akciğer hasarı (ALI) kalp yetmezliği yokluğunda bilateral pulmoner ödem ile akut hipoxemik solunum yetmezliği olarak tanımlanır3. LPS Airway yönetimi pulmoner inflamasyon ve alı4,5,6,7teşvik etmek için yaygın bir yoldur. Steril madde bulaşıcı hastalıklarda farmakolojik müdahaleler çalışmak için uygun olmasa da, mekanik immünolojik sorular yeterli hassasiyetle cevaplanabilir. LPS 'in trakeanın içine ınbrilasyonu, lökosit invazyonu ile sağlam bir enflamatuar reaksiyon, proinflamatuar sitokinlerin updüzenleme, ve alveolo-kapiller bariyerinin saatler içinde gün içinde bozulması, LPS dozajı3' e bağlı olarak, 6,7.
Sunulan protokol, intratrakeal LPS instıtasyon tarafından farelerde alı 'yi teşvik etmek için ayrıntılı bir adım adım prosedür açıklar. Model, sitokin ifadesi, nötrofil granülosit invazyonu ve intra alveoler albümin kaçağı olarak önceden açıklandığı gibi değerlendirilerek doğrulandı8.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1189px;" width="1189">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:653px;">1 ml syringes</td>
			<td style="width:289px;">BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td style="width:104px;">300013</td>
			<td style="width:143px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 ml syringes</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>309110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-CD115 (c-fms) APC</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>17-1152-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-CD11b (M1/70) - FITC</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>11-0112-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-CD45 (30-F11) - eF450</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>48-0451-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-F4/80 (BM-8) - PE Cy7</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>25-4801-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Gr1 (RB6-8C5)</td>
			<td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>552093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>45-5932-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7</td>
			<td>Bio Legend, San Diego, CA</td>
			<td>127623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Buprenorphine hydrochloride</td>
			<td>Indivior UK Limited, Berkshire, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C57BL/6 mice, female, 10 - 12 weeks old</td>
			<td>Charles River, Wilmongton, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td style="width:143px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaliBRITE APC-beads (6&#181;m)</td>
			<td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>340487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:653px;">Canula 23 gauge 1&#39;&#39;</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>300800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:653px;">Canula 26 gauge 1/2&#39;&#39;</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>303800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell strainer 70 &#181;m</td>
			<td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase Type I</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>1148089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deoxyribonuclease II</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>D8764&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS), sterile</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (PBS), without calcium chloride and magnesium chloride, sterile</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS tubes, 5 ml</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>551579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11049-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane</td>
			<td>Baxter, Unterschlei&#223;heim, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O111:B4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>L2630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Green Kit</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>L23101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block&#8482;), Clone 2.4G2</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Red blood cell lysis buffer</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI-1640, with L-glutamine and sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>14060-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium azide (NaN3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue forceps</td>
			<td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11021-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:653px;">Tubes</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>30125150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Venous catheter, 22 gauge</td>
			<td>B.Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>4268091B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine hydrochloride</td>
			<td>Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducing acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation

Lipopolisakkarid (LPS) Airway yönetimi küçük hayvan modellerinde pulmoner inflamasyon ve akut akciğer hasarı (alı) incelemek için yaygın bir yoldur. Aerosolize LPS inhalasyonu ve burun ya da intratrakeal instilasyon gibi çeşitli yaklaşımlar tanımlanmıştır. Sunulan protokol, doğrudan intratrakeal LPS instıtasyon tarafından farelerde alı 'yi teşvik etmek ve kan örnekleri, Bronkoalveoler Lavaj (bal) sıvısı ve akciğer dokusu FACS analizi gerçekleştirmek için ayrıntılı bir adım adım prosedür açıklanmaktadır. İntraperitoneal sedasyon sonrasında trakea maruz kalır ve LPS 22 G venöz kateter üzerinden uygulanır. Lökosit invazyonu ile sağlam ve tekrarlanabilir bir inflamatuar reaksiyon, proenflamatuar sitokinlerin updüzenleme ve alveolo-kapiller bariyerinin bozulması, kullanılan LPS dozaja bağlı olarak saatlerce gün içinde indüklenir. Kan numunelerinin toplanması, BAL sıvısı, ve akciğer hasat, hem de FACS analizi için işleme, protokolde ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Steril LPS kullanımı bulaşıcı hastalıklarda farmakolojik müdahaleleri incelemek için uygun olmasa da, açıklanan yaklaşım, mekanik immünolojik sorulara cevap vermek için minimal invasiveness, basit kullanım ve iyi yeniden Üretilebilirlik sunar. Ayrıca, doz titrasyonu yanı sıra alternatif LPS preparatları veya fare suşları kullanımı klinik etkilerinin modülasyon izin, hangi ALI şiddeti farklı derecelerde gösterebilir veya erken vs hastalık belirtileri geç başlangıcı.

