Name: optical clearing and imaging of immunolabeled kidney tissue
Uploaded: 2019-07-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue at JoVE.com

T. S. è sostenuto da sovvenzioni della DFG German Research Foundation (332853055), else Kraner-Fresenius-Stiftung (2015_A197) e della Facoltà di Medicina del RWTH Aachen (RWTH Returner Program). V. G. P. è supportato da borse di ricerca da Deutsche Gesellschaft pellicco Nephrologie, la Alexander von Humboldt Foundation, e il National Health and Medical Research Council dell'Australia. D. H. E è supportato da Fondation LeDucq. R. K. è supportato da sovvenzioni del DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), dello Stato di Northrhinewestfalia (MIWF-NRW) e del Centro interdisciplinare di ricerca clinica presso la RWTH Aachen University (O3-11).

NOT:</</c0> Tutte le procedure sperimentali qui descritte sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Oregon Health and Science University di Portland, Oregon, USA e dalle autorità locali competenti di Aquisto, in Germania.
1. Retrogrado Perfusione aortica addominale e fissazione dei reni del topo
<ol><li>Preparare le soluzioni lo stesso giorno o sera prima e conservare in frigorifero durante la notte. Soluzioni calde alla temperatura...

<ol>
	<li>Oh, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mesoscale+connectome+of+the+mouse+brain.">A mesoscale connectome of the mouse brain.</a> Nature. 508 (7495), 207-214 (2014).</li><li>Zhai, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+reconstruction+of+the+mouse+nephron.">3-D reconstruction of the mouse nephron.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 17 (1), 77-88 (2006).</li><li>Nyengaard, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereologic+methods+and+their+application+in+kidney+research.">Stereologic methods and their application in kidney research.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).</li><li>Puelles, V. G., Bertram, J. F., Moeller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+podocyte+depletion:+theoretical+and+practical+considerations.">Quantifying podocyte depletion: theoretical and practical considerations.</a> Cell and Tissue Research. 369 (1), 229-236 (2017).</li><li>Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=We+can+see+clearly+now:+optical+clearing+and+kidney+morphometrics.">We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).</li><li>Ariel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+tissue+clearing.">A beginner's guide to tissue clearing.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 84, 35-39 (2017).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li><li>Kuwajima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearT:+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue.">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScaleS:+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging.">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Lee, E., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACT-PRESTO:+Biological+Tissue+Clearing+and+Immunolabeling+Methods+for+Volume+Imaging.">ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).</li><li>Klingberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+Automated+Evaluation+of+Total+Glomerular+Number+and+Capillary+Tuft+Size+in+Nephritic+Kidneys+Using+Lightsheet+Microscopy.">Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).</li><li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy:+3-D+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain.">Ultramicroscopy: 3-D visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3-DISCO.">3-D imaging of solvent-cleared organs using 3-DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li><li>Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+clearing+and+dehydration+of+GFP+expressing+mouse+brains.">Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains.</a> PloS One. 7 (3), e33916 (2012).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+a+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Pan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shrinkage-mediated+imaging+of+entire+organs+and+organisms+using+uDISCO.">Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO.</a> Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).</li><li>Schwarz, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent-protein+stabilization+and+high-resolution+imaging+of+cleared,+intact+mouse+brains.">Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains.</a> PLoS ONE. 10 (5), e0124650 (2015).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+PEGASOS+method.">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method.</a> Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).</li><li>Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2,2'-thiodiethanol:+a+new+water+soluble+mounting+medium+for+high+resolution+optical+microscopy.">2,2'-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy.</a> Microscopy Research and Technique. 70 (1), 1-9 (2007).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li><li>Hua, L., Zhou, R., Thirumalai, D., Berne, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urea+denaturation+by+stronger+dispersion+interactions+with+proteins+than+water+implies+a+2-stage+unfolding.">Urea denaturation by stronger dispersion interactions with proteins than water implies a 2-stage unfolding.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (44), 16928-16933 (2008).</li><li>Wan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+seven+optical+clearing+methods+in+mouse+brain.">Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain.</a> Neurophotonics. 5 (3), 035007 (2018).</li><li>Puelles, V. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+3-D+Method+for+Counting+and+Sizing+Podocytes+in+Whole+Glomeruli.">Validation of a 3-D Method for Counting and Sizing Podocytes in Whole Glomeruli.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 27 (10), 3093-3104 (2016).</li><li>Puelles, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+3-D+analysis+using+optical+tissue+clearing+documents+the+evolution+of+murine+rapidly+progressive+glomerulonephritis.">Novel 3-D analysis using optical tissue clearing documents the evolution of murine rapidly progressive glomerulonephritis.</a> Kidney International (in press). , (2019).</li><li>Saritas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Clearing+in+the+Kidney+Reveals+Potassium-Mediated+Tubule+Remodeling.">Optical Clearing in the Kidney Reveals Potassium-Mediated Tubule Remodeling.</a> Cell Reports. 25 (10), 2668-2675 (2018).</li><li>Masselink, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+applicability+of+a+streamlined+ethyl+cinnamate-based+clearing+procedure.">Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure.</a> Development. 146 (3), (2019).</li><li>Clark, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Representation+and+relative+abundance+of+cell-type+selective+markers+in+whole-kidney+RNA-Seq+data.">Representation and relative abundance of cell-type selective markers in whole-kidney RNA-Seq data.</a> Kidney International. 95 (4), 787-796 (2019).</li><li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FDISCO:+Advanced+solvent-based+clearing+method+for+imaging+whole+organs.">FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs.</a> Science Advances. 5 (1), eaau8355 (2019).</li><li>Sylwestrak, E. L., Rajasethupathy, P., Wright, M. A., Jaffe, A., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+Intact-Tissue+Transcriptional+Analysis+at+Cellular+Resolution.">Multiplexed Intact-Tissue Transcriptional Analysis at Cellular Resolution.</a> Cell. 164 (4), 792-804 (2016).</li><li>Shah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+RNA+detection+at+depth+by+hybridization+chain+reaction+and+tissue+hydrogel+embedding+and+clearing.">Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing.</a> Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).</li><li>Gleave, J. A., Lerch, J. P., Henkelman, R. M., Nieman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+3-D+immunostaining+and+optical+imaging+of+the+mouse+brain+demonstrated+in+neural+progenitor+cells.">A method for 3-D immunostaining and optical imaging of the mouse brain demonstrated in neural progenitor cells.</a> PLoS ONE. 8 (8), e72039 (2013).</li><li>Saritas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+CUL3-mediated+ubiquitination+causes+proximal+tubule+injury+and+kidney+fibrosis.">Disruption of CUL3-mediated ubiquitination causes proximal tubule injury and kidney fibrosis.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4596 (2019).</li><li>Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+imaging+of+the+functioning+kidney.">Multiphoton imaging of the functioning kidney.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 22 (7), 1297-1304 (2011).</li><li>Holliger, P., Hudson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+antibody+fragments+and+the+rise+of+single+domains.">Engineered antibody fragments and the rise of single domains.</a> Nature Biotechnology. 23 (9), 1126-1136 (2005).</li><li>Bunka, D. H., Stockley, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers+come+of+age+-+at+last.">Aptamers come of age - at last.</a> Nature Reviews: Microbiology. 4 (8), 588-596 (2006).</li><li>Kim, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+electrotransport+selectively+enhances+the+transport+of+highly+electromobile+molecules.">Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), E6274-E6283 (2015).</li><li>Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C., Gentleman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+of+acrylamide+sodium+dodecyl+sulphate+(SDS)-based+tissue+clearing+(FASTClear):+a+novel+protocol+of+tissue+clearing+for+3-D+visualization+of+human+brain+tissues.">Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for 3-D visualization of human brain tissues.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).</li><li>Xu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+free-of-acrylamide+clearing+tissue+(FACT)-an+optimized+new+protocol+for+rapid,+high-resolution+imaging+of+3-D+brain+tissue.">Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of 3-D brain tissue.</a> Scientific Reports. 7 (1), 9895 (2017).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159 (4), 911-924 (2014).</li><li>Matryba, P., Bozycki, L., Pawlowska, M., Kaczmarek, L., Stefaniuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+perfusion-based+CUBIC+protocol+for+the+efficient+whole-body+clearing+and+imaging+of+rat+organs.">Optimized perfusion-based CUBIC protocol for the efficient whole-body clearing and imaging of rat organs.</a> Journal of Biophotonics. 11 (5), e201700248 (2018).</li></ol>

Le tecniche di compensazione ottica hanno ricevuto un'ampia attenzione per la visualizzazione 3D e la quantificazione della microanatomia in vari organi. In questo caso, il metodo di compensazione basato su solventi (ECi) è stato combinato con l'immunolabeling per l'imaging 3D di tubuli interi in fette di rene. Questo metodo è semplice, economico e veloce. Tuttavia, altre domande di ricerca possono essere meglio risolte con altri protocolli di compensazione5. È anche importante tenere a mente c...

