Name: optical clearing and imaging of immunolabeled kidney tissue
Uploaded: 2019-07-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue at JoVE.com

T. S. بدعم من المنح المقدمة من مؤسسة البحوث الألمانية DFG (332853055)، آخر Kröner-Fresenius-Stiftung (2015_A197)، وكلية الطب في RWTH آخن (RWTH برنامج العائدين). V. G. P. بدعم من زمالات بحثية من دويتشه جيسيلشافت فور كلورولوجي، ومؤسسة ألكسندر فون هومبولدت، والمجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية في أستراليا. D. H. E بدعم من مؤسسة LeDucq. ويتلقى ر. ك. الدعم من المنح المقدمة من وزارة المالية (KR-4073/3-1 وSCHN1188/5-1 وSFB/TRR57 وSFB/TRR219) وولاية نورثراينويستفاليا (MIWF-NRW) والمركز المتعدد التخصصات للبحوث السريرية في جامعة RWTH Aachen (O3-11).

ملاحظة: تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية الموضحة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) من جامعة أوريغون للصحة والعلوم، بورتلاند، أوريغون، الولايات المتحدة الأمريكية، والسلطات المحلية ذات الصلة في آخن، ألمانيا.
1. الرجعية البطن الأب?...

<ol>
	<li>Oh, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mesoscale+connectome+of+the+mouse+brain.">A mesoscale connectome of the mouse brain.</a> Nature. 508 (7495), 207-214 (2014).</li><li>Zhai, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+reconstruction+of+the+mouse+nephron.">3-D reconstruction of the mouse nephron.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 17 (1), 77-88 (2006).</li><li>Nyengaard, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereologic+methods+and+their+application+in+kidney+research.">Stereologic methods and their application in kidney research.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).</li><li>Puelles, V. G., Bertram, J. F., Moeller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+podocyte+depletion:+theoretical+and+practical+considerations.">Quantifying podocyte depletion: theoretical and practical considerations.</a> Cell and Tissue Research. 369 (1), 229-236 (2017).</li><li>Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=We+can+see+clearly+now:+optical+clearing+and+kidney+morphometrics.">We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).</li><li>Ariel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+tissue+clearing.">A beginner's guide to tissue clearing.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 84, 35-39 (2017).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li><li>Kuwajima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearT:+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue.">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScaleS:+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging.">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Lee, E., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACT-PRESTO:+Biological+Tissue+Clearing+and+Immunolabeling+Methods+for+Volume+Imaging.">ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).</li><li>Klingberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+Automated+Evaluation+of+Total+Glomerular+Number+and+Capillary+Tuft+Size+in+Nephritic+Kidneys+Using+Lightsheet+Microscopy.">Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).</li><li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy:+3-D+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain.">Ultramicroscopy: 3-D visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3-DISCO.">3-D imaging of solvent-cleared organs using 3-DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li><li>Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+clearing+and+dehydration+of+GFP+expressing+mouse+brains.">Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains.</a> PloS One. 7 (3), e33916 (2012).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+a+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Pan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shrinkage-mediated+imaging+of+entire+organs+and+organisms+using+uDISCO.">Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO.</a> Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).</li><li>Schwarz, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent-protein+stabilization+and+high-resolution+imaging+of+cleared,+intact+mouse+brains.">Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains.</a> PLoS ONE. 10 (5), e0124650 (2015).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+PEGASOS+method.">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method.</a> Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).</li><li>Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2,2'-thiodiethanol:+a+new+water+soluble+mounting+medium+for+high+resolution+optical+microscopy.">2,2'-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy.</a> Microscopy Research and Technique. 70 (1), 1-9 (2007).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li><li>Hua, L., Zhou, R., Thirumalai, D., Berne, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urea+denaturation+by+stronger+dispersion+interactions+with+proteins+than+water+implies+a+2-stage+unfolding.">Urea denaturation by stronger dispersion interactions with proteins than water implies a 2-stage unfolding.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (44), 16928-16933 (2008).