Name: optical clearing and imaging of immunolabeled kidney tissue
Uploaded: 2019-07-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue at JoVE.com

T. S. wordt ondersteund door subsidies van de DFG German Research Foundation (332853055), else Kröner-Fresenius-Stiftung (2015_A197), en de medische faculteit van de RWTH Aachen (RWTH returner programma). V. G. P. wordt ondersteund door onderzoeksbeurzen van de Deutsche Gesellschaft fur Nefrologie, de Alexander von Humboldt Foundation en de National Health and Medical Research Council van Australië. D. H. E wordt ondersteund door Fondation LeDucq. R. K. wordt ondersteund door subsidies van de DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), de staat Northrhinewestfalia (MIWF-NRW) en het Interdisciplinair Centrum voor klinisch onderzoek aan de RWTH Aachen University (O3-11).

Opmerking: Alle hier beschreven experimentele procedures werden goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van Oregon Health and Science University, Portland, Oregon, VS, en relevante lokale autoriteiten in Aken, Duitsland.
1. Retrograde abdominale aorta perfusie en fixatie van muis nieren
<ol><li>Bereid oplossingen op dezelfde dag of avond voor en bewaar in een koelkast 's nachts. Warme oplossingen voor het gebruik van kamertemperatuur (RT).<...

<ol>
	<li>Oh, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mesoscale+connectome+of+the+mouse+brain.">A mesoscale connectome of the mouse brain.</a> Nature. 508 (7495), 207-214 (2014).</li><li>Zhai, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+reconstruction+of+the+mouse+nephron.">3-D reconstruction of the mouse nephron.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 17 (1), 77-88 (2006).</li><li>Nyengaard, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereologic+methods+and+their+application+in+kidney+research.">Stereologic methods and their application in kidney research.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).</li><li>Puelles, V. G., Bertram, J. F., Moeller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+podocyte+depletion:+theoretical+and+practical+considerations.">Quantifying podocyte depletion: theoretical and practical considerations.</a> Cell and Tissue Research. 369 (1), 229-236 (2017).</li><li>Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=We+can+see+clearly+now:+optical+clearing+and+kidney+morphometrics.">We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).</li><li>Ariel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+tissue+clearing.">A beginner's guide to tissue clearing.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 84, 35-39 (2017).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li><li>Kuwajima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearT:+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue.">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScaleS:+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging.">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Lee, E., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACT-PRESTO:+Biological+Tissue+Clearing+and+Immunolabeling+Methods+for+Volume+Imaging.">ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).</li><li>Klingberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+Automated+Evaluation+of+Total+Glomerular+Number+and+Capillary+Tuft+Size+in+Nephritic+Kidneys+Using+Lightsheet+Microscopy.">Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).</li><li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy:+3-D+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain.">Ultramicroscopy: 3-D visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3-DISCO.">3-D imaging of solvent-cleared organs using 3-DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li><li>Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+clearing+and+dehydration+of+GFP+expressing+mouse+brains.">Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains.</a> PloS One. 7 (3), e33916 (2012).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+a+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Pan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shrinkage-mediated+imaging+of+entire+organs+and+organisms+using+uDISCO.">Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO.</a> Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).</li><li>Schwarz, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent-protein+stabilization+and+high-resolution+imaging+of+cleared,+intact+mouse+brains.">Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains.</a> PLoS ONE. 10 (5), e0124650 (2015).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+PEGASOS+method.">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method.</a> Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).</li><li>Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2,2'-thiodiethanol:+a+new+water+soluble+mounting+medium+for+high+resolution+optical+microscopy.">2,2'-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy.</a> Microscopy Research and Technique. 70 (1), 1-9 (2007).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li><li>Hua, L., Zhou, R., Thirumalai, D., Berne, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urea+denaturation+by+stronger+dispersion+interactions+with+proteins+than+water+implies+a+2-stage+unfolding.">Urea denaturation by stronger dispersion interactions with proteins than water implies a 2-stage unfolding.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (44), 16928-16933 (2008).</li><li>Wan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+seven+optical+clearing+methods+in+mouse+brain.">Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain.