Name: optical clearing and imaging of immunolabeled kidney tissue
Uploaded: 2019-07-22T14:00:00
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T. S. est soutenu par des subventions de la DFG German Research Foundation (332853055), else Kr'ner-Fresenius-Stiftung (2015-A197), et de la Faculté de médecine de la RWTH Aachen (RWTH Returner Program). V. G. P. est soutenu par des bourses de recherche de la Deutsche Gesellschaft fourrure Nephrologie, la Fondation Alexander von Humboldt, et le National Health and Medical Research Council of Australia. D. H. E est soutenu par la Fondation LeDucq. R. K. est soutenu par des subventions du DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), de l'État de Northrhinewestfalia (MIWF-NRW) et du Centre interdisciplinaire de recherche clinique de l'Université RWTH Dachen (O3-11).

REMARQUE: Toutes les procédures expérimentales décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'Oregon Health and Science University, Portland, Oregon, États-Unis, et les autorités locales compétentes à Aix-la-Chapelle, en Allemagne.
1. Perfusion aortique abdominale rétrograde et fixation des reins de souris
<ol><li>Préparer les solutions le même jour ou le soir avant et conserver dans un réfrigér...

<ol>
	<li>Oh, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mesoscale+connectome+of+the+mouse+brain.">A mesoscale connectome of the mouse brain.</a> Nature. 508 (7495), 207-214 (2014).</li><li>Zhai, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+reconstruction+of+the+mouse+nephron.">3-D reconstruction of the mouse nephron.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 17 (1), 77-88 (2006).</li><li>Nyengaard, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereologic+methods+and+their+application+in+kidney+research.">Stereologic methods and their application in kidney research.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).</li><li>Puelles, V. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=We+can+see+clearly+now:+optical+clearing+and+kidney+morphometrics.">We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).</li><li>Ariel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+tissue+clearing.">A beginner's guide to tissue clearing.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 84, 35-39 (2017).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li><li>Kuwajima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearT:+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue.">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScaleS:+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging.">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Lee, E., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACT-PRESTO:+Biological+Tissue+Clearing+and+Immunolabeling+Methods+for+Volume+Imaging.">ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).</li><li>Klingberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+Automated+Evaluation+of+Total+Glomerular+Number+and+Capillary+Tuft+Size+in+Nephritic+Kidneys+Using+Lightsheet+Microscopy.">Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).</li><li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy:+3-D+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain.">Ultramicroscopy: 3-D visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3-DISCO.">3-D imaging of solvent-cleared organs using 3-DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li><li>Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+clearing+and+dehydration+of+GFP+expressing+mouse+brains.">Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains.</a> PloS One. 7 (3), e33916 (2012).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+a+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Pan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shrinkage-mediated+imaging+of+entire+organs+and+organisms+using+uDISCO.">Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO.</a> Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).</li><li>Schwarz, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent-protein+stabilization+and+high-resolution+imaging+of+cleared,+intact+mouse+brains.">Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains.</a> PLoS ONE. 10 (5), e0124650 (2015).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+PEGASOS+method.">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method.</a> Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).</li><li>Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2,2'-thiodiethanol:+a+new+water+soluble+mounting+medium+for+high+resolution+optical+microscopy.">2,2'-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy.</a> Microscopy Research and Technique. 70 (1), 1-9 (2007).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li><li>Hua, L., Zhou, R., Thirumalai, D., Berne, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urea+denaturation+by+stronger+dispersion+interactions+with+proteins+than+water+implies+a+2-stage+unfolding.">Urea denaturation by stronger dispersion interactions with proteins than water implies a 2-stage unfolding.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (44), 16928-16933 (2008).</li><li>Wan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+seven+optical+clearing+methods+in+mouse+brain.">Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain.</a> Neurophotonics. 5 (3), 035007 (2018).</li><li>Puelles, V. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+3-D+Method+for+Counting+and+Sizing+Podocytes+in+Whole+Glomeruli.">Validation of a 3-D Method for Counting and Sizing Podocytes in Whole Glomeruli.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 27 (10), 3093-3104 (2016).</li><li>Puelles, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+3-D+analysis+using+optical+tissue+clearing+documents+the+evolution+of+murine+rapidly+progressive+glomerulonephritis.">Novel 3-D analysis using optical tissue clearing documents the evolution of murine rapidly progressive glomerulonephritis.</a> Kidney International (in press). , (2019).</li><li>Saritas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Clearing+in+the+Kidney+Reveals+Potassium-Mediated+Tubule+Remodeling.">Optical Clearing in the Kidney Reveals Potassium-Mediated Tubule Remodeling.</a> Cell Reports. 25 (10), 2668-2675 (2018).</li><li>Masselink, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+applicability+of+a+streamlined+ethyl+cinnamate-based+clearing+procedure.">Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure.</a> Development. 146 (3), (2019).</li><li>Clark, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Representation+and+relative+abundance+of+cell-type+selective+markers+in+whole-kidney+RNA-Seq+data.">Representation and relative abundance of cell-type selective markers in whole-kidney RNA-Seq data.</a> Kidney International. 95 (4), 787-796 (2019).</li><li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FDISCO:+Advanced+solvent-based+clearing+method+for+imaging+whole+organs.">FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs.</a> Science Advances. 5 (1), eaau8355 (2019).</li><li>Sylwestrak, E. L., Rajasethupathy, P., Wright, M. A., Jaffe, A., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+Intact-Tissue+Transcriptional+Analysis+at+Cellular+Resolution.">Multiplexed Intact-Tissue Transcriptional Analysis at Cellular Resolution.</a> Cell. 164 (4), 792-804 (2016).</li><li>Shah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+RNA+detection+at+depth+by+hybridization+chain+reaction+and+tissue+hydrogel+embedding+and+clearing.">Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing.</a> Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).</li><li>Gleave, J. A., Lerch, J. P., Henkelman, R. M., Nieman, B. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+electrotransport+selectively+enhances+the+transport+of+highly+electromobile+molecules.">Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), E6274-E6283 (2015).</li><li>Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C., Gentleman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+of+acrylamide+sodium+dodecyl+sulphate+(SDS)-based+tissue+clearing+(FASTClear):+a+novel+protocol+of+tissue+clearing+for+3-D+visualization+of+human+brain+tissues.">Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for 3-D visualization of human brain tissues.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).</li><li>Xu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+free-of-acrylamide+clearing+tissue+(FACT)-an+optimized+new+protocol+for+rapid,+high-resolution+imaging+of+3-D+brain+tissue.">Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of 3-D brain tissue.</a> Scientific Reports. 7 (1), 9895 (2017).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159 (4), 911-924 (2014).</li><li>Matryba, P., Bozycki, L., Pawlowska, M., Kaczmarek, L., Stefaniuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+perfusion-based+CUBIC+protocol+for+the+efficient+whole-body+clearing+and+imaging+of+rat+organs.">Optimized perfusion-based CUBIC protocol for the efficient whole-body clearing and imaging of rat organs.</a> Journal of Biophotonics. 11 (5), e201700248 (2018).</li></ol>

