Name: optical clearing and imaging of immunolabeled kidney tissue
Uploaded: 2019-07-22T14:00:00
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T. S. wird durch Stipendien der Deutschen Forschungsgemeinschaft DFG (332853055), der Else Kröner-Fresenius-Stiftung (2015_A197) und der Medizinischen Fakultät der RWTH Aachen (RWTH Returner Program) unterstützt. Unterstützt wird V. G. P. durch Forschungsstipendien der Deutschen Gesellschaft fur Nephrologie, der Alexander von Humboldt-Stiftung und des National Health and Medical Research Council of Australia. D. H. E wird von der Fondation LeDucq unterstützt. Gefördert wird R. K. durch Stipendien der DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), des Landes Nordrhein-Westfalen (MIWF-NRW) und des Interdisziplinären Zentrums für Klinische Forschung der RWTH Aachen (O3-11).

HINWEIS: Alle hier beschriebenen experimentellen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Oregon Health and Science University, Portland, Oregon, USA, und den zuständigen lokalen Behörden in Aachen, Deutschland, genehmigt.
1. Retrograde Abdominalaortische Perfusion und Fixierung von Mausnieren
<ol><li>Bereiten Sie Lösungen am selben Tag oder Abend vor und lagern Sie in einem Kühlschrank über Nacht. Warme Lösungen auf Raumtemperatur (...

<ol>
	<li>Oh, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mesoscale+connectome+of+the+mouse+brain.">A mesoscale connectome of the mouse brain.</a> Nature. 508 (7495), 207-214 (2014).</li><li>Zhai, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+reconstruction+of+the+mouse+nephron.">3-D reconstruction of the mouse nephron.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 17 (1), 77-88 (2006).</li><li>Nyengaard, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereologic+methods+and+their+application+in+kidney+research.">Stereologic methods and their application in kidney research.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).</li><li>Puelles, V. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent-protein+stabilization+and+high-resolution+imaging+of+cleared,+intact+mouse+brains.">Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains.</a> PLoS ONE. 10 (5), e0124650 (2015).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+PEGASOS+method.">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method.</a> Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).</li><li>Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2,2'-thiodiethanol:+a+new+water+soluble+mounting+medium+for+high+resolution+optical+microscopy.">2,2'-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy.</a> Microscopy Research and Technique. 70 (1), 1-9 (2007).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li><li>Hua, L., Zhou, R., Thirumalai, D., Berne, B. 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Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Representation+and+relative+abundance+of+cell-type+selective+markers+in+whole-kidney+RNA-Seq+data.">Representation and relative abundance of cell-type selective markers in whole-kidney RNA-Seq data.</a> Kidney International. 95 (4), 787-796 (2019).</li><li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FDISCO:+Advanced+solvent-based+clearing+method+for+imaging+whole+organs.">FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs.</a> Science Advances. 5 (1), eaau8355 (2019).</li><li>Sylwestrak, E. L., Rajasethupathy, P., Wright, M. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+electrotransport+selectively+enhances+the+transport+of+highly+electromobile+molecules.">Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), E6274-E6283 (2015).</li><li>Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C., Gentleman, S. 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Optische Clearing-Techniken haben große Aufmerksamkeit für die 3-D-Visualisierung und Quantifizierung der Mikroanatomie in verschiedenen Organen erhalten. Hier wurde die lösungsmittelbasierte Clearing-Methode (ECi) mit der Immunolabelierung zur 3-D-Bildgebung ganzer Tubuli in Nierenscheiben kombiniert. Diese Methode ist einfach, kostengünstig und schnell. Andere Forschungsfragen können jedoch am besten mit anderen Clearingprotokollen beantwortet werden5. Es ist auch wichtig zu bedenken, dass ...