</a> Neurophotonics. 5 (3), 035007 (2018).</li><li>Puelles, V. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+3-D+Method+for+Counting+and+Sizing+Podocytes+in+Whole+Glomeruli.">Validation of a 3-D Method for Counting and Sizing Podocytes in Whole Glomeruli.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 27 (10), 3093-3104 (2016).</li><li>Puelles, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+3-D+analysis+using+optical+tissue+clearing+documents+the+evolution+of+murine+rapidly+progressive+glomerulonephritis.">Novel 3-D analysis using optical tissue clearing documents the evolution of murine rapidly progressive glomerulonephritis.</a> Kidney International (in press). , (2019).</li><li>Saritas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Clearing+in+the+Kidney+Reveals+Potassium-Mediated+Tubule+Remodeling.">Optical Clearing in the Kidney Reveals Potassium-Mediated Tubule Remodeling.</a> Cell Reports. 25 (10), 2668-2675 (2018).</li><li>Masselink, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+applicability+of+a+streamlined+ethyl+cinnamate-based+clearing+procedure.">Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure.</a> Development. 146 (3), (2019).</li><li>Clark, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Representation+and+relative+abundance+of+cell-type+selective+markers+in+whole-kidney+RNA-Seq+data.">Representation and relative abundance of cell-type selective markers in whole-kidney RNA-Seq data.</a> Kidney International. 95 (4), 787-796 (2019).</li><li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FDISCO:+Advanced+solvent-based+clearing+method+for+imaging+whole+organs.">FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs.</a> Science Advances. 5 (1), eaau8355 (2019).</li><li>Sylwestrak, E. L., Rajasethupathy, P., Wright, M. A., Jaffe, A., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+Intact-Tissue+Transcriptional+Analysis+at+Cellular+Resolution.">Multiplexed Intact-Tissue Transcriptional Analysis at Cellular Resolution.</a> Cell. 164 (4), 792-804 (2016).</li><li>Shah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+RNA+detection+at+depth+by+hybridization+chain+reaction+and+tissue+hydrogel+embedding+and+clearing.">Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing.</a> Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).</li><li>Gleave, J. A., Lerch, J. P., Henkelman, R. M., Nieman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+3-D+immunostaining+and+optical+imaging+of+the+mouse+brain+demonstrated+in+neural+progenitor+cells.">A method for 3-D immunostaining and optical imaging of the mouse brain demonstrated in neural progenitor cells.</a> PLoS ONE. 8 (8), e72039 (2013).</li><li>Saritas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+CUL3-mediated+ubiquitination+causes+proximal+tubule+injury+and+kidney+fibrosis.">Disruption of CUL3-mediated ubiquitination causes proximal tubule injury and kidney fibrosis.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4596 (2019).</li><li>Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+imaging+of+the+functioning+kidney.">Multiphoton imaging of the functioning kidney.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 22 (7), 1297-1304 (2011).</li><li>Holliger, P., Hudson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+antibody+fragments+and+the+rise+of+single+domains.">Engineered antibody fragments and the rise of single domains.</a> Nature Biotechnology. 23 (9), 1126-1136 (2005).</li><li>Bunka, D. H., Stockley, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers+come+of+age+-+at+last.">Aptamers come of age - at last.</a> Nature Reviews: Microbiology. 4 (8), 588-596 (2006).</li><li>Kim, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+electrotransport+selectively+enhances+the+transport+of+highly+electromobile+molecules.">Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), E6274-E6283 (2015).</li><li>Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C., Gentleman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+of+acrylamide+sodium+dodecyl+sulphate+(SDS)-based+tissue+clearing+(FASTClear):+a+novel+protocol+of+tissue+clearing+for+3-D+visualization+of+human+brain+tissues.">Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for 3-D visualization of human brain tissues.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).</li><li>Xu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+free-of-acrylamide+clearing+tissue+(FACT)-an+optimized+new+protocol+for+rapid,+high-resolution+imaging+of+3-D+brain+tissue.">Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of 3-D brain tissue.</a> Scientific Reports. 7 (1), 9895 (2017).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159 (4), 911-924 (2014).</li><li>Matryba, P., Bozycki, L., Pawlowska, M., Kaczmarek, L., Stefaniuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+perfusion-based+CUBIC+protocol+for+the+efficient+whole-body+clearing+and+imaging+of+rat+organs.">Optimized perfusion-based CUBIC protocol for the efficient whole-body clearing and imaging of rat organs.</a> Journal of Biophotonics. 11 (5), e201700248 (2018).</li></ol>

Optische clearing technieken hebben brede aandacht gekregen voor 3D-visualisatie en kwantificering van micro anatomie in verschillende organen. Hier werd solvent gebaseerde clearing Method (ECi) gecombineerd met immunolabeling voor 3D-beeldvorming van hele tubuli in nierschijfjes. Deze methode is eenvoudig, goedkoop en snel. Andere onderzoeksvragen kunnen echter het best worden beantwoord met andere clearing protocols5. Het is ook belangrijk om in gedachten te houden dat op oplosmiddel gebaseerde ...