Les techniques de compensation optique ont reçu une grande attention pour la visualisation 3D et la quantification de la microanatomie dans divers organes. Ici, la méthode de compensation solvant-basée (ECi) a été combinée avec l'immunolabeling pour l'imagerie 3-D des tubules entiers dans des tranches de rein. Cette méthode est simple, peu coûteuse et rapide. Cependant, d'autres questions de recherche peuvent être mieux répondues avec d'autres protocoles de compensation5. Il est égaleme...

L'intérêt croissant pour l'étude d'organes entiers ou de grandes structures multicellulaires a conduit au développement de méthodes de compensation optique qui impliquent l'imagerie de tissus transparents en trois dimensions. Jusqu'à récemment, les meilleures méthodes pour estimer le nombre, la longueur ou le volume des structures entières étaient la stérilisation ou la section sérielle exhaustive, qui est basée sur l'échantillonnage systémique des tissus pour l'analyse ultérieure en deux dimensions1, 2 (en) , 3. Cependant, ces méthodes prennent beaucoup de temps et nécessitent un niveau élevé de formation et d'expertise4. Les méthodes de compensation optique surmontent ces problèmes en équilibrant l'indice de réfraction dans l'ensemble d'un échantillon pour rendre les tissus translucides pour l'imagerie 3D5,6,7.
Plusieurs méthodes de compensation optique ont été développées qui se divisent en deux grandes catégories : les méthodes à base de solvants et les méthodes aqueuses. Les méthodes aqueuses peuvent être encore divisées en immersion simple8,9, hyperhydratation10,11, et hydrogel encastrer12,13. Les méthodes à base de solvant déshydratent le tissu, enlèvent les lipides et normalisent l'indice de réfraction à une valeur d'environ 1,55. Les limites de la plupart des méthodes à base de solvants sont l'étanchéité de la fluorescence endogène des protéines journaliste couramment utilisées telles que le GFP, la toxicité des solvants, la capacité de dissoudre les colles utilisées dans certaines chambres d'imagerie ou lentilles objectives, et le rétrécissement des tissus pendant déshydratation14,15,16,17,18,19,20,21. Cependant, les méthodes basées sur les solvants sont simples, efficaces en temps, et peuvent fonctionner dans un certain nombre de différents types de tissus.
Les méthodes aqueuses s'appuient sur l'immersion du tissu dans des solutions aqueuses qui ont des indices réfractifs de l'ordre de 1,38-1,528,11,12,22,23,24 . Ces méthodes ont été développées pour préserver l'émission endogène de protéines fluorescentes de reporter et pour empêcher le rétrécissement déshydraté-induit, mais les limites de la plupart des méthodes aqueuses-basées de compensation incluent une plus longue durée du protocole, l'expansion de tissu, et modification des protéines (c.-à-d. dénaturation partielle des protéines par urée dans des protocoles hyperhydratants tels que ScaleA2)7,11,23,25. ScaleS a abordé l'expansion des tissus en combinant l'urée avec le sorbitol, qui contrebalance par déshydratation l'expansion des tissus induites par l'urée, et a préservé l'ultrastructure tissulaire telle qu'évaluée par microscopie électronique10. Le rétrécissement ou l'expansion des tissus affecte la taille absolue des structures, les distances entre les objets ou la densité cellulaire par volume; ainsi, la mesure des changements de taille au nettoyage du tissu peut aider à interpréter les résultats obtenus7,26.
En général, un protocole de compensation optique se compose de plusieurs étapes, y compris le prétraitement, la perméabilisation, l'immunoétiquetage (si nécessaire), l'appariement de l'indice réfractif et l'imagerie avec microscopie lumineuse avancée (p. ex. deux photons, confocal, ou microscopie de fluorescence par feuille de lumière). La plupart des approches de compensation ont été développées pour visualiser le tissu neuronal, et des études émergentes ont validé leur application dans d'autres organes5. Cet outil complet a été précédemment démontré pour permettre l'analyse fiable et efficace des structures rénales, y compris glomeruli27,28, immunisé infiltre28, vascularisation28, et les segments tubule 29, et c'est une approche idéale pour améliorer la compréhension de la fonction glomerulaire et le remodelage de tubule dans la santé et la maladie.
Résumé ici est une méthode à base de solvant qui combine l'immunostaining des tubules rénaux; compensation optique avec cinnamate d'éthyle chimique bon marché, non toxique et prêt à l'emploi (ECi); et l'imagerie par microscopie confocale qui permet une visualisation et une quantification complètes des tubules. Cette méthode est simple, combine la récupération d'antigènes de tranches de rein avec la coloration d'anticorps commerciaux, et ne nécessite pas d'équipement spécialisé, ce qui le rend accessible à la plupart des laboratoires.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 gauge butterfly needle</td>
			<td>Braun</td>
			<td>Venofix</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-way stopcock</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K420163-4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D analyis software</td>
			<td>Bitplane AG</td>
			<td>IMARIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D analyis software</td>
			<td>Cellprofiler</td>
			<td></td>
			<td>free open-source software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 silk suture</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18020-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml plastic syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-817-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BrdU monoclonal antibody</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11296736001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S0809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-647</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>102516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate-based antigen retrieval solution</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved hemostat</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-812-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Wash Buffer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S3006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissecting microscope</td>
			<td>Motic</td>
			<td>DSK-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding cassettes</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>E478.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl cinnamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>112372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible film/Parafilm M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-AQP2</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-9882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guinea pig anti-NKCC2</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>DOI: 10.1681/ASN.2012040404</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P074.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td>401-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemostat</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>312-471-140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>horizontal rocker</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>S2035-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging dish</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>MWI Animal Health</td>
			<td>501090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro serrefine</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18052-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors</td>
			<td>Merit</td>
			<td>97-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>O4042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-phoshoThr53-NCC</td>
			<td>PhosphoSolutions</td>
			<td>p1311-53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer</td>
			<td>World Precision Instruments Kwik-Sil</td>
			<td>KWIK-SIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue slicer</td>
			<td>Zivic Instruments</td>
			<td>HSRA001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC215682500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Lancer</td>
			<td>Series 1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>MWI Animal Health</td>
			<td>AnaSed Inj SA (Xylazine)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical clearing and imaging of immunolabeled kidney tissue