Farelerde ALI 'yi teşvik etmek için açıklanan yaklaşım, sitokin ifadesi, nötrofil granülosit infiltrasyonu, ve alveolo-kapiller bariyer bozulması 24 h ve 72 h sonra LPS instıtasyon değerlendirilerek doğrulandı. PBS enjekte hayvanlar kontrol olarak görev yaptı. İntratracheal LPS yönetimi sağlam bir pulmoner proinflamatuar tepkiye sebep oldu. Akciğer dokusunda TNF-α ifadesi, kontrol hayvanları [RQ (TNF-α/18s); 24 h: 53,7 (SD = 11,6); 72 h: 55,0 (SD = 20,6); p < 0,05)] (Şekil 3</s...

Watch this Scientific Journal Video about Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation at JoVE.com

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

Burada sunulan bir adım-adım prosedür doğrudan intratrakeal lipopolisakkarid instilasyon tarafından fareler akut akciğer hasarı neden ve kan örnekleri, Bronkoalveoler Lavaj sıvısı ve akciğer dokusu FACS analizi gerçekleştirmek için. Minimal invasiveness, basit kullanım, iyi reproducibility, ve hastalık şiddeti titrasyon bu yaklaşımın avantajlarıdır.

Doğrudan Intratracheal Lipopolysaccharide Instilasyon ile farelerde akut akciğer hasarının İndükleme