De groeiende belangstelling voor het bestuderen van hele organen of grote multicellulaire structuren hebben geleid tot de ontwikkeling van optische clearing methoden die betrekking hebben op Imaging van transparante weefsel in drie dimensies. Tot voor kort waren de beste methoden om het aantal cellen, de lengte of het volume van hele structuren te schatten stereologie of uitputtende seriële snede, die is gebaseerd op de systemische bemonstering van weefsel voor latere analyse in twee dimensies1, 2 , 3. deze methoden zijn echter tijdrovend en hebben behoefte aan een hoog niveau van opleiding en expertise4. Optische clearing methoden overwinnen deze problemen door het evenwicht van de brekingsindex in een monster te maken van weefsel doorschijnend voor 3D-beeldvorming5,6,7.
Er zijn verschillende optische clearing methoden ontwikkeld die in twee hoofdcategorieën vallen: op oplosmiddel gebaseerde en waterige methoden. Waterige methoden kunnen verder worden onderverdeeld in eenvoudige onderdompeling van8,9, hyperhydratatie10,11, en hydrogel insluiten12,13. Oplosmiddel gebaseerde methoden dehydraat het weefsel, verwijderen lipiden en normaliseren de brekingsindex tot een waarde rond 1,55. Beperkingen van de meeste op oplosmiddelen gebaseerde methoden zijn het afschrikken van endogene fluorescentie van veelgebruikte reporter eiwitten zoals GFP, oplosmiddel toxiciteit, capaciteit om lijm op te lossen die wordt gebruikt in sommige beeldvormings kamers of objectieve lenzen, en krimp van weefsel tijdens Dehydratie14,15,16,17,18,19,20,21. Oplosmiddel gebaseerde methoden zijn echter eenvoudig, tijdbesparend en kunnen in een aantal verschillende weefsel typen werken.
Waterige methoden zijn afhankelijk van de onderdompeling van het weefsel in waterige oplossingen die brekingsindices hebben in het bereik van 1,38-1.528,11,12,22,23,24 . Deze methoden werden ontwikkeld om endogene fluorescerende reporter eiwit emissie te behouden en uitdroging veroorzaakte krimp te voorkomen, maar beperkingen van de meeste waterige gebaseerde clearing methoden omvatten een langere duur van het Protocol, weefsel uitbreiding, en eiwit modificatie (d.w.z. partiële denaturatie van eiwitten door ureum in hyperhydrerende protocollen zoals SCALea2)7,11,23,25. SCALeS gericht weefsel uitbreiding door het combineren van ureum met sorbitol, die tegenwicht door uitdroging van de ureum-geïnduceerde weefsel expansie, en behouden van de weefsel ultrastructuur zoals geëvalueerd door elektronenmicroscopie10. Weefsel krimp of-expansie beïnvloedt de absolute afmetingen van structuren, afstanden tussen objecten of celdichtheid per volume; Zo kan de meting van de grootte veranderingen bij het opruimen van het weefsel helpen bij het interpreteren van de verkregen resultaten7,26.
In het algemeen bestaat een protocol voor optische clearing uit meerdere stappen, waaronder voor behandeling, permeisatie, immunolabeling (indien nodig), brekingsindex matching en beeldvorming met geavanceerde Lichtmicroscopie (bijv. twee-foon, confocale of fluorescentiemicroscopie van licht blad). De meeste van de clearing benaderingen zijn ontwikkeld om neuronale weefsel te visualiseren, en opkomende studies hebben hun toepassing in andere organen5gevalideerd. Deze uitgebreide tool is eerder aangetoond dat het mogelijk maakt betrouwbare en efficiënte analyse van nierstructuren, met inbegrip van glomeruli27,28, immuun infiltraten28, therapieën28, en tubulus segmenten 29, en het is een ideale benadering om beter begrip van glomerulaire functie en tubulus remodellering in gezondheid en ziekte.
Samengevat hier is een oplosmiddel gebaseerde methode die immunokleuring van niertubuli combineert; optische clearing met goedkope, niet-toxisch en gebruiksklaar chemisch ethyl CINNAMAAT (EBI); en confocale microscopie beeldvorming die volledige tubulus visualisatie en kwantificering mogelijk maakt. Deze methode is eenvoudig, combineert antigeen-opvraging van nierschijfjes met kleuring van commerciële antilichamen, en vereist geen gespecialiseerde apparatuur, waardoor het toegankelijk is voor de meeste laboratoria.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 gauge butterfly needle</td>
			<td>Braun</td>
			<td>Venofix</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-way stopcock</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K420163-4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D analyis software</td>
			<td>Bitplane AG</td>
			<td>IMARIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D analyis software</td>
			<td>Cellprofiler</td>
			<td></td>
			<td>free open-source software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 silk suture</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18020-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml plastic syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-817-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BrdU monoclonal antibody</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11296736001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S0809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-647</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>102516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate-based antigen retrieval solution</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved hemostat</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-812-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Wash Buffer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S3006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissecting microscope</td>
			<td>Motic</td>
			<td>DSK-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding cassettes</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>E478.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl cinnamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>112372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible film/Parafilm M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-AQP2</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-9882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guinea pig anti-NKCC2</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>DOI: 10.1681/ASN.2012040404</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P074.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td>401-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemostat</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>312-471-140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>horizontal rocker</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>S2035-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging dish</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>MWI Animal Health</td>
			<td>501090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro serrefine</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18052-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors</td>
			<td>Merit</td>
			<td>97-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>O4042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-phoshoThr53-NCC</td>
			<td>PhosphoSolutions</td>
			<td>p1311-53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer</td>
			<td>World Precision Instruments Kwik-Sil</td>
			<td>KWIK-SIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue slicer</td>
			<td>Zivic Instruments</td>
			<td>HSRA001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC215682500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Lancer</td>
			<td>Series 1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>MWI Animal Health</td>
			<td>AnaSed Inj SA (Xylazine)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical clearing and imaging of immunolabeled kidney tissue