</li><li>Wan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+seven+optical+clearing+methods+in+mouse+brain.">Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain.</a> Neurophotonics. 5 (3), 035007 (2018).</li><li>Puelles, V. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+3-D+Method+for+Counting+and+Sizing+Podocytes+in+Whole+Glomeruli.">Validation of a 3-D Method for Counting and Sizing Podocytes in Whole Glomeruli.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 27 (10), 3093-3104 (2016).</li><li>Puelles, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+3-D+analysis+using+optical+tissue+clearing+documents+the+evolution+of+murine+rapidly+progressive+glomerulonephritis.">Novel 3-D analysis using optical tissue clearing documents the evolution of murine rapidly progressive glomerulonephritis.</a> Kidney International (in press). , (2019).</li><li>Saritas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Clearing+in+the+Kidney+Reveals+Potassium-Mediated+Tubule+Remodeling.">Optical Clearing in the Kidney Reveals Potassium-Mediated Tubule Remodeling.</a> Cell Reports. 25 (10), 2668-2675 (2018).</li><li>Masselink, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+applicability+of+a+streamlined+ethyl+cinnamate-based+clearing+procedure.">Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure.</a> Development. 146 (3), (2019).</li><li>Clark, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Representation+and+relative+abundance+of+cell-type+selective+markers+in+whole-kidney+RNA-Seq+data.">Representation and relative abundance of cell-type selective markers in whole-kidney RNA-Seq data.</a> Kidney International. 95 (4), 787-796 (2019).</li><li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FDISCO:+Advanced+solvent-based+clearing+method+for+imaging+whole+organs.">FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs.</a> Science Advances. 5 (1), eaau8355 (2019).</li><li>Sylwestrak, E. L., Rajasethupathy, P., Wright, M. A., Jaffe, A., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+Intact-Tissue+Transcriptional+Analysis+at+Cellular+Resolution.">Multiplexed Intact-Tissue Transcriptional Analysis at Cellular Resolution.</a> Cell. 164 (4), 792-804 (2016).</li><li>Shah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+RNA+detection+at+depth+by+hybridization+chain+reaction+and+tissue+hydrogel+embedding+and+clearing.">Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing.</a> Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).</li><li>Gleave, J. A., Lerch, J. P., Henkelman, R. M., Nieman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+3-D+immunostaining+and+optical+imaging+of+the+mouse+brain+demonstrated+in+neural+progenitor+cells.">A method for 3-D immunostaining and optical imaging of the mouse brain demonstrated in neural progenitor cells.</a> PLoS ONE. 8 (8), e72039 (2013).</li><li>Saritas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+CUL3-mediated+ubiquitination+causes+proximal+tubule+injury+and+kidney+fibrosis.">Disruption of CUL3-mediated ubiquitination causes proximal tubule injury and kidney fibrosis.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4596 (2019).</li><li>Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+imaging+of+the+functioning+kidney.">Multiphoton imaging of the functioning kidney.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 22 (7), 1297-1304 (2011).</li><li>Holliger, P., Hudson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+antibody+fragments+and+the+rise+of+single+domains.">Engineered antibody fragments and the rise of single domains.</a> Nature Biotechnology. 23 (9), 1126-1136 (2005).</li><li>Bunka, D. H., Stockley, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers+come+of+age+-+at+last.">Aptamers come of age - at last.</a> Nature Reviews: Microbiology. 4 (8), 588-596 (2006).</li><li>Kim, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+electrotransport+selectively+enhances+the+transport+of+highly+electromobile+molecules.">Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), E6274-E6283 (2015).</li><li>Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C., Gentleman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+of+acrylamide+sodium+dodecyl+sulphate+(SDS)-based+tissue+clearing+(FASTClear):+a+novel+protocol+of+tissue+clearing+for+3-D+visualization+of+human+brain+tissues.">Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for 3-D visualization of human brain tissues.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).</li><li>Xu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+free-of-acrylamide+clearing+tissue+(FACT)-an+optimized+new+protocol+for+rapid,+high-resolution+imaging+of+3-D+brain+tissue.">Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of 3-D brain tissue.</a> Scientific Reports. 7 (1), 9895 (2017).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159 (4), 911-924 (2014).</li><li>Matryba, P., Bozycki, L., Pawlowska, M., Kaczmarek, L., Stefaniuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+perfusion-based+CUBIC+protocol+for+the+efficient+whole-body+clearing+and+imaging+of+rat+organs.">Optimized perfusion-based CUBIC protocol for the efficient whole-body clearing and imaging of rat organs.</a> Journal of Biophotonics. 11 (5), e201700248 (2018).</li></ol>