Das wachsende Interesse an der Untersuchung ganzer Organe oder großer mehrzelliger Strukturen hat zur Entwicklung optischer Clearingmethoden geführt, die die Abbildung von transparentem Gewebe in drei Dimensionen beinhalten. Bis vor kurzem waren die besten Methoden zur Schätzung der Zellzahl, -länge oder des Volumens ganzer Strukturen die Stereologie oder die erschöpfende serielle Schnitte, die auf der systemischen Probenahme von Gewebe für die nachfolgende Analyse in zwei Dimensionen basiert1, 2 , 3. Diese Methoden sind jedoch zeitaufwändig und benötigen ein hohes Maß an Ausbildung und Fachwissen4. Optische Clearing-Methoden überwinden diese Probleme, indem sie den Brechungsindex in einer Probe ausdematrieren, um Gewebe transluzent für die 3D-Bildgebung5,6,7zu machen.
Es wurden mehrere optische Clearing-Methoden entwickelt, die in zwei Hauptkategorien unterteilt sind: lösemittelbasierte und wässrige Methoden. Wässrige Methoden können weiter unterteilt werden in einfaches Eintauchen8,9, Hyperhydration10,11und Hydrogel einbetten12,13. Lösemittelbasierte Methoden dehydrieren das Gewebe, entfernen Lipide und normalisieren den Brechungsindex auf einen Wert um 1,55. Einschränkungen der meisten lösungsmittelbasierten Methoden sind das Abschrecken der endogenen Fluoreszenz von häufig verwendeten Reporterproteinen wie GFP, Lösungsmitteltoxizität, die Fähigkeit, Klebstoffe aufzulösen, die in einigen Bildkammern oder Objektivlinsen verwendet werden, und die Schrumpfung von Gewebe während der Austrocknung14,15,16,17,18,19,20,21. Lösemittelbasierte Methoden sind jedoch einfach, zeitsparend und können in einer Reihe von verschiedenen Gewebetypen funktionieren.
Wässrige Methoden basieren auf dem Eintauchen des Gewebes in wässrige Lösungen, die Brechungsindizes im Bereich von 1,38-1,528,11,12,22,23,24 haben . Diese Methoden wurden entwickelt, um die emission von endogenen fluoreszierenden Reportern zu erhalten und dehydrationsinduzierte Schrumpfung zu verhindern, aber die Einschränkungen der meisten wässrigen Clearingmethoden umfassen eine längere Dauer des Protokolls, Gewebeausdehnung und Proteinmodifikation (d.h. partielle Denaturierung von Proteinen durch Harnstoff in hyperhydrierenden Protokollen wie ScaleA2)7,11,23,25. ScaleS adressierte Gewebeexpansion durch die Kombination von Harnstoff mit Sorbitol, das durch Dehydrierung die Harnstoff-induzierte Gewebeexpansion ausbalanciert und die Gewebe-Ultrastruktur, wie durch Elektronenmikroskopie ausgewertet10. Die Schrumpfung oder Ausdehnung von Gewebe wirkt sich auf die absoluten Größen von Strukturen, Abstände zwischen Objekten oder die Zelldichte pro Volumen aus. So kann die Messung von Größenänderungen bei der Reinigung des Gewebes helfen, die erhaltenen Ergebnisse7,26zu interpretieren.
Im Allgemeinen besteht ein Protokoll für optisches Clearing aus mehreren Schritten, einschließlich Vorbehandlung, Permeabilisierung, Immunkennzeichnung (falls erforderlich), Brechungsindex-Matching und Bildgebung mit fortgeschrittener Lichtmikroskopie (z. B. Zweiphotonen, konfokale oder Lichtbogenfluoreszenzmikroskopie). Die meisten Clearing-Ansätze wurden entwickelt, um neuronales Gewebe zu visualisieren, und neue Studien haben ihre Anwendung in anderen Organen validiert5. Dieses umfassende Tool wurde zuvor gezeigt, um eine zuverlässige und effiziente Analyse von Nierenstrukturen zu ermöglichen, einschließlich Glomeruli27,28, Immuninfiltrate28, Vaskulatur28und Tubule Segmente 29, und es ist ein idealer Ansatz, um das Verständnis der glomerulären Funktion und Tubule Umbau in Gesundheit und Krankheit zu verbessern.
Zusammengefasst ist hier eine lösungsmittelbasierte Methode, die Immunfärbung von Nierentubuli kombiniert; optische Clearing mit billigen, ungiftigen und gebrauchsfertigen chemischen Ethyl-Cinnamate (ECi); und konfokale Mikroskopie-Bildgebung, die eine vollständige Tubule-Visualisierung und Quantifizierung ermöglicht. Diese Methode ist einfach, kombiniert Antigen-Retrieval von Nierenscheiben mit Färbung von kommerziellen Antikörpern, und erfordert keine spezielle Ausrüstung, die es für die meisten Laboratorien zugänglich macht.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 gauge butterfly needle</td>
			<td>Braun</td>
			<td>Venofix</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-way stopcock</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K420163-4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D analyis software</td>
			<td>Bitplane AG</td>
			<td>IMARIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D analyis software</td>
			<td>Cellprofiler</td>
			<td></td>
			<td>free open-source software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 silk suture</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18020-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml plastic syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-817-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BrdU monoclonal antibody</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11296736001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S0809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-647</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>102516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate-based antigen retrieval solution</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved hemostat</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-812-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Wash Buffer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S3006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissecting microscope</td>
			<td>Motic</td>
			<td>DSK-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding cassettes</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>E478.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl cinnamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>112372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible film/Parafilm M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-AQP2</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-9882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guinea pig anti-NKCC2</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>DOI: 10.1681/ASN.2012040404</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P074.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td>401-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemostat</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>312-471-140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>horizontal rocker</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>S2035-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging dish</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>MWI Animal Health</td>
			<td>501090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro serrefine</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18052-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors</td>
			<td>Merit</td>
			<td>97-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>O4042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-phoshoThr53-NCC</td>
			<td>PhosphoSolutions</td>
			<td>p1311-53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer</td>
			<td>World Precision Instruments Kwik-Sil</td>
			<td>KWIK-SIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue slicer</td>
			<td>Zivic Instruments</td>
			<td>HSRA001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC215682500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Lancer</td>
			<td>Series 1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>MWI Animal Health</td>
			<td>AnaSed Inj SA (Xylazine)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical clearing and imaging of immunolabeled kidney tissue

