Name: optical clearing and imaging of immunolabeled kidney tissue
Uploaded: 2019-07-22T14:00:00
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T.S.は、DFGドイツ研究財団(332853055)、エルス・クローナー・フレセニウス・スティフトゥン(2015_A197)、RWTHアーヘン(RWTHリターナープログラム)の医学部からの助成金によって支援されています。V.G.P.は、ドイツのゲッセルシャフトファーネフロロジー、アレクサンダー・フォン・フンボルト財団、オーストラリア国立保健医療研究評議会の研究フェローシップによって支援されています。D. H. E はフォンダシオン・レダックによってサポートされています。R. K. は、DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1,SFB/TRR57,SFB/TRR219)、ノースラインウェストファミリア州(MIWF-NRW)、RWTHアーヘン大学臨床研究学際センター(O3-1)からの助成金によって支えられています。

注:ここに記載されているすべての実験手順は、オレゴン州立保健科学大学、ポートランド、オレゴン州、およびドイツのアヘンの関連地方自治体の機関動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。
1. 逆行性腹部大動脈灌流とマウス腎臓の固定
<ol><li>同じ日または夕方にソリューションを準備し、一晩冷蔵庫に保管してください。使用前に室?...

<ol>
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U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy:+3-D+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain.">Ultramicroscopy: 3-D visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3-DISCO.">3-D imaging of solvent-cleared organs using 3-DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li><li>Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent-protein+stabilization+and+high-resolution+imaging+of+cleared,+intact+mouse+brains.">Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains.</a> PLoS ONE. 10 (5), e0124650 (2015).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+PEGASOS+method.">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method.</a> Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).</li><li>Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2,2'-thiodiethanol:+a+new+water+soluble+mounting+medium+for+high+resolution+optical+microscopy.">2,2'-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy.</a> Microscopy Research and Technique. 70 (1), 1-9 (2007).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li><li>Hua, L., Zhou, R., Thirumalai, D., Berne, B. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+3-D+Method+for+Counting+and+Sizing+Podocytes+in+Whole+Glomeruli.">Validation of a 3-D Method for Counting and Sizing Podocytes in Whole Glomeruli.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 27 (10), 3093-3104 (2016).</li><li>Puelles, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+3-D+analysis+using+optical+tissue+clearing+documents+the+evolution+of+murine+rapidly+progressive+glomerulonephritis.">Novel 3-D analysis using optical tissue clearing documents the evolution of murine rapidly progressive glomerulonephritis.</a> Kidney International (in press). , (2019).</li><li>Saritas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Clearing+in+the+Kidney+Reveals+Potassium-Mediated+Tubule+Remodeling.">Optical Clearing in the Kidney Reveals Potassium-Mediated Tubule Remodeling.</a> Cell Reports. 25 (10), 2668-2675 (2018).</li><li>Masselink, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+applicability+of+a+streamlined+ethyl+cinnamate-based+clearing+procedure.">Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure.</a> Development. 146 (3), (2019).</li><li>Clark, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Representation+and+relative+abundance+of+cell-type+selective+markers+in+whole-kidney+RNA-Seq+data.">Representation and relative abundance of cell-type selective markers in whole-kidney RNA-Seq data.</a> Kidney International. 95 (4), 787-796 (2019).</li><li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FDISCO:+Advanced+solvent-based+clearing+method+for+imaging+whole+organs.">FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs.</a> Science Advances. 5 (1), eaau8355 (2019).</li><li>Sylwestrak, E. L., Rajasethupathy, P., Wright, M. A., Jaffe, A., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+Intact-Tissue+Transcriptional+Analysis+at+Cellular+Resolution.">Multiplexed Intact-Tissue Transcriptional Analysis at Cellular Resolution.</a> Cell. 164 (4), 792-804 (2016).</li><li>Shah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+RNA+detection+at+depth+by+hybridization+chain+reaction+and+tissue+hydrogel+embedding+and+clearing.">Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing.</a> Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).</li><li>Gleave, J. A., Lerch, J. P., Henkelman, R. M., Nieman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+3-D+immunostaining+and+optical+imaging+of+the+mouse+brain+demonstrated+in+neural+progenitor+cells.">A method for 3-D immunostaining and optical imaging of the mouse brain demonstrated in neural progenitor cells.</a> PLoS ONE. 8 (8), e72039 (2013).</li><li>Saritas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+CUL3-mediated+ubiquitination+causes+proximal+tubule+injury+and+kidney+fibrosis.">Disruption of CUL3-mediated ubiquitination causes proximal tubule injury and kidney fibrosis.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4596 (2019).</li><li>Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+imaging+of+the+functioning+kidney.">Multiphoton imaging of the functioning kidney.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 22 (7), 1297-1304 (2011).</li><li>Holliger, P., Hudson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+antibody+fragments+and+the+rise+of+single+domains.">Engineered antibody fragments and the rise of single domains.</a> Nature Biotechnology. 23 (9), 1126-1136 (2005).</li><li>Bunka, D. H., Stockley, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers+come+of+age+-+at+last.">Aptamers come of age - at last.</a> Nature Reviews: Microbiology. 4 (8), 588-596 (2006).</li><li>Kim, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+electrotransport+selectively+enhances+the+transport+of+highly+electromobile+molecules.">Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), E6274-E6283 (2015).</li><li>Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C., Gentleman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+of+acrylamide+sodium+dodecyl+sulphate+(SDS)-based+tissue+clearing+(FASTClear):+a+novel+protocol+of+tissue+clearing+for+3-D+visualization+of+human+brain+tissues.">Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for 3-D visualization of human brain tissues.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).</li><li>Xu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+free-of-acrylamide+clearing+tissue+(FACT)-an+optimized+new+protocol+for+rapid,+high-resolution+imaging+of+3-D+brain+tissue.">Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of 3-D brain tissue.</a> Scientific Reports. 7 (1), 9895 (2017).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159 (4), 911-924 (2014).</li><li>Matryba, P., Bozycki, L., Pawlowska, M., Kaczmarek, L., Stefaniuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+perfusion-based+CUBIC+protocol+for+the+efficient+whole-body+clearing+and+imaging+of+rat+organs.">Optimized perfusion-based CUBIC protocol for the efficient whole-body clearing and imaging of rat organs.</a> Journal of Biophotonics. 11 (5), e201700248 (2018).</li></ol>