Les techniques de compensation optique rendent le tissu transparent en équilibrant l'indice de réfraction dans l'ensemble d'un échantillon pour la formation image tridimensionnelle (3-D) subséquente. Ils ont reçu une grande attention dans tous les domaines de recherche pour le potentiel d'analyser les structures microscopiques multicellulaires qui s'étendent sur des distances macroscopiques. Étant donné que les tubules de rein, la vascularisation, les nerfs, et le glomeruli s'étendent dans beaucoup de directions, qui ont été seulement partiellement capturées par les techniques bidimensionnelles traditionnelles jusqu'ici, dégagement de tissu a également ouvert de nombreux nouveaux secteurs de la recherche de rein. La liste des méthodes de compensation optique s'allonge rapidement, mais il reste difficile pour les débutants dans ce domaine de choisir la meilleure méthode pour une question de recherche donnée. Fourni ici est une méthode simple qui combine l'étiquetage des anticorps des tranches de rein de souris épaisses; compensation optique avec cinnamate d'éthyle chimique bon marché, non toxique et prêt à l'emploi; et l'imagerie confocale. Ce protocole décrit comment perfuter les reins et utiliser une étape de récupération d'antigène pour augmenter la liaison des anticorps sans avoir besoin d'équipement spécialisé. Son application est présentée dans l'imagerie de différentes structures multicellulaires dans le rein, et comment dépanner la pénétration des anticorps pauvres dans les tissus est abordée. Nous discutons également des difficultés potentielles de l'imagerie fluorophores endogènes et l'acquisition de très grands échantillons et comment les surmonter. Ce protocole simple fournit un outil facile à installer et complet pour étudier les tissus en trois dimensions.

Les reins sont des organes complexes composés de 43 types de cellules différents31. La plupart de ces cellules forment de grandes structures multicellulaires telles que le glomeruli et les tubules, et leur fonction dépend fortement des interactions les unes avec les autres. Les techniques histologiques classiques 2D capturent partiellement ces grandes structures et peuvent manquer des changements focaux dans les structures intactes31. Ainsi, l'analyse 3D utilisant des te...

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Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

Effacement optique et imagerie du tissu rénal immunolabeled

La combinaison de l'étiquetage des anticorps, de la compensation optique et de la microscopie lumineuse avancée permet une analyse tridimensionnelle des structures ou organes complets. Décrit ici est une méthode simple pour combiner l'immunolabeling des tranches de rein épaisses, la compensation optique avec le cinnamate d'éthyle, et l'imagerie confocale qui permet la visualisation et la quantification des structures tridimensionnelles de rein.

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...