وقد حظيت تقنيات التطهير البصري باهتمام واسع النطاق للتصور ثلاثي الأبعاد والقياس الكمي للتشريح المجهري في مختلف الأجهزة. هنا، تم الجمع بين طريقة المقاصة القائمة على المذيبات (ECi) مع وضع العلامات المناعية للتصوير ثلاثي الأبعاد للأنابيب الكاملة في شرائح الكلى. هذه الطريقة بسيطة وغير مكلفة و...

وقد أدى الاهتمام المتزايد بدراسة أعضاء كاملة أو هياكل كبيرة متعددة الخلايا إلى تطوير أساليب التطهير البصري التي تنطوي على تصوير الأنسجة الشفافة في ثلاثة أبعاد. حتى وقت قريب، كانت أفضل الطرق لتقدير عدد الخلايا، وطول، أو حجم الهياكل كلها ستيريوي أو مقطع تسلسلي شامل، والذي يقوم على أخذ العينات النظامية من الأنسجة لتحليلها في وقت لاحق في بعدين1، 2 , 3- ومع ذلك، فإن هذه الأساليب تستغرق وقتاطويلا وتحتاج إلى مستوى عال من التدريب والخبرة 4. طرق المقاصة البصرية التغلب على هذه المشاكل عن طريق معادلة مؤشر الانكسار في جميع أنحاء عينة لجعل الأنسجة شفافة للتصوير 3-D5،6،7.
وقد تم تطوير عدة طرق للتطهير البصري تندرج في فئتين رئيسيتين: الأساليب القائمة على المذيبات والأساليب القائمة على مائي. يمكن تقسيم الأساليب المائية إلى غمربسيط 8،9،هايبرأوهدينغ10،11،وهيدروجيل التضمين12،13. الطرق القائمة على المذيبات تجفيف الأنسجة، وإزالة الدهون وتطبيع مؤشر الانكسار إلى قيمة حوالي 1.55. القيود المفروضة على معظم الأساليب القائمة على المذيبات هي تبريد الفلورة الذاتية من البروتينات مراسل شائعة الاستخدام مثل GFP، سمية المذيبات، والقدرة على حل الغراء المستخدمة في بعض غرف التصوير أو العدسات الموضوعية، وانكماش الأنسجة خلال الجفاف14،15،16،17،18،19،20،21. ومع ذلك، الطرق القائمة على المذيبات بسيطة، وكفاءة الوقت، ويمكن أن تعمل في عدد من أنواع الأنسجة المختلفة.
تعتمد الطرق المائية على غمر الأنسجة في الحلول المائية التي تحتوي على مؤشرات انكسار في نطاق 1.38-1.528و11و12و22و23و24 . وقد وضعت هذه الأساليب للحفاظ على انبعاث البروتين مراسل الفلورسنت الذاتية ومنع الانكماش الناجم عن الجفاف، ولكن القيود المفروضة على معظم أساليب المقاصة المائية تشمل مدة أطول من البروتوكول، وتوسيع الأنسجة، و تعديل البروتين (أي إزالة الصبغة الجزئية للبروتينات عن طريق اليوريا فيبروتوكولات ترطيب مفرط مثل ScaleA2) 7،11،23،25. تناول ScaleS توسع الأنسجة من خلال الجمع بين اليوريا مع السوربيتول، والتي توازن عن طريق الجفاف توسع الأنسجة الناجمة عن اليوريا، والحفاظ على البنية الفوقية للأنسجة كما تم تقييمها من قبل المجهر الإلكتروني10. يؤثر انكماش الأنسجة أو توسعها على الأحجام المطلقة للهياكل أو المسافات بين الكائنات أو كثافة الخلايا لكل وحدة تخزين. وبالتالي، فإن قياس التغيرات في الحجم عند إزالة الأنسجة قد يساعد على تفسير النتائج التي تم الحصول عليها7،26.
بشكل عام، يتكون بروتوكول التنظيف البصري من خطوات متعددة، بما في ذلك المعالجة المسبقة، ونفاذية، ووسم المناعة (إذا لزم الأمر)، ومطابقة مؤشر الانكسار، والتصوير مع الفحص المجهري الضوئي المتقدم (على سبيل المثال، اثنين من الفوتون، أو البؤرة، أو ضوء ورقة الفلورة المجهرية). وقد وضعت معظم نُهُج المقاصة لتصور الأنسجة العصبية، وقد أثبتت الدراسات الناشئة تطبيقها في أجهزة أخرى5. وقد ثبت من قبل هذه الأداة الشاملة للسماح بتحليل موثوق وفعال لهياكل الكلى، بما في ذلك الكلى27،28،التسلل المناعي28،الأوعية الدموية28،وشرائح الأنابيب 29، وهو نهج مثالي لتحسين فهم وظيفة الكبيبي والأنابيب إعادة عرض في الصحة والمرض.
ملخصة هنا هو طريقة تعتمد على المذيبات التي تجمع بين تلطيخ المناعة من أنابيب الكلى. التطهير البصري مع رخيصة، غير سامة، وجاهزة للاستخدام الكيميائية إيثيل سينامات (ECi)؛ والتصوير المجهري البؤري الذي يسمح بالتصور الأنبوبي الكامل والقياس الكمي. هذه الطريقة بسيطة، تجمع بين مستضد استرجاع شرائح الكلى مع تلطيخ الأجسام المضادة التجارية، ولا تتطلب معدات متخصصة، مما يجعلها في متناول معظم المختبرات.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 gauge butterfly needle</td>
			<td>Braun</td>