光学クリアリング技術は、様々な臓器における微小解剖学の3D可視化と定量化に広く注目されています。ここで、溶媒系クリアリング法(ECi)を、腎臓スライス中の管状全体の3Dイメージング用免疫標識と組み合わせた。この方法は、シンプルで安価で迅速です。しかし、他の研究の質問は、他のクリアリングプロトコル5で最もよく答えられるかもしれません.また、溶媒ベー?...

臓器全体や大きな多細胞構造の研究に対する関心の高まりは、透明な組織を3次元でイメージングする光学クリアリング法の開発につながっています。最近まで、全体の構造の細胞数、長さ、または体積を推定する最良の方法は、2次元1の後続の分析のための組織の全身サンプリングに基づく立体または網羅的な連続断面であり、2,3.しかし、これらの方法は時間がかかり、高いレベルのトレーニングと専門知識を必要とします4.光学クリア法は、サンプル全体で屈折率を平衡化して、3-Dイメージング5、6、7の組織を半透明にすることによって、これらの問題を克服する。
いくつかの光学クリア法が開発されており、溶媒ベースと水性ベースの2つのカテゴリーに分類されます。水性ベースの方法は、さらに単純な浸漬8、9、高水和10、11、およびヒドロゲル埋め込み12、13に分けることができる。溶媒ベースの方法は、組織を脱水し、脂質を除去し、屈折率を約1.55の値に正規化する。ほとんどの溶媒ベースの方法の限界は、GFPなどの一般的に使用されるレポータータンパク質の内因性蛍光の消光、溶媒毒性、一部のイメージングチャンバーまたは対物レンズで使用される接着剤を溶解する能力、および組織の収縮脱水14,15,16,17,18,19,20,21.しかし、溶媒ベースの方法は、簡単で時間効率が良く、多くの異なる組織タイプで働くことができます。
水性ベースの方法は、1.38-1.528、11、12、22、23、24の範囲で屈折指数を有する水溶液中の組織の浸漬に依存する.これらの方法は、内因性蛍光レポータータンパク質の放出を維持し、脱水誘発収縮を防ぐために開発されたが、ほとんどの水性ベースのクリアリング方法の限界は、プロトコルのより長い持続時間、組織の拡張、およびタンパク質修飾(すなわち、ScaleA2のような過水化プロトコルにおける尿素によるタンパク質の部分変性)7、11、23、25。ScaleSは、尿素とソルビトールを組み合わせることにより組織膨張に対処し、尿素誘発組織膨張を脱水してバランスをとり、電子顕微鏡10で評価した組織超構造を保存した。組織の収縮または膨張は、構造の絶対サイズ、オブジェクト間の距離、または体積あたりの細胞密度に影響を与えます。したがって、組織の除去時のサイズ変化の測定は、得られた結果7、26を解釈するのに役立ち得る。
一般に、光学クリアリングのためのプロトコルは、前処理、透過性化、免疫標識(必要な場合)、屈折率照合、高度な光顕微鏡によるイメージング(例えば、2光子、共焦点、またはまたは)光シート蛍光顕微鏡)。クリアリングアプローチのほとんどは、神経組織を視覚化するために開発されており、新しい研究は、他の臓器5での応用を検証しています。この包括的なツールは、糸球体27、28、免疫浸潤28、血管系28、および管状セグメントを含む腎臓構造の信頼性と効率的な分析を可能にするために以前に実証されています29、および健康および疾患における糸球体機能および管状リモデリングの理解を深める理想的なアプローチである。
ここで要約すると、腎臓の管状の免疫染色を組み合わせた溶媒ベースの方法です。安価で非毒性で、すぐに使用する化学エチルシナメート(ECi)による光学クリアリング。完全な管の視覚化および定量を可能にする共焦点顕微鏡イメージ投射。この方法は簡単で、市販の抗体の染色と腎臓スライスの抗原検索を組み合わせ、特殊な装置を必要としないため、ほとんどのラボがアクセスできます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 gauge butterfly needle</td>
			<td>Braun</td>
			<td>Venofix</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-way stopcock</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K420163-4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D analyis software</td>
			<td>Bitplane AG</td>
			<td>IMARIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D analyis software</td>
			<td>Cellprofiler</td>
			<td></td>
			<td>free open-source software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 silk suture</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18020-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml plastic syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-817-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BrdU monoclonal antibody</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11296736001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S0809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-647</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>102516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate-based antigen retrieval solution</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved hemostat</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-812-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Wash Buffer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S3006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissecting microscope</td>
			<td>Motic</td>
			<td>DSK-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding cassettes</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>E478.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl cinnamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>112372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible film/Parafilm M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-AQP2</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-9882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guinea pig anti-NKCC2</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>DOI: 10.1681/ASN.2012040404</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P074.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td>401-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemostat</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>312-471-140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>horizontal rocker</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>S2035-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging dish</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>MWI Animal Health</td>
			<td>501090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro serrefine</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18052-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors</td>
			<td>Merit</td>
			<td>97-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>O4042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-phoshoThr53-NCC</td>
			<td>PhosphoSolutions</td>
			<td>p1311-53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer</td>
			<td>World Precision Instruments Kwik-Sil</td>
			<td>KWIK-SIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue slicer</td>
			<td>Zivic Instruments</td>
			<td>HSRA001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC215682500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Lancer</td>
			<td>Series 1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>MWI Animal Health</td>
			<td>AnaSed Inj SA (Xylazine)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical clearing and imaging of immunolabeled kidney tissue