Il crescente interesse nello studio di interi organi o di grandi strutture multicellulari ha portato allo sviluppo di metodi di compensazione ottica che coinvolgono l'imaging di tessuto trasparente in tre dimensioni. Fino a poco tempo fa, i metodi migliori per stimare il numero di cellule, la lunghezza o il volume di intere strutture sono stati la stereologia o il sezionamento seriale esaustivo, che si basa sul campionamento sistemico del tessuto per l'analisi successiva in due dimensioni1, 2 Il nome del sistema , 3. Tuttavia, questi metodi richiedono molto tempo e necessitano di un elevato livello di formazione e competenza4. I metodi ottici di compensazione superano questi problemi bilanciando l'indice di rifrazione in tutto un campione per rendere il tessuto traslucido per l'imaging 3D5,6,7.
Sono stati sviluppati diversi metodi di compensazione ottica che rientrano in due categorie principali: metodi basati su solventi e acquosi. I metodi basati su aqueous possono essere ulteriormente suddivisi in semplice immersione8,9, iperidratazione10,11e idrogel incorporando12,13. I metodi a base di solvente disidratano il tessuto, rimuovono i lipidi e normalizzano l'indice di rifrazione a un valore intorno a 1,55. Limitazioni della maggior parte dei metodi a base di solventi sono la dorching della fluorescenza endogena di proteine reporter comunemente usate come GFP, tossicità dei solventi, capacità di sciogliere le colle utilizzate in alcune camere di imaging o lenti oggettive, e il restringimento dei tessuti durante disidratazione14,15,16,17,18,19,20,21. Tuttavia, i metodi basati sui solventi sono semplici, efficienti in termini di tempo e possono funzionare in diversi tipi di tessuto.
I metodi basati su aqueous si basano sull'immersione del tessuto in soluzioni acquose che hanno indici di rifrazione nell'intervallo di 1.38-1.528,11,12,22,23,24 . Questi metodi sono stati sviluppati per preservare l'emissione di proteine endogeniche di reporter fluorescenti e prevenire il restringimento indotto dalla disidratazione, ma i limiti della maggior parte dei metodi di compensazione basati su acquosi includono una durata più lunga del protocollo, l'espansione dei tessuti e modificazione delle proteine (cioè denaturazione parziale delle proteine mediante urea in protocolli iperidratanti come ScaleA2)7,11,23,25. ScaleS ha affrontato l'espansione dei tessuti combinando l'urea con il sorbitolo, che controbilancia per disidratazione l'espansione dei tessuti indotta dall'urea, e ha conservato l'ultrastruttura dei tessuti valutata dalla microscopia elettronica10. Il restringimento o l'espansione dei tessuti influisce sulle dimensioni assolute delle strutture, sulle distanze tra gli oggetti o sulla densità delle cellule per volume; pertanto, la misurazione delle dimensioni cambia al momento della compensazione del tessuto può aiutare a interpretare i risultati ottenuti7,26.
In generale, un protocollo per la compensazione ottica è costituito da più passaggi, tra cui pretrattamento, permeabilizzazione, immunolabeling (se necessario), corrispondenza dell'indice di rifrazione e imaging con microscopia luminosa avanzata (ad esempio, a due fotone, confocali o microscopia a fluorescenza del foglio luminoso). La maggior parte degli approcci di compensazione sono stati sviluppati per visualizzare il tessuto neuronale, e studi emergenti hanno convalidato la loro applicazione in altri organi5. Questo strumento completo è stato dimostrato in precedenza per consentire un'analisi affidabile ed efficiente delle strutture renali, tra cui glomeruli27,28, infiltrati immunitari28, vascolatura28e segmenti di tubulo 29, ed è un approccio ideale per migliorare la comprensione della funzione glomerare e del rimodellamento del tubulo in salute e malattia.
Riassunto qui è un metodo a base di solventi che combina l'immunostaining dei tubuli renali; sgombera ottica con cinnamate chimico a buon mercato, non tossico e pronto all'uso (ECi); e l'imaging a microscopia confocale che consente una visualizzazione completa del tubulo e la quantificazione. Questo metodo è semplice, combina antigene-recupero di fette di rene con colorazione di anticorpi commerciali, e non richiede attrezzature specializzate, che lo rende accessibile alla maggior parte dei laboratori.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 gauge butterfly needle</td>
			<td>Braun</td>
			<td>Venofix</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-way stopcock</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K420163-4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D analyis software</td>
			<td>Bitplane AG</td>
			<td>IMARIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D analyis software</td>
			<td>Cellprofiler</td>
			<td></td>
			<td>free open-source software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 silk suture</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18020-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml plastic syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-817-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BrdU monoclonal antibody</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11296736001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S0809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-647</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>102516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate-based antigen retrieval solution</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved hemostat</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-812-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Wash Buffer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S3006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissecting microscope</td>
			<td>Motic</td>
			<td>DSK-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding cassettes</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>E478.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl cinnamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>112372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible film/Parafilm M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-AQP2</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-9882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guinea pig anti-NKCC2</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>DOI: 10.1681/ASN.2012040404</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P074.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td>401-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemostat</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>312-471-140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>horizontal rocker</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>S2035-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging dish</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>MWI Animal Health</td>
			<td>501090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro serrefine</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18052-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors</td>
			<td>Merit</td>
			<td>97-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>O4042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-phoshoThr53-NCC</td>
			<td>PhosphoSolutions</td>
			<td>p1311-53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer</td>
			<td>World Precision Instruments Kwik-Sil</td>
			<td>KWIK-SIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue slicer</td>
			<td>Zivic Instruments</td>
			<td>HSRA001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC215682500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Lancer</td>
			<td>Series 1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>MWI Animal Health</td>
			<td>AnaSed Inj SA (Xylazine)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical clearing and imaging of immunolabeled kidney tissue