			<td>Venofix</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-way stopcock</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K420163-4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D analyis software</td>
			<td>Bitplane AG</td>
			<td>IMARIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D analyis software</td>
			<td>Cellprofiler</td>
			<td></td>
			<td>free open-source software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 silk suture</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18020-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml plastic syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-817-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BrdU monoclonal antibody</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11296736001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S0809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-647</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>102516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate-based antigen retrieval solution</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved hemostat</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-812-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Wash Buffer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S3006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissecting microscope</td>
			<td>Motic</td>
			<td>DSK-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding cassettes</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>E478.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl cinnamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>112372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible film/Parafilm M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-AQP2</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-9882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guinea pig anti-NKCC2</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>DOI: 10.1681/ASN.2012040404</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P074.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td>401-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemostat</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>312-471-140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>horizontal rocker</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>S2035-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging dish</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>MWI Animal Health</td>
			<td>501090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro serrefine</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18052-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors</td>
			<td>Merit</td>
			<td>97-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>O4042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-phoshoThr53-NCC</td>
			<td>PhosphoSolutions</td>
			<td>p1311-53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer</td>
			<td>World Precision Instruments Kwik-Sil</td>
			<td>KWIK-SIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue slicer</td>
			<td>Zivic Instruments</td>
			<td>HSRA001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC215682500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Lancer</td>
			<td>Series 1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>MWI Animal Health</td>
			<td>AnaSed Inj SA (Xylazine)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical clearing and imaging of immunolabeled kidney tissue