光学クリアリング技術は、その後の3次元(3-D)イメージングのためにサンプル全体で屈折率を平衡化することにより、組織を透明にします。彼らは、顕微鏡的な距離にわたって広がる顕微鏡多細胞構造を分析する可能性について、すべての研究分野で大きな注目を集めています。腎臓の管、血管、神経、糸球体が多くの方向に広がっていることを考えると、これまで伝統的な2次元技術によって部分的にしか捕捉されていなかったため、組織のクリアリングは腎臓研究の多くの新しい領域を開きました。光学クリアリング方法のリストは急速に成長していますが、この分野の初心者が特定の研究問題に最適な方法を選択することは困難なままです。ここでは、厚いマウス腎臓スライスの抗体標識を組み合わせた簡単な方法です。安価で非毒性ですぐに使用でき、化学エチルシナメートを用いて光学クリアリング。と共焦点イメージング。このプロトコルは、腎臓を浸透させ、特殊な装置を必要とせずに抗体結合を増加させるために抗原検索ステップを使用する方法について説明します。その応用は、腎臓内の異なる多細胞構造をイメージングする際に提示され、組織への不十分な抗体の浸透をトラブルシューティングする方法に対処される。また、内因性蛍風素をイメージングし、非常に大きなサンプルを取得することの潜在的な困難と、それらを克服する方法についても議論する。この簡単な議定書は3次元のティッシュを研究するための容易なセットアップおよび包括的な用具を提供する。

腎臓は、43種類の細胞型31からなる複雑な器官である。これらの細胞のほとんどは、糸球体や細管などの大きな多細胞構造を形成し、その機能は互いの相互作用に大きく依存しています。古典的な2-D組織学的手法は、部分的にこれらの大きな構造をキャプチャし、無傷の構造内の焦点変化を見逃す可能性があります 31.したがって、光学クリアリング技術を?...

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Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

免疫標識腎組織の光学クリアリングとイメージング

抗体標識、光学クリアリング、および高度光顕微鏡検査の組み合わせにより、完全な構造または器官の3次元解析が可能になります。ここでは、厚い腎臓スライスの免疫標識、エチルシナメートによる光学クリアリング、および3次元腎臓構造の可視化と定量を可能にする共焦点イメージングを組み合わせる簡単な方法です。

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...