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

Güvenilir hayvan modelleri temel araştırmanın önemli bileşenleridir. Bizim mürin yaklaşımımemelilerde akut akciğer hasarı gelişimi mekanistik ve kinetik immünolojik sorulara cevap sağlar. Minimal invazivlik, basit kullanım ve iyi tekrarlanabilirlik bu tekniğin başlıca avantajlarıdır.Buna ek olarak, doz titrasyonu ile, biz klinik etkisi modüle edebilirsiniz. Bu teknik, ciddi akciğer hasarı olan hastaların klinik durumunu yansıtarak altta yatan mekanizmaların araştırılmasını sağlar. Lipopolisakkarit veya LPS'yi mililitrebaşına beş miligramlık bir konsantrasyonda eksi 20 santigrat derecede saklayın.İntratrakeal aşılama için, steril fosfat tamponlu tuzlu da çözülmüş LPS'yi mililitrede 2,000 mikrogramlık son konsantrasyona seyreltin. 22-gauge venöz kateter20 milimetre uzunluğunda kesin. 37 santigrat derece lik bir vücut sıcaklığıkorumak için fareyi Sıcaklık kontrollü bir masaya yatkın konuma yerleştirin.Metin protokolünde açıklandığı gibi anesteziyi takiben, anestezi altında korneaların kurumasını önlemek için steril oftalmik yağ layıcı uygulayın. Ön patiler masayla yakın temas halinde kalırken, masanın yaklaşık beş santimetre yukarısında konumlandırılmış yatay bir çubuktaki baş ve kanca kesici leri kaldırın. Boynu masaya göre 90 derecelik açıyla süper genişletin.Ses tellerini görselleştirmeye ve trakeayı hedeflemeye yardımcı olmak için gırtlanın üzerindeki cilde soğuk bir ışık kaynağı yerleştirin. Daha kolay entübasyon koşulları için boğaz düzeltmek için forseps ile dil tutun. Gırtlanın doğru görüntülenmesi ve tanımlanması kateterin doğru intratrakeal yerleşimini sağlamak için önemlidir.Harici bir soğuk ışık kaynağı bu adımda yardımcı olur. Kateteri yaklaşık 10 milimetretlik bir trakeaya yerleştirin. Bu sağ veya sol ana bronş içine sıvı tek taraflı aşılama neden olacağı gibi ekleme, çok derin olmadığından emin olun.Gırtlağın direnci oluşursa, tekrar ilerlemeden önce kateteri birkaç milimetre geri çekin. Şimdi, lps seyreltilmiş MPBS bir pipet kullanarak enjekte edin. Enjekte edilen hacim farenin vücut ağırlığına bağlıdır.Bir şırınga bağlayın ve tam sıvı hacmi akciğerlerde dağıtılan sağlamak için hava 50 mikrolitre bir bolus ekleyin. Kateteri yavaşça çıkarın. Trakeadan sıvı sızıntısını önlemek için farenin üst gövdesini 30 saniye boyunca dik bir pozisyonda tutun.Bir operasyon masasında bant ile ötenazi fare düzeltmek ve kısa bir süre% 70 etanol ile karın üzerinde kürk dezenfekte. Karın boşluğunu makas ve cımbızla ortanca çizgide dikkatlice açın. Karın aort vertebral sütuna vena kava inferior sağ erişim elde etmek için bağırsak parçaları çıkarın.Böbrek damarları bulmak ve vena kava inferior içine bir mililitreşşile bağlı bir bükülmüş, 23-gauge kanül eklemek, doğrudan damarların birleşimi altında. 250 mikrolitre kan aspirat ve 0,5 molar EDTA çözeltisi 20 mikrolitre ile dolu 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. EDTA karıştırma kolaylaştırmak ve buz üzerine tüp koymak için hafifçe çalkalayın.Bronkoalveoler lavaj için, her biri 0,5 mililitre steril PBS ve 0,1 mililitre hava içeren üç adet mililitre şırınga hazırlayın. % 70 etanol ile boğaz kürk dezenfekte ve dikkatle makas ve cımbız ile trakea maruz. Nefes borusunu harekete geçirin ve etrafına bir dikiş sarın.Trakeayı mikro makas kullanarak delin ve 20 milimetre uzunluğa kadar kesilmiş 22 kalibrelik venöz kateter takın. Kateteri bir dikişle düzeltin ve 0,5 mililitre steril PBS ve 0,1 mililitre hava aşıla. 60 saniye sonra sıvı aspire.Ek iki şırınga ile prosedürü tekrarlayın ve buz üzerinde 15 mililitrelik bir tüp içinde tüm aspire toplamak. Dikkatle akciğerleri hasat makas ve cımbız ile göğüs açık. Costal marjı boyunca diyafram kesin ve iki lateral kesiler ile kaburga kesti.Akciğerleri dikkatlice delmekten kaçının. Sternum kranially kaldırın ve düzeltmek veya çıkarın. Sıcak, 37 derece Santigrat PBS ile iki 10 mililitreşli şırınga hazırlayın.Sol ventriküliçine küçük bir kesi yapın. 26-gauge kanül ile sağ ventrikül delinme. Sonra, önceden ısıtılmış bir PBS ile pulmoner dolaşımı floş.