تقنيات المقاصة البصرية تجعل الأنسجة شفافة عن طريق معادلة مؤشر الانكسار في جميع أنحاء عينة للتصوير الثلاثي الأبعاد اللاحقة (3-D). وقد حظيت باهتمام كبير في جميع مجالات البحوث لإمكانية تحليل الهياكل المجهرية متعددة الخلايا التي تمتد على مسافات العيان. وبالنظر إلى أن أنابيب الكلى، والأوعية الدموية، والأعصاب، وغطاء الكلى تمتد في العديد من الاتجاهات، والتي تم التقاطها جزئيا فقط من قبل التقنيات التقليدية ثنائية الأبعاد حتى الآن، وتطهير الأنسجة فتحت أيضا العديد من المجالات الجديدة لبحوث الكلى. قائمة أساليب المقاصة البصرية تنمو بسرعة، ولكن لا يزال من الصعب للمبتدئين في هذا المجال لاختيار أفضل طريقة لسؤال بحثي معين. شريطة هنا هو طريقة بسيطة تجمع بين وضع العلامات الأجسام المضادة من شرائح الكلى الماوس سميكة. (أ) التطهير البصري باستخدام الإيثيل الإيثيلي الرخيص وغير السام والجاهزة للاستخدام؛ والتصوير البؤري. يصف هذا البروتوكول كيفية بث الكلى واستخدام خطوة استرجاع مستضد لزيادة ربط الأجسام المضادة دون الحاجة إلى معدات متخصصة. يتم عرض تطبيقه في تصوير هياكل متعددة الخلايا مختلفة داخل الكلى، ويتم معالجة كيفية استكشاف الأخطاء وإصلاحها سوء اختراق الأجسام المضادة في الأنسجة. كما نناقش الصعوبات المحتملة في تصوير الفلوروفورس الذاتية والحصول على عينات كبيرة جدا وكيفية التغلب عليها. يوفر هذا البروتوكول البسيط أداة سهلة الإعداد وشاملة لدراسة الأنسجة في ثلاثة أبعاد.

الكلى هي أعضاء معقدة تتألف من 43 أنواع الخلايا المختلفة31. معظم هذه الخلايا تشكل هياكل كبيرة متعددة الخلايا مثل الكبية والأنابيب، ووظيفتها تعتمد إلى حد كبير على التفاعلات مع بعضها البعض. الكلاسيكية 2-D التقنيات النسيجية التقاط جزئيا هذه الهياكل الكبيرة، وقد تفوت التغييرات البؤ...

Watch this Scientific Journal Video about Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue at JoVE.com

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

التطهير البصري والتصوير من أنسجة الكلى المسماة بالمناعة

يسمح الجمع بين وضع العلامات على الأجسام المضادة، والمقاصة البصرية، والفحص المجهري الضوئي المتقدم، بإجراء تحليل ثلاثي الأبعاد للهياكل أو الأجهزة الكاملة. يوصف هنا هو طريقة بسيطة للجمع بين وضع العلامات المناعية من شرائح الكلى سميكة، والمقاصة البصرية مع cinnamate إيثيل، والتصوير البؤري التي تمكن التصور والقياس الكمي للهياكل الكلوية ثلاثية الأبعاد.

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...