Le tecniche di compensazione ottica rendono trasparente il tessuto bilanciando l'indice di rifrazione in un campione per la successiva imaging tridimensionale (3D). Hanno ricevuto grande attenzione in tutte le aree di ricerca per il potenziale di analizzare strutture multicellulari microscopiche che si estendono su distanze macroscopiche. Dato che i tubuli renali, la vascolatura, i nervi e i glomeruli si estendono in molte direzioni, che finora sono stati catturati solo parzialmente dalle tradizionali tecniche bidimensionali, la pulizia dei tessuti ha aperto anche molte nuove aree di ricerca sui reni. L'elenco dei metodi di compensazione ottica è in rapida crescita, ma rimane difficile per i principianti in questo campo scegliere il metodo migliore per una determinata domanda di ricerca. Fornito qui è un metodo semplice che combina l'etichettatura anticorpale di fette di rene di topo spesse; sgombera ottica con cinnamate chimico a buon mercato, non tossico e pronto all'uso; e l'imaging confocale. Questo protocollo descrive come perfondere i reni e utilizzare un passaggio di recupero dell'antigene per aumentare il legame degli anticorpi senza richiedere attrezzature specializzate. La sua applicazione è presentata nell'imaging di diverse strutture multicellulari all'interno del rene, e come risolvere la scarsa penetrazione degli anticorpi nel tessuto è affrontato. Discutiamo anche delle potenziali difficoltà dell'imaging dei fluorofori endogeni e dell'acquisizione di campioni molto grandi e di come superarli. Questo semplice protocollo fornisce uno strumento facile da configurare e completo per studiare il tessuto in tre dimensioni.

I reni sono organi complessi composti da 43 diversi tipi di cellule31. La maggior parte di queste cellule formano grandi strutture multicellulari come glomeruli e tubuli, e la loro funzione è fortemente dipendente dalle interazioni tra loro. Le tecniche istologiche classiche 2D catturano parzialmente queste grandi strutture e possono perdere cambiamenti focali all'interno di strutture intatte31. Pertanto, l'analisi 3D con tecniche di compensazione ottica aiuta a capire com...

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Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

Cancellazione ottica e imaging del tessuto renale immunoetichettato

La combinazione di etichettatura anticorpale, compensazione ottica e microscopia luminosa avanzata consente l'analisi tridimensionale di strutture o organi completi. Descritto qui è un metodo semplice per combinare l'etichettatura di fette renali spesse, la compensazione ottica con il cinnamate etilico e l'imaging confocale che consente la visualizzazione e la quantificazione delle strutture renali tridimensionali.

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...