Optische Clearing-Techniken machen Gewebe transparent, indem der Brechungsindex in einer Probe für die nachfolgende dreidimensionale (3-D) Bildgebung ausgeglichen wird. Sie haben in allen Forschungsbereichen große Aufmerksamkeit auf das Potenzial zur Analyse mikroskopischer mehrzelliger Strukturen erhalten, die sich über makroskopische Entfernungen erstrecken. Angesichts der Tatsache, dass sich Nierentubuli, Vaskulatur, Nerven und Glomeruli in viele Richtungen ausdehnen, die bisher nur teilweise durch traditionelle zweidimensionale Techniken erfasst wurden, eröffnete die Geweberäumung auch viele neue Bereiche der Nierenforschung. Die Liste der optischen Clearing-Methoden wächst schnell, aber es bleibt schwierig für Anfänger in diesem Bereich, die beste Methode für eine bestimmte Forschungsfrage zu wählen. Hier ist eine einfache Methode, die Antikörper-Etikettierung von dicken Maus Nierenscheiben kombiniert; optische Clearing mit billigem, ungiftigem und gebrauchsfertigem chemischen Ethyl-Cinnamat; und konfokale Bildgebung. Dieses Protokoll beschreibt, wie man Nieren durchsetzt und einen Antigen-Retrieval-Schritt verwendet, um die Antikörperbindung zu erhöhen, ohne spezielle Geräte zu benötigen. Seine Anwendung wird in der Bildgebung verschiedener multizellulärer Strukturen innerhalb der Niere vorgestellt, und wie man schlechte Antikörper-Penetration in Gewebe zu beheben wird behandelt. Wir diskutieren auch die potenziellen Schwierigkeiten der Bildgebung endogene Fluorophore und den Erwerb sehr großer Proben und wie sie überwunden werden können. Dieses einfache Protokoll bietet ein einfach einzurichtendes und umfassendes Werkzeug, um Gewebe in drei Dimensionen zu untersuchen.