أدى الاهتمام المتزايد في دراسة الهياكل الكبيرة متعددة الخلايا إلى تطوير تقنية المقاصة البصرية هذه التي تسمح بالتصور ثلاثي الأبعاد والتخصيص الكمي للهياكل الكبيرة داخل الأجهزة الشفافة. يوفر هذا البروتوكول أداة بسيطة ورخيصة وسهلة الإعداد وشاملة للتحقيق في الأنسجة في ثلاثة أبعاد. لا يمكن دائماً محاكاة الطبيعة المتعددة الطبقات للمرض بواسطة التقنيات التقليدية الثنائية الأبعاد.تحليل ثلاثي الأبعاد للأنسجة يمكن أن يساعد على تشخيص أفضل ورصد المرض. لا تقتصر هذه الطريقة على أنسجة الكلى ويمكن تطبيقها على أي أنسجة طبيعية ومامراضة. هذا البروتوكول البسيط سهل المتابعة لأي عالم يتمتع ببعض الخبرة في التعامل مع الحيوانات.من المهم اختبار الأجسام المضادة المختلفة في حالة وضع علامات الأجسام المضادة الفقيرة ، وإجراء ضوابط الأجسام المضادة الثانوية فقط. ابدأ بإعداد الهيبارين الذي يحتوي على PBS و3.0٪ شبه شكلي في 1X PBS وفقًا لاتجاهات المخطوطة ونقل الحلول إلى محاقن بلاستيكية منفصلة 50 مل. Paraformaldehyde هو سام وينبغي أن تكون مستعدة في غطاء محرك الدخان.جمع وافر في الكلية وفقا لتوجيهات المخطوطة. ثم، إزالة الكبسولة وقطع الكلى إلى شرائح إكليلية سميكة واحدة مم. غمر شرائح الكلى مع محلول شبه الأشكال المعد في أنبوب مخروطي 15 مل.بعد التثبيت، وغسل شريحة الكلى مرتين مع 1X غسل العازلة لمدة ساعة واحدة على الروك الأفقي ومن ثم المضي قدما مع استرجاع المستضد. تسخين 300 مل من 1X مستضد محلول كشف في 500 مل من القارض. ثم، أرفق شريحة الكلى في شريط مضمن نفاذية إلى المخزن المؤقت الساخن وحركه لمدة ساعة واحدة عند 92 إلى 98 درجة مئوية.من المهم الحفاظ على درجة الحرارة مستقرة بين 92 و 98 درجة مئوية لهذه الخطوة استرجاع المستضد. ثم نقل شريحة إلى 10 مل من 1X غسل العازلة مع 0.1٪ تريتون X-100 والصخور بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، اغسل الشريحة مرتين بـ 10 مل من 1X الطازجة غسيل العازلة لمدة ساعة واحدة.تخفيف الجسم المضاد الأساسي في 500 ميكرولترات من ذوبان الأجسام المضادة الطبيعية. صخرة بلطف شريحة الكلى في الجسم المضاد الأولية المخففة لمدة أربعة أيام في 37 درجة مئوية. بعد الحضانة، وغسل شريحة الكلى في 10 مل من 1X غسل العازلة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة، وتغيير العازلة مرة واحدة بعد ثماني ساعات.تمييع الأجسام المضادة الثانوية في 500 ميكرولترات من الجسم المضاد الطبيعي diluent واحتضان مع شريحة الكلى لمدة أربعة أيام في 37 درجة مئوية. يرجى ملاحظة أنه من هذه الخطوة إلى الأمام، يجب حماية شريحة الكلى من الضوء. بعد الحضانة مع الأجسام المضادة الثانوية، وغسل شريحة الكلى في 10 مل من 1X غسل العازلة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.لتجفيف شريحة الكلى، ونقلها إلى خمسة مل من درجة عالية 100٪ الإيثانول والصخر لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة، ومنعش الإيثانول بعد ساعة واحدة. تزج شريحة الكلى في اثنين من مل من cinnamate الإيثيل والصخور بلطف بين عشية وضحاها. عندما تكون جاهزة لتصوير الأنسجة، إضافة 600 إلى 1000 ميكرولتر من cinnamate الإيثيل في طبق الزجاج القاع ونقل شريحة الكلى في الطبق.وضع زلة غلاف مستديرة على شريحة الكلى وختم الطبق مع فيلم البارافين. ضع الطبق على منصة التصوير المجهرية وصور الأنسجة وفقًا لاتجاهات المخطوطة. وقد استخدم هذا البروتوكول بنجاح لإجراء تحليل 3D على أنسجة الكلى وتقييم وظائف الخلية والتفاعلات.قد تسبب هذه الطريقة في إخماد مراسل الفلورسنت ولكن البروتينات الفلورية القوية الأخرى قد تقاوم إخماد الإشارة. يمكن أن يحسن الإسراف الأبهري في البطن انتشار الأجسام المضادة. في بعض الحالات، يؤدي ضعف اختراق الأجسام المضادة إلى إشارة سطحية.ويمكن تصحيح هذا مع تركيزات أعلى أو تجديد الأجسام المضادة. وينبغي النظر في التسليم داخل الأوعية الدموية إذا تم التعبير عن المستضد من الفائدة في الأوعية الدموية في الكلى. ومع ذلك، الأجسام المضادة التي تستهدف البروتينات في الغشاء apical من الخلايا الظهارية tubule لا تعبر حاجز الترشيح الكبيبي وتسبب إشارات غير محددة.يمكن أن تكون تسمية الأنسجة مع الأجسام المضادة للكشف عن مجموعة خلايا محددة أو لتصور شرائح الأنبوب كله. وعلاوة على ذلك، يمكن تحقيق التكلس من البروتينات في 3D عن طريق الجمع بين الأجسام المضادة متعددة. من المهم أن نتذكر أن وضع العلامات على الأجسام المضادة يمكن تحسينه مع وفرة جيدة في الكلى ، واستخدام خطوة استرجاع المستضد ، وتركيز الأجسام المضادة العالية.قد تقاوم بعض البروتينات المراسل قوية إخماد إشارة الفلورسنت بعد هذا البروتوكول. لاختبار هذا، تخطي استرداد المستضد وخطوات وضع العلامات المضادة. هذه التقنية تحترم طبيعة ثلاثية الأبعاد من الهياكل ويفتح مجالات جديدة كثيرة للبحث.وهو يلغي الافتراضات والتداخلات المطلوبة المرتبطة بالتحليل التقليدي ثنائي الأبعاد.