Optische clearing technieken maken weefsel doorzichtig door de brekingsindex in een steekproef te equilibreren voor daaropvolgende driedimensionale (3-D) beeldvorming. Ze hebben veel aandacht gekregen in alle onderzoeksgebieden voor het potentieel om microscopische multicellulaire structuren te analyseren die zich uitstrekken over macroscopische afstanden. Gezien het feit dat nierbuisjes, vasculatuur, zenuwen en glomeruli zich in vele richtingen uitstrekken, die tot nu toe slechts gedeeltelijk zijn gevangen door traditionele tweedimensionale technieken, opende weefsel clearing ook veel nieuwe gebieden van nieronderzoek. De lijst van optische clearing methoden groeit snel, maar het blijft moeilijk voor beginners op dit gebied om de beste methode voor een bepaalde onderzoeksvraag te kiezen. Voorzien hier is een eenvoudige methode die antilichamen labelen van dikke muis nierschijfjes combineert; optische clearing met goedkope, niet-toxisch en kant-en-klare chemisch ethyl CINNAMAAT; en confocale beeldvorming. Dit protocol beschrijft hoe de nieren te parfuseren en een antigeen-ophaal stap te gebruiken om antilichaam binding te verhogen zonder gespecialiseerde apparatuur te vereisen. De toepassing wordt gepresenteerd in beeldvorming verschillende multicellulaire structuren binnen de nier, en hoe u problemen met slechte antilichamen penetratie in weefsel wordt aangepakt. We bespreken ook de potentiële moeilijkheden van het beeldvormende endogene fluor en het verwerven van zeer grote monsters en hoe ze te overwinnen. Dit eenvoudige protocol biedt een eenvoudig te installeren en uitgebreid hulpmiddel om weefsel in drie dimensies te bestuderen.

Nieren zijn complexe organen bestaat uit 43 verschillende celtypen31. De meeste van deze cellen vormen grote multicellulaire structuren zoals glomeruli en tubuli, en hun functie is sterk afhankelijk van interacties met elkaar. Klassieke 2-D histologische technieken vangen deze grote structuren gedeeltelijk op en kunnen de focale veranderingen binnen intacte structuren missen31. Dus, 3D-analyse met behulp van optische clearing technieken helpt om te begrijpen hoe ze function...