İşlem sırasında akciğerlerin solukla döndüğünü unutmayın. Akciğerlerin sağ lobu çıkarın ve yarıya kesin. Snap sıvı nitrojen onları dondurma eksi 80 santigrat derece daha fazla gen ekspresyonu ve protein analizi için uzun vadeli depolama izledi.Tüm sol akciğer çıkarın ve makas ve cımbız ile doku kıyma tarafından 48-iyi plaka içinde homojenize. Dokuyu 2 mililitre sindirim tamponuna 37 derecede 60 dakika kuluçkaya yatırın. Akciğer dokusu parçalarını dikkatlice yukarı ve aşağı boruile tutarak daha fazla homojenizasyon gerçekleştirin.Kan örneklerini beş mililitrelik FACS tüpüne aktarın ve kanı iki mililitre kırmızı kan hücresi lisis tamponuyla hafifçe karıştırın. Tüpleri buza koyun ve iki mililitre buz gibi pbs ekleyerek iki dakika sonra reaksiyonu sonlandırın. Numuneyi 400 kez g'de beş dakika santrifüj edin ve süpernatant'ı atın.Daha önce açıklanan protokollere göre sonraki FACS boyama için 60 mikrolitre FACS tampon ve süreç ile hücre pelet resuspend. 400 kez g beş dakika santrifüj BAL sıvı. Supernatant aspire ve sıvı nitrojen daha fazla protein analizi için eksi 80 santigrat derece uzun süreli depolama ardından dondurmak.Bal hücreli peleti iki mililitre soğuk FACS tamponuyla yeniden askıya aldıktan sonra, süspansiyonu kılları dizginlemek için 100 mikron örgü filtre kullanarak beş mililitrelik bir FACS tüpüne aktarın. Numuneyi tekrar santrifüj ettikten sonra, 60 mikrolitre FACS tamponu ile peleti yeniden askıya alın ve daha önce açıklanan protokollere göre sonraki FACS boyama işlemi için. Şimdi, sindirilmiş sol akciğer dokusunu kümeleri çıkarmak için 100 mikronluk bir örgü filtre kullanarak beş mililitrelik bir FACS tüpüne aktarın.400 kez g beş dakika için örnek santrifüj önce buz gibi FACS tampon iki mililitre ekleyerek sindirim sürecini sonlandırın. Supernatant atın ve daha önce açıklanan protokollere göre sonraki FACS boyama için FACS tampon ve süreç 60 mikrolitre ile pelet resuspend. BIR FACS analizi için, beş mililitrelik bir tüpteki 60 mikrolitre hücreye 20 mikrolitre CD16/CD32 antikor engelleme çözeltisi ekleyin.Fc reseptörlerine immünglobulin nonspesifik bağlanmasını engellemek için 15 dakika boyunca dört santigrat derecede hücreleri kuluçkaya yatırın. Bu arada, metin protokolünde açıklandığı gibi, FACS arabellek ve antikorlar ile bir ana karışımı hazırlamak. Bloke ettikten sonra hücreleri yıkamayın.100 mikrolitrelik son hacmi elde etmek için numune başına 20 mikrolitre antikor ana karışımı ekleyin. Numuneleri karanlıkta 20 dakika boyunca 4 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Her numuneyi bir mililitre FACS tamponu ve santrifüjile yıkayın.Supernatant atın ve FACS tampon ucs ölçümleri için uygun hücre konsantrasyonu ile pelet resuspend. Son olarak, mutlak hücre numaralarını belirlemek için her örneğe ticari olarak kullanılabilen florokrom çiftli kalibrasyon boncuklarının sabit numaralarını ekleyin. Kan, BAL ve doku hücreleri için metin protokolünde gösterilen gating stratejisini kullanarak akış sitometrisi yapın.İntratrakeal instillasyondan sonra 24 ve 72 saat sonra, akciğer dokusunda TNF-alfa ekspresyonu önemli ölçüde upregulated edildi, kontrol hayvanlara göre sürekli ve 50 kat daha fazla artış ulaştı. Doku ve alveoler alana lökosit invazyonu akut akciğer hasarı gelişimi için bir özellik ve karakteristiktir. FACS analizi, 24 saat sonra kontrollere göre mutlak hücre sayısının neredeyse dokuz kat arttığı, nötrofil granülositlerin akciğer interstisyumuna önemli ölçüde infiltrasyon unu saptandı.Mutlak nötrofil granülosit sayısı 72 saat sonra biraz azalmış, ancak kontrollere göre faktör artışı devam etti. Interstisyel nötrofil granülosit infiltrasyonu ile tutarlı olarak, tüm akciğer dokusunda MMP-9 ekspresyonu da toplam gözlem süresi boyunca anlamlı olarak artmıştır. Nötrofil granülositler sadece akciğer dokusunda değil, BAL sıvısında da artmıştır.Kontrol hayvanlarına göre kat artışı akciğer dokusuna göre daha belirgindi. Alveolokapiller bariyerin ciddi bozulmasına bağlı akciğer ödemi akut akciğer hasarı gelişimi için patoognomoniktir. ELISA tarafından BAL sıvısındaki albumen içeriğinin analizi, LPS instillasyonundan 24 saat ve 72 saat sonra önemli bir bariyer fonksiyonu kaybı olduğunu ortaya koymuştur.Uygun kateter yerleşimi LPS'nin ikili aşılanması için çok önemlidir. Genellikle, öksürük veya nefes alma gibi solunum alışkanlıklarındaki değişiklikler, sıvının doğru intratrakeal aşısını gösterir. Akut akciğer hasarının indüksiyonundan sonra, ilgili araştırma sorularını yanıtlamak için FACS analizi, PCR, protein tespiti gibi sonraki adımlar yapılabilir.