L’intérêt croissant pour l’étude de grandes structures multicellulaires a conduit au développement de cette technique de compensation optique qui permet une visualisation tridimensionnelle et la quantification de grandes structures au sein d’organes transparents. Ce protocole fournit un outil simple, bon marché, facile à mettre en place et complet pour étudier les tissus en trois dimensions. La nature à plusieurs couches d’une maladie ne peut pas toujours être simulée par des techniques bidimensionnelles traditionnelles.L’analyse tridimensionnelle des tissus peut aider à mieux diagnostiquer et surveiller la maladie. Cette méthode n’est pas limitée aux tissus rénaux et peut être appliquée à n’importe quel tissu normal et diseaseé. Ce protocole simple est facile à suivre pour tout scientifique ayant une certaine expérience dans la manipulation des animaux.Il est important de tester différents anticorps en cas de mauvaise étiquetage des anticorps, et d’effectuer des contrôles secondaires anticorps seulement. Commencez par préparer de l’héparine contenant du PBS et du paraformaldéhyde de 3,0 % en 1X PBS selon les directives manuscrites et transférez les solutions dans des seringues en plastique séparées de 50 mL. Le paraformaldéhyde est toxique et doit être préparé dans le capot des fumées.Recueillir et profuser le rein selon les instructions manuscrites. Ensuite, retirez la capsule et coupez le rein en tranches coronale d’un mm d’épaisseur. Immerger les tranches de rein avec la solution de paraformaldéhyde préparée dans un tube conique de 15 mL.Après fixation, laver la tranche de rein deux fois avec 1X tampon de lavage pendant une heure sur un rocker horizontal, puis procéder à la récupération des antigènes. Chauffer 300 mL de solution de démasquage d’antigène 1X dans un bécher de 500 mL. Ensuite, enfermez une tranche de rein dans une cassette d’intégration perméable au tampon chauffé et remuez-la pendant une heure à 92 à 98 degrés Celsius.Il est important de maintenir la température stable entre 92 et 98 degrés Celsius pour cette étape de récupération des antigènes. Ensuite, transférer la tranche dans 10 mL de tampon de lavage 1X avec 0,1%Triton X-100 et la bercer pendant la nuit. Le lendemain, lavez la tranche deux fois avec 10 mL de tampon de lavage 1X frais pendant une heure.Diluer l’anticorps primaire dans 500 microlitres de diluant normal d’anticorps. Bercer doucement la tranche de rein dans l’anticorps primaire dilué pendant quatre jours à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, laver la tranche de rein dans 10 mL de tampon de lavage 1X pendant la nuit à température ambiante, en changeant le tampon une fois après huit heures.Diluer les anticorps secondaires dans 500 microlitres diluants d’anticorps normaux et incuber avec la tranche de rein pendant quatre jours à 37 degrés Celsius. Veuillez noter qu’à partir de ce pas en avant, la tranche de rein doit être protégée de la lumière. Après incubation avec des anticorps secondaires, laver la tranche de rein dans 10 mL de tampon de lavage 1X pendant la nuit à température ambiante.Pour déshydrater la tranche de rein, transférez-la à cinq mL d’éthanol de haute teneur à 100 % et secouez-la pendant deux heures à température ambiante, en rafraichissant l’éthanol au bout d’une heure. Plonger la tranche de rein dans deux mL de cinnamate éthylique et verser doucement toute la nuit. Lorsque vous êtes prêt à l’image du tissu, ajouter 600 à 1000 microlitres de cinnamate éthylique dans un plat à fond de verre et transférer la tranche de rein dans le plat.Déposer une feuille de couverture ronde sur la tranche de rein et sceller le plat avec du film de paraffine. Placez le plat sur la plate-forme d’imagerie au microscope et imagez le tissu selon les instructions manuscrites. Ce protocole a été utilisé pour effectuer avec succès l’analyse 3D sur le tissu rénal et évaluer les fonctions cellulaires et les interactions.La méthode peut causer l’assaisinage fluorescent de journaliste mais d’autres protéines fluorescentes fortes peuvent résister à l’assaisinage de signal. La profusion aortique abdominale peut améliorer la diffusion d’anticorps. Dans certains cas, une mauvaise pénétration des anticorps entraîne un signal superficiel.Ceci peut être corrigé avec des concentrations plus élevées ou le réapprovisionnement de l’anticorps. L’accouchement intravasculaire doit être envisagé si l’antigène d’intérêt est exprimé dans la vascularisation rénale. Cependant, les anticorps ciblant les protéines dans la membrane apical des cellules épithéliales tubules ne traversent pas la barrière de filtration glomerular et causent des signaux non spécifiques.Le tissu peut être étiqueté avec les anticorps pour détecter une population cellulaire spécifique ou pour visualiser des segments entiers de tubules. En outre, la colocalisation des protéines en 3D peut être réalisée en combinant plusieurs anticorps. Il est important de se rappeler que l’étiquetage d’anticorps peut être amélioré avec une bonne profusion rénale, l’utilisation de l’étape de récupération d’antigène, et la concentration élevée d’anticorps.Certaines protéines fortes de journaliste peuvent résister à l’assaisinage du signal fluorescent suivant ce protocole. Pour tester cela, sautez les étapes d’étiquetage de l’antigène et de l’anticorps. Cette technique respecte la nature tridimensionnelle des structures et ouvre de nombreux nouveaux domaines de recherche.Il élimine les hypothèses et les interférences requises associées à l’analyse bidimensionnelle traditionnelle.

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