Watch this Scientific Journal Video about Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue at JoVE.com

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

Optische clearing en beeldvorming van Immunolabeled nierweefsel

De combinatie van antilichaam etikettering, optische clearing en geavanceerde Lichtmicroscopie maakt een driedimensionale analyse van complete structuren of organen mogelijk. Hier beschreven is een eenvoudige methode om immunolabeling van dikke nierschijfjes te combineren, optische clearing met ethyl CINNAMAAT, en confocale beeldvorming die visualisatie en kwantificering van driedimensionale nierstructuren mogelijk maakt.

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...

Groeiende interesse in het bestuderen van grote, multicellulaire structuren leidde tot de ontwikkeling van deze optische clearing techniek die het mogelijk maakt voor een driedimensionale visualisatie en kwantificering van grote structuren binnen transparante organen. Dit protocol biedt een eenvoudige, goedkope, eenvoudig op te zetten en uitgebreide tool om weefsel in drie dimensies te onderzoeken. Meerlaagse aard van een ziekte kan niet altijd worden gesimuleerd door traditionele tweedimensionale technieken.Driedimensionale analyse van weefsel kan helpen om ziekte beter te diagnosticeren en te monitoren. Deze methode is niet beperkt tot nierweefsel en kan worden toegepast op een normaal en ziek weefsel. Dit eenvoudige protocol is gemakkelijk te volgen voor elke wetenschapper met enige ervaring in dierbehandeling.Het is belangrijk om verschillende antilichamen te testen in het geval van slechte antilichaam etikettering, en uitvoeren secundaire antilichaam alleen controles. Begin met het voorbereiden van heparine met PBS en 3,0% paraformaldehyde in 1X PBS volgens de handschriftaanwijzingen en het overbrengen van de oplossingen in afzonderlijke 50 mL plastic spuiten. Paraformaldehyde is giftig en moet worden voorbereid in de rookkap.Verzamel en overvloedig de nier volgens het manuscript aanwijzingen. Verwijder vervolgens de capsule en snijd de nier in een mm dikke coronale plakjes. Dompel de nierplakjes onder met de geprepareerde paraformaldehydeoplossing in een conische buis van 15 mL.Na fixatie, was de nier slice twee keer met 1X wasbuffer voor een uur op een horizontale tuimelschakelaar en ga dan verder met antigeen ophalen. Verwarm 300 mL 1X antigeen ontmaskeringsoplossing in een bekerglas van 500 mL. Sluit vervolgens een nierschijfje in een inbeddingscassette die doorlaat aan de verwarmde buffer en roer deze gedurende een uur op 92 tot 98 graden Celsius.Het is belangrijk om de temperatuur stabiel te houden tussen 92 en 98 graden Celsius voor deze antigeen retrieval stap. Breng het segment vervolgens over in 10 mL 1X wasbuffer met 0,1%Triton X-100 en rock het 's nachts. De volgende dag was je de schijf twee keer met 10 mL verse 1X wasbuffer gedurende een uur.Verdun het primaire antilichaam in 500 microliter van normaal antilichaamverdunningsmezzo. Wieg het niersegment zachtjes in verdund primair antilichaam gedurende vier dagen bij 37 graden Celsius. Na de incubatie was je de nierschijf 's nachts in 10 mL 1X wasbuffer bij kamertemperatuur en verander je de buffer eenmaal na acht uur.Verdun de secundaire antilichamen in 500 microliter van normaal antilichaamverdunningsmezzo en incubeer met de nierschijf gedurende vier dagen bij 37 graden Celsius. Houd er rekening mee dat vanaf deze stap naar voren, de nier slice moet worden beschermd tegen licht. Na incubatie met secundaire antilichamen, was de nierschijf in 10 mL 1X wasbuffer 's nachts bij kamertemperatuur.Om de nier schijf te dehydrateren, breng het naar vijf mL van hoge kwaliteit 100%ethanol en rock het voor twee uur bij kamertemperatuur, verfrissende de ethanol na een uur. Dompel de nierschijf onder in twee mL ethylcinnamaat en rock zachtjes 's nachts. Wanneer klaar om het weefsel beeld, voeg 600 tot 1000 microliter ethylcinnamaat in een glazen bodem schotel en breng de nier plak in de schotel.Plaats een ronde deksel slip op de nier slice en verzegel de schotel met paraffine film. Plaats de schotel op de microscoop beeldvorming platform en beeld het weefsel volgens het manuscript richtingen. Dit protocol is gebruikt om succesvol uit te voeren 3D-analyse op nierweefsel en celfuncties en interacties te evalueren.De methode kan leiden tot fluorescerende verslaggever blussen, maar andere sterke tl-eiwitten kunnen weerstaan signaal blussen. Abdominale aorta-overvloed kan de verspreiding van antilichamen verbeteren. In sommige gevallen resulteert een slechte penetratie van antilichamen in een oppervlakkig signaal.Dit kan worden gecorrigeerd met hogere concentraties of aanvulling van antilichaam. Intravasculaire levering moet worden overwogen als het antigeen van belang wordt uitgedrukt in niervaculatuur. Echter, antilichamen gericht op eiwitten in het apicale membraan van tubule epitheelcellen niet over de glomerulaire filtratie barrière en veroorzaken niet-specifieke signalen.Het weefsel kan worden gelabeld met de antilichamen om een specifieke celpopulatie te detecteren of om hele tubulesegmenten te visualiseren. Bovendien kan colocalisatie van eiwitten in 3D worden bereikt door meerdere antilichamen te combineren. Het is belangrijk om te onthouden dat de antilichaam etikettering kan worden verbeterd met een goede nier-profusie, het gebruik van antigeen retrieval stap, en een hoge concentratie van antilichamen.Sommige sterke reporter eiwitten kunnen weerstaan blussen van fluorescerend signaal volgens dit protocol. Om dit te testen, sla je de stappen voor het terughalen van antigeen en antilichamen over. Deze techniek respecteert het driedimensionale karakter van structuren en opent veel nieuwe onderzoeksgebieden.Het elimineert een vereiste veronderstellingen en interferenties in verband met traditionele tweedimensionale analyse.