Research

JoVE Journal

Medicine

Dual-mode Imaging of Cutaneous Tissue Oxygenation and Vascular Function

وضع مزدوج تصوير الأنسجة الجلدية الأكسجة وظيفة الأوعية الدموية

Accurate assessment of cutaneous tissue oxygenation and vascular function is important for appropriate detection, staging, and treatment of many health ...

Non-invasive Optical Measurement of Cerebral Metabolism and Hemodynamics in Infants

غير الغازية قياس بصري من الأيض الدماغي وديناميكا الدم في الأطفال الرضع

Perinatal brain injury remains a significant cause of infant mortality  and morbidity, but there is not yet an effective bedside tool that can  accurately ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

في فيفو التصوير الضوئي من أورام الدماغ والتهاب المفاصل عن طريق نيون SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Cerenkov Luminescence Imaging of Interscapular Brown Adipose Tissue

كيرينكوف التلألؤ التصوير من الأنسجة الدهنية بين الكتفين براون

Brown adipose tissue (BAT), widely known as a &#8220;good fat&#8221; plays pivotal roles for thermogenesis in mammals. This special tissue is closely ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

روز البنغال Photothrombosis بواسطة التصوير الضوئي متحد البؤر<em&gt; في فيفو</em&gt;: نموذج لسفينة واحدة السكتة الدماغية

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Murine Kidney Transplant Technique

الكلى الفئران زرع تقنية

The first mouse kidney transplant technique was published in 19731 by the Russell laboratory. Although it took some years for other labs to become ...

3D Ultrasound Imaging: Fast and Cost-effective Morphometry of Musculoskeletal Tissue

التصوير بالموجات فوق الصوتية ثلاثية الأبعاد: مورفوميتري سريعة وفعالة من حيث التكلفة لانسجة العضلات والعظام

The developmental goal of 3D ultrasound imaging (3DUS) is to engineer a modality to perform 3D morphological ultrasound analysis of human muscles. 3DUS ...

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

الجسم كله والإقليمية الكمي لنشاط الإنسان براون الأنسجة الدهنية باستخدام 18وفدج PET/CT

In endothermic animals, brown adipose tissue (BAT) is activated to produce heat for defending body temperature in response to cold. BAT&#39;s ability to ...

Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation

الكشف على أساس الصفائح الدموية من أكسيد النيتريك في الدم عن طريق قياس الفسفرة بسب

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent ...

Nanoscopic Imaging of Human Tissue Sections via Physical and Isotropic Expansion

التصوير النانوسكوبي لأقسام الأنسجة البشرية عن طريق التوسع البدني والنظائري

In modern pathology, optical microscopy plays an important role in disease diagnosis by revealing microscopic structures of clinical specimens. However, ...