Il crescente interesse per lo studio di strutture grandi e multicellulari ha portato allo sviluppo di questa tecnica di compensazione ottica che consente una visualizzazione tridimensionale e la quantificazione di grandi strutture all'interno di organi trasparenti. Questo protocollo fornisce uno strumento semplice, economico, facile da configurare e completo per indagare i tessuti in tre dimensioni. La natura multistrato di una malattia non può sempre essere simulata dalle tecniche bidimensionali tradizionali.L'analisi tridimensionale dei tessuti può aiutare a diagnosticare e monitorare meglio le malattie. Questo metodo non è limitato al tessuto renale e può essere applicato a qualsiasi tessuto normale e danneggiato. Questo semplice protocollo è facile da seguire per qualsiasi scienziato con una certa esperienza nella gestione degli animali.È importante testare diversi anticorpi in caso di scarsa etichettatura degli anticorpi e condurre solo controlli anticorpali secondari. Inizia preparando l'eparina contenente PBS e paraformaldeide al 3,0% in 1X PBS secondo le indicazioni manoscritte e trasferendo le soluzioni in siringhe di plastica separate da 50 ml. La paraformaldeide è tossica e deve essere preparata nella cappa dei fumi.Raccogliere e profuso il rene secondo le indicazioni del manoscritto. Quindi, rimuovere la capsula e tagliare il rene a fette coronali spesse un mm. Immergere le fette renali con la soluzione di paraformaldeide preparata in un tubo conico da 15 ml.Dopo la fissazione, lavare la fetta di rene due volte con 1X tampone di lavaggio per un'ora su un rocker orizzontale e quindi procedere con il recupero dell'antigene. Riscaldare 300 mL di soluzione di smascheramento antigene 1X in un becher da 500 mL. Quindi, racchiudere una fetta di rene in una cassetta incorporante permeabile al tampone riscaldato e mescolarla per un'ora a 92-98 gradi Celsius.È importante mantenere stabile la temperatura tra 92 e 98 gradi Celsius per questo passaggio di recupero dell'antigene. Quindi trasferire la fetta in 10 mL di tampone di lavaggio 1X con 0,1%Triton X-100 e dondola durante la notte. Il giorno successivo, lavare la fetta due volte con 10 mL di tampone di lavaggio 1X fresco per un'ora.Diluire l'anticorpo primario in 500 microlitri di diluente anticorpale normale. Scuotere delicatamente la fetta renale in anticorpo primario diluito per quattro giorni a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, lavare la fetta di rene in 10 mL di tampone di lavaggio 1X durante la notte a temperatura ambiente, cambiando il tampone una volta dopo otto ore.Diluire gli anticorpi secondari in 500 microlitri di diluente anticorpale normale e incubare con la fetta renale per quattro giorni a 37 gradi Celsius. Si prega di notare che da questo passo avanti, la fetta di rene dovrebbe essere protetta dalla luce. Dopo l'incubazione con anticorpi secondari, lavare la fetta di rene in 10 mL di tampone di lavaggio 1X durante la notte a temperatura ambiente.Per disidratare la fetta di rene, trasferirla a cinque mL di etanolo di alta qualità al 100% e scuoterla per due ore a temperatura ambiente, rinfrescando l'etanolo dopo un'ora. Immergere delicatamente la fetta di rene in due mL di cinnamato etilico e roccia durante la notte. Quando sei pronto per l'immagine del tessuto, aggiungi da 600 a 1000 microlitri di cinnamato etilico in un piatto con fondo di vetro e trasferisci la fetta di rene nel piatto.Posizionare una copertura rotonda sulla fetta di rene e sigillare il piatto con pellicola di paraffina. Posizionare il piatto sulla piattaforma di imaging al microscopio e immaginare il tessuto in base alle indicazioni del manoscritto. Questo protocollo è stato utilizzato per eseguire con successo analisi 3D sul tessuto renale e valutare le funzioni e le interazioni cellulari.Il metodo può causare tempra fluorescente reporter, ma altre forti proteine fluorescenti possono resistere alla tempra del segnale. La profusione aortica addominale può migliorare la diffusione degli anticorpi. In alcuni casi, una scarsa penetrazione degli anticorpi si traduce in un segnale superficiale.Questo può essere corretto con concentrazioni più elevate o rifornimento di anticorpi. La consegna intravascolare deve essere presa in considerazione se l'antigene di interesse è espresso nella vascolarizzazione renale. Tuttavia, gli anticorpi che prendono di mira le proteine nella membrana apicale delle cellule epiteliali tubuliche non attraversano la barriera di filtrazione glomerulare e causano segnali non specifici.Il tessuto può essere etichettato con gli anticorpi per rilevare una specifica popolazione cellulare o per visualizzare interi segmenti di tubuli. Inoltre, la colocalizzazione delle proteine in 3D può essere ottenuta combinando anticorpi multipli. È importante ricordare che l'etichettatura degli anticorpi può essere migliorata con una buona profusione renale, l'uso di fase di recupero dell'antigene e un'alta concentrazione di anticorpi.Alcune proteine reporter forti possono resistere alla tempra del segnale fluorescente seguendo questo protocollo. Per testare questo, salta i passaggi di recupero dell'antigene e di etichettatura degli anticorpi. Questa tecnica rispetta la natura tridimensionale delle strutture e apre molte nuove aree di ricerca.Elimina le ipotesi e le interferenze richieste associate all'analisi bidimensionale tradizionale.

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