Research

JoVE Journal

Medicine

Dual-mode Imaging of Cutaneous Tissue Oxygenation and Vascular Function

Dual-mode beeldvorming van Cutane zuurstofvoorziening van de weefsels en de vaatfunctie

Accurate assessment of cutaneous tissue oxygenation and vascular function is important for appropriate detection, staging, and treatment of many health ...

Non-invasive Optical Measurement of Cerebral Metabolism and Hemodynamics in Infants

Niet-invasieve optische meting van Cerebral Metabolisme en Hemodynamica bij zuigelingen

Perinatal brain injury remains a significant cause of infant mortality  and morbidity, but there is not yet an effective bedside tool that can  accurately ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

In vivo optische beeldvorming van hersentumoren en artritis met fluorescerende SAPC-DOPS nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Cerenkov Luminescence Imaging of Interscapular Brown Adipose Tissue

Cerenkov luminescentiebeeldvorming van interscapular Brown VetWeefsel

Brown adipose tissue (BAT), widely known as a &#8220;good fat&#8221; plays pivotal roles for thermogenesis in mammals. This special tissue is closely ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Rose Bengal Photothrombosis door confocale Optical Imaging<em&gt; In Vivo</em&gt;: Een model van de Single Vessel Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Murine Kidney Transplant Technique

Muizen Niertransplantatie Techniek

The first mouse kidney transplant technique was published in 19731 by the Russell laboratory. Although it took some years for other labs to become ...

3D Ultrasound Imaging: Fast and Cost-effective Morphometry of Musculoskeletal Tissue

3D echografie Imaging: snelle en rendabele Morphometry van Musculoskeletal Tissue

The developmental goal of 3D ultrasound imaging (3DUS) is to engineer a modality to perform 3D morphological ultrasound analysis of human muscles. 3DUS ...

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

Hele lichaam en regionale kwantificering van actieve mens bruin vetweefsel met 18F-FDG PET/CT

In endothermic animals, brown adipose tissue (BAT) is activated to produce heat for defending body temperature in response to cold. BAT&#39;s ability to ...

Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation

Bloedplaatjes gebaseerde detectie van stikstofmonoxide in bloed door het meten van VASP fosforylatie

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent ...

Nanoscopic Imaging of Human Tissue Sections via Physical and Isotropic Expansion

Nanoscopische beeldvorming van menselijke weefsel secties via fysische en isotrope expansie

In modern pathology, optical microscopy plays an important role in disease diagnosis by revealing microscopic structures of clinical specimens. However, ...