大規模な多細胞構造の研究に対する関心の高まりは、透明臓器内の大きな構造の3次元可視化と定量化を可能にするこの光学クリアリング技術の開発につながった。このプロトコルは、簡単で安価で簡単に設定でき、3次元で組織を調査するための包括的なツールを提供します。疾患の多層的性質は、常に伝統的な2次元技術によってシミュレートされるとは限りません。組織の三次元分析は、より良い診断と病気を監視するのに役立ちます。この方法は腎臓組織に限定されず、任意の正常な、病気の組織に適用することができます。この単純なプロトコルは、動物の取り扱いのいくつかの経験を持つ任意の科学者のために従うのは簡単です。抗体標識が悪い場合に異なる抗体を試験し、二次抗体のみを制御することが重要です。まず、原稿の指示に従って1X PBSでPBSと3.0%パラホルムアルデヒドを含むヘパリンを調製し、溶液を別々の50 mLプラスチック注射器に移します。パラホルムアルデヒドは有毒であり、ヒュームフードに用意する必要があります。原稿の指示に従って腎臓を収集し、多用する。その後、カプセルを取り出し、腎臓を1mmの厚さのコロナスライスに切ります。準備したパラホルムアルデヒド溶液を15 mL円錐形チューブに浸します。固定後、腎臓スライスを1X洗浄バッファで1時間洗い、次に抗原検索を進めます。500 mL ビーカーで1X抗原マスク解除液の300 mLを加熱します。次に、腎臓スライスを加熱されたバッファーに透過性の埋め込みカセットに入れ、92~98°Cで1時間かき混ぜます。この抗原検索工程では、温度を92~98°Cの間で安定に保つことが重要です。その後、スライスを0.1%Triton X-100で1X洗浄バッファの10 mLに移し、一晩揺らします。翌日、10mLの新鮮な1X洗浄バッファーでスライスを1時間洗います。一次抗体を500マイクロリットルの正常な抗体希釈液で希釈します。37°Cで4日間希釈された一次抗体で腎臓スライスを穏やかに揺らす。インキュベーション後、腎臓スライスを1X洗浄バッファーの10mLで一晩室温で洗浄し、8時間後にバッファーを1回交換します。二次抗体を500マイクロリットルの正常な抗体希釈希釈し、37°Cで4日間腎臓スライスでインキュベートする。このステップから、腎臓のスライスは光から保護されるべきであることに注意してください。二次抗体でインキュベーションした後、腎臓スライスを10 mLの1X洗浄緩衝液で一晩室温で洗浄する。腎臓スライスを脱水するには、高品位100%エタノールの5mLに移し、室温で2時間揺らし、1時間後にエタノールをリフレッシュする。腎臓スライスをエチルシナメートの2mLに浸し、一晩穏やかに揺れます。組織を画像化する準備ができたら、600〜1000マイクロリットルのエチルシナメートをガラス底皿に加え、腎臓スライスを皿に移します。腎臓スライスに丸いカバースリップを置き、パラフィンフィルムで皿を密封します。皿を顕微鏡の撮像プラットフォームに置き、原稿の指示に従ってティッシュをイメージする。このプロトコルは、腎臓組織の3D解析を成功させ、細胞の機能と相互作用を評価するために使用されています。この方法は、蛍光レポーターの急行を引き起こす可能性がありますが、他の強力な蛍光タンパク質は、シグナルクエンチングに抵抗する可能性があります。腹部大動脈拡散は、抗体拡散を改善することができる。場合によっては、抗体の侵入が悪いと表面的なシグナルが生じます。これは、より高濃度または抗体の補充で補正することができます。対象となる抗原が腎臓血管系で発現する場合は、血管内送達を考慮すべきである。しかしながら、尿細管上皮細胞の有端膜内のタンパク質を標的とする抗体は、糸球体濾過障壁を越えて非特異的なシグナルを引き起こさない。この組織は、特定の細胞集団を検出するか、細管セグメント全体を可視化するために抗体で標識することができる。さらに、3Dにおけるタンパク質の共局在化は、複数の抗体を組み合わせることによって達成することができる。抗体標識は、良好な腎臓拡散、抗原検索ステップの使用、および高い抗体濃度で改善できることを覚えておくことが重要です。いくつかの強力なレポータータンパク質は、このプロトコルに従って蛍光シグナルの消光に抵抗する可能性があります。これをテストするために、抗原検索および抗体標識のステップをスキップする。この技術は、構造の立体的性質を尊重し、研究のための多くの新しい分野を開きます。従来の 2 次元解析に関連する必要な仮定と干渉を排除します。

Research

JoVE Journal

Medicine

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In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

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蛍光SAPC-DOPSナノベシクルを用いて脳腫瘍、関節炎のin vivo光イメージング中

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共焦点光学イメージングによるローズベンガル光血栓<em&gt;インビボ</em&gt;：単一の容器ストロークのモデル

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3 D の超音波画像診断: 筋骨格系組織の迅速かつコスト効果の高い計測

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Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation

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