Nieren sind komplexe Organe, die aus 43 verschiedenen Zelltypen31bestehen. Die meisten dieser Zellen bilden große mehrzellige Strukturen wie Glomeruli und Tubuli, und ihre Funktion ist in hohem Maße von Wechselwirkungen miteinander abhängig. Klassische 2-D-Histologische Techniken erfassen diese großen Strukturen teilweise und können fokale Veränderungen innerhalb intakter Strukturen vermissen31. So hilft die 3-D-Analyse mit optischen Clearing-Techniken zu verstehen, w...

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Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

Optische Seimierung und Bildgebung von immunomarkiertem Nierengewebe

Die Kombination aus Antikörperkennzeichnung, optischer Lichtreinigung und fortschrittlicher Lichtmikroskopie ermöglicht die dreidimensionale Analyse kompletter Strukturen oder Organe. Hier wird eine einfache Methode beschrieben, um die Immunkennzeichnung dicker Nierenscheiben, die optische Reinigung mit Ethyl-Cinnamat und die konfokale Bildgebung zu kombinieren, die die Visualisierung und Quantifizierung dreidimensionaler Nierenstrukturen ermöglicht.

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...

Das wachsende Interesse am Studium großer, multizellulärer Strukturen führte zur Entwicklung dieser optischen Clearing-Technik, die eine dreidimensionale Visualisierung und Quantifizierung großer Strukturen innerhalb transparenter Organe ermöglicht. Dieses Protokoll bietet ein einfaches, kostengünstiges, einfach einzurichtendes und umfassendes Werkzeug zur Untersuchung von Gewebe in drei Dimensionen. Die vielschichtige Natur einer Krankheit kann nicht immer mit traditionellen zweidimensionalen Techniken simuliert werden.Die dreidimensionale Analyse von Gewebe kann helfen, Krankheiten besser zu diagnostizieren und zu überwachen. Diese Methode ist nicht auf Nierengewebe beschränkt und kann auf jedes normale und kranke Gewebe angewendet werden. Dieses einfache Protokoll ist für jeden Wissenschaftler mit etwas Erfahrung im Umgang mit Tieren einfach zu befolgen.Es ist wichtig, verschiedene Antikörper bei schlechter Antikörperkennzeichnung zu testen und nur sekundäre Antikörperkontrollen durchzuführen. Beginnen Sie mit der Zubereitung von Heparin mit PBS und 3,0% Paraformaldehyd in 1X PBS gemäß den Manuskriptrichtungen und übertragen Sie die Lösungen in separate 50 ml Kunststoffspritzen. Paraformaldehyd ist giftig und sollte in der Dunstabzugshaube hergestellt werden.Sammeln und überziehen Sie die Niere nach den Manuskriptanweisungen. Dann entfernen Sie die Kapsel und schneiden Sie die Niere in ein mm dicke koronale Scheiben. Die Nierenscheiben mit der vorbereiteten Paraformaldehydlösung in ein 15 ml konisches Rohr eintauchen.Nach der Fixierung die Nierenscheibe zweimal mit 1X Waschpuffer für eine Stunde auf einer horizontalen Wippe waschen und dann mit Antigen-Retrieval fortfahren. Erhitzen Sie 300 ml 1X Antigen-Entlarmungslösung in einem 500 ml Becher. Dann eine Nierenscheibe in eine einbettbare Einbettkassette einschließen, die in den erhitzten Puffer durchlässig ist, und eine Stunde bei 92 bis 98 Grad Celsius umrühren.Es ist wichtig, die Temperatur zwischen 92 und 98 Grad Celsius für diesen Antigen-Retrieval-Schritt stabil zu halten. Dann die Scheibe in 10 ml 1X Waschpuffer mit 0.1%Triton X-100 übertragen und über Nacht schaukeln. Am nächsten Tag die Scheibe zweimal mit 10 ml frischem 