Research

JoVE Journal

Medicine

Pressure Controlled Ventilation to Induce Acute Lung Injury in Mice

Farelerde Akut Akciğer Hasarı tetikleyebilecek Basınç Kontrollü Havalandırma

Murine models are extensively used to investigate acute injuries of different organs systems (1-34). Acute lung injury (ALI), which occurs with prolonged ...

Ischemia-reperfusion Model of Acute Kidney Injury and Post Injury Fibrosis in Mice

Farelerde Akut Böbrek Hasarı ve Post Yaralanma Fibrozis iskemi-reperfüzyon Model

Ischemia-reperfusion induced acute kidney injury (IR-AKI) is widely used as a model of AKI in mice, but results are often quite variable with high, often ...

Acute Brain Trauma in Mice Followed By Longitudinal Two-photon Imaging

Boyuna İki foton görüntüleme ile takip Farelerde Akut Beyin Travma

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no ...

Minimal Invasive Surgical Procedure of Inducing Myocardial Infarction in Mice

Farelerde Miyokard İnfarktüsü Oluşturan Minimal İnvaziv Cerrahi Prosedür

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last ...

Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Intubation-mediated Intratracheal IMIT Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Entübasyon-aracılı intratrakeal (IMIT) damlatma: A Noninvaziv, Lung-özel Dağıtım Sistemi

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences ...

Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research

Fare Akciğer Kanseri Araştırma Faydalı instillation ve Fiksasyon Yöntemi

The ability to instill live agents, cells, or chemicals directly into the lung without injuring or killing the mice is an important tool in lung cancer ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

Akut Akciğer Hasarı Açık Trakeostomi Gastrik Asit Aspirasyon Fare Modeli Maksimal Akut Ölümcül olmayan Akciğer Hasarı Sonuçlar

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...

A Pleural Effusion Model in Rats by Intratracheal Instillation of Polyacrylate/Nanosilica

Plevral efüzyon manken poliakrilat/Nanosilica boğaza korumak tarafından Sıçanlarda

Pleural effusion is a prevalent clinical finding of many pulmonary diseases. Having a useful animal pleural effusion model is very important to study ...

Inducing Acute Liver Injury in Rats via Carbon Tetrachloride (CCl4) Exposure Through an Orogastric Tube

Inducing Acute Liver Injury in Rats via Carbon Tetrachloride CCl4 Exposure Through an Orogastric Tube

Sıçanlarda Karbon Tetraklorür (CCl4)Orogastrik Tüp Ile Maruz Kalma Yoluyla Akut Karaciğer Hasarının Neden

Acute liver injury (ALI) plays a crucial role in the development of hepatic failure, which is characterized by severe liver dysfunction including ...

Intratracheal Instillation of Stem Cells in Term Neonatal Rats

Dönem Yenidoğan Sıçanlarda Kök Hücrelerin İntratrakeal Aşılanması

Prolonged exposure to high concentrations of oxygen leads to inflammation and acute lung injury, which is similar to human bronchopulmonary dysplasia ...