1X Waschpuffer für eine Stunde waschen.Verdünnen Sie den primären Antikörper in 500 Mikroliter normales Antikörperverdünnungsmittel. Die Nierenscheibe in verdünntem Primärantikörper vier Tage lang bei 37 Grad Celsius sanft schaukeln. Nach der Inkubation die Nierenscheibe in 10 ml 1X Waschpuffer über Nacht bei Raumtemperatur waschen und den Puffer einmal nach acht Stunden wechseln.Die sekundären Antikörper in 500 Mikroliter normaler Antikörperverdünnung verdünnen und vier Tage lang bei 37 Grad Celsius mit der Nierenscheibe bebrüten. Bitte beachten Sie, dass die Nierenscheibe von diesem Schritt an vor Licht geschützt werden sollte. Nach der Inkubation mit sekundären Antikörpern die Nierenscheibe in 10 ml 1X Waschpuffer über Nacht bei Raumtemperatur waschen.Um die Nierenscheibe zu dehydrieren, übertragen Sie sie auf fünf ml hochwertiges 100%Ethanol und schaukeln Sie es für zwei Stunden bei Raumtemperatur, erfrischen Sie das Ethanol nach einer Stunde. Die Nierenscheibe in zwei ml Ethyl-Cinnamat eintauchen und über Nacht sanft schaukeln. Wenn Sie bereit sind, das Gewebe abzubilden, fügen Sie 600 bis 1000 Mikroliter Ethyl-Cinnamate in eine Glasbodenschale ein und geben Sie die Nierenscheibe in die Schale.Legen Sie einen runden Deckelschlupf auf die Nierenscheibe und versiegeln Sie die Schale mit Paraffinfolie. Legen Sie die Schale auf die Mikroskop-Bildplattform und stellen Sie das Gewebe entsprechend den Manuskriptanweisungen ab. Dieses Protokoll wurde verwendet, um erfolgreich 3D-Analysen auf Nierengewebe durchzuführen und Zellfunktionen und Wechselwirkungen auszuwerten.Die Methode kann fluoreszierende Reporter abschrecken verursachen, aber andere starke fluoreszierende Proteine können Signalabschreckung widerstehen. Abdominale Aortenfülle kann die Antikörperdiffusion verbessern. In einigen Fällen führt eine schlechte Antikörperdurchdringung zu einem oberflächlichen Signal.Dies kann mit höheren Konzentrationen oder nachauffüllung von Antikörpern korrigiert werden. Die intravaskuläre Abgabe sollte in Betracht gezogen werden, wenn das Antigen von Interesse in der Nierenvaskulatur ausgedrückt wird. Antikörper, die auf Proteine in der apikalen Membran von Tubuleepithelzellen abzielen, überschreiten jedoch nicht die glomeruläre Filtrationsbarriere und verursachen unspezifische Signale.Das Gewebe kann mit den Antikörpern beschriftet werden, um eine bestimmte Zellpopulation zu erkennen oder ganze Tubulesegmente zu visualisieren. Darüber hinaus kann die Kolokalisierung von Proteinen in 3D durch die Kombination mehrerer Antikörper erreicht werden. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Antikörperkennzeichnung mit guter Nierenfülle, der Verwendung von Antigen-Retrieval-Schritt und einer hohen Antikörperkonzentration verbessert werden kann.Einige starke Reporterproteine können dem Abschrecken von Fluoreszenzsignalen nach diesem Protokoll widerstehen. Um dies zu testen, überspringen Sie die Antigen-Retrieval- und Antikörper-Etikettierungsschritte. Diese Technik respektiert die dreidimensionale Natur von Strukturen und eröffnet viele neue Forschungsbereiche.Es eliminiert die erforderlichen Annahmen und Interferenzen, die mit der traditionellen zweidimensionalen Analyse verbunden sind.

Research

JoVE Journal

Medicine

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Medizin

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