Name: optical clearing and imaging of immunolabeled kidney tissue
Uploaded: 2019-07-22T14:00:00
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T. S.는 DFG 독일 연구 재단 (332853055), 엘스 크뢰너 - 프레세니우스 - 스티퉁 (2015_A197), RWTH 아헨의 의료 학부 (RWTH 반환 자 프로그램)의 보조금에 의해 지원됩니다. V. G. P. 도이치 Gesellschaft 모피 Nephrologie, 알렉산더 폰 훔볼트 재단, 그리고 호주의 국립 건강 및 의료 연구 위원회에서 연구 펠로우십에 의해 지원됩니다. D. H. E는 레덕크 폰디에 의해 지원됩니다. R. K.는 DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), 노스리뉴스트팔리아 주(MIWF-NRW) 및 RWTH 아헨 대학교의 임상 연구를 위한 학제간 센터(O3-11)의 보조금으로 지원됩니다.

참고: 여기에 설명된 모든 실험 절차는 미국 오리건 주 포틀랜드 보건 과학 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)와 독일 아헨의 관련 지방 당국에 의해 승인되었습니다.
1. 마우스 신장의 역행 복부 대동맥 관류 및 고정
<ol><li>전날 또는 저녁에 솔루션을 준비하고 밤새 냉장고에 보관하십시오. 사용하기 전에 실온(RT)에 따뜻한 용액을 사용하십시오.</li>
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	<li>Oh, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mesoscale+connectome+of+the+mouse+brain.">A mesoscale connectome of the mouse brain.</a> Nature. 508 (7495), 207-214 (2014).</li><li>Zhai, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+reconstruction+of+the+mouse+nephron.">3-D reconstruction of the mouse nephron.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 17 (1), 77-88 (2006).</li><li>Nyengaard, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereologic+methods+and+their+application+in+kidney+research.">Stereologic methods and their application in kidney research.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).</li><li>Puelles, V. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent-protein+stabilization+and+high-resolution+imaging+of+cleared,+intact+mouse+brains.">Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains.</a> PLoS ONE. 10 (5), e0124650 (2015).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+PEGASOS+method.">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method.</a> Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).</li><li>Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+3-D+Method+for+Counting+and+Sizing+Podocytes+in+Whole+Glomeruli.">Validation of a 3-D Method for Counting and Sizing Podocytes in Whole Glomeruli.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 27 (10), 3093-3104 (2016).</li><li>Puelles, V. 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Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Representation+and+relative+abundance+of+cell-type+selective+markers+in+whole-kidney+RNA-Seq+data.">Representation and relative abundance of cell-type selective markers in whole-kidney RNA-Seq data.</a> Kidney International. 95 (4), 787-796 (2019).</li><li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FDISCO:+Advanced+solvent-based+clearing+method+for+imaging+whole+organs.">FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs.</a> Science Advances. 5 (1), eaau8355 (2019).</li><li>Sylwestrak, E. L., Rajasethupathy, P., Wright, M. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+3-D+immunostaining+and+optical+imaging+of+the+mouse+brain+demonstrated+in+neural+progenitor+cells.">A method for 3-D immunostaining and optical imaging of the mouse brain demonstrated in neural progenitor cells.</a> PLoS ONE. 8 (8), e72039 (2013).</li><li>Saritas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+CUL3-mediated+ubiquitination+causes+proximal+tubule+injury+and+kidney+fibrosis.">Disruption of CUL3-mediated ubiquitination causes proximal tubule injury and kidney fibrosis.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4596 (2019).</li><li>Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+electrotransport+selectively+enhances+the+transport+of+highly+electromobile+molecules.">Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), E6274-E6283 (2015).</li><li>Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C., Gentleman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+of+acrylamide+sodium+dodecyl+sulphate+(SDS)-based+tissue+clearing+(FASTClear):+a+novel+protocol+of+tissue+clearing+for+3-D+visualization+of+human+brain+tissues.">Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for 3-D visualization of human brain tissues.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).</li><li>Xu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+free-of-acrylamide+clearing+tissue+(FACT)-an+optimized+new+protocol+for+rapid,+high-resolution+imaging+of+3-D+brain+tissue.">Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of 3-D brain tissue.</a> Scientific Reports. 7 (1), 9895 (2017).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159 (4), 911-924 (2014).</li><li>Matryba, P., Bozycki, L., Pawlowska, M., Kaczmarek, L., Stefaniuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+perfusion-based+CUBIC+protocol+for+the+efficient+whole-body+clearing+and+imaging+of+rat+organs.">Optimized perfusion-based CUBIC protocol for the efficient whole-body clearing and imaging of rat organs.</a> Journal of Biophotonics. 11 (5), e201700248 (2018).</li></ol>

광학 클리어링 기술은 다양한 장기에서 미세 해부학의 3차원 시각화 및 정량화에 대해 폭넓은 관심을 받고 있습니다. 여기서, 용매계 클리어링 방법(ECi)을 신장 슬라이스에서 전체 튜블의 3차원 이미징을 위한 면역 라벨링과 결합하였다. 이 방법은 간단하고 저렴하며 빠를 수 있습니다. 그러나 다른 연구 질문은 다른 클리어링 프로토콜5로 가장 잘 대답 할 수 있습니다. 또한 용매...

전체 기관 또는 큰 다세포 구조를 공부에 대한 관심이 증가함에 따라 투명 조직의 이미징을 3차원으로 포함하는 광학 클리어링 방법의 개발이 이해지고 있습니다. 최근까지, 전체 구조의 세포 수, 길이 또는 부피를 추정하는 가장 좋은 방법은 2 차원 1에서 후속 분석을위한 조직의 전신샘플링을 기반으로 하는 입체학 또는 철저한 직렬 단면입니다. 2개 , 3. 그러나 이러한 방법은 시간이 많이 걸리며 높은 수준의 교육 및 전문 지식이 필요합니다4. 광학 클리어링 방법은3D 이미징5,6,7에대한 조직을 반투명하게 만들기 위해 샘플 전체에 걸쳐 굴절률을 평형화함으로써 이러한 문제를 극복한다.
용매 기반 및 수성 기반 방법의 두 가지 주요 범주로 속하는 몇 가지 광학 청산 방법이 개발되었습니다. 수성 기반 방법은 더 간단한 침수 8,9,과수10,11,및 하이드로겔 포함12,13으로나눌 수 있다. 용매 기반 방법은 조직을 탈수시키고, 지질을 제거하고, 굴절률을 약 1.55값으로 정상화한다. 대부분의 용매 기반 방법의 한계는 GFP, 용매 독성, 일부 이미징 챔버 또는 객관적렌즈에 사용되는 접착제를 용해하는 능력, 그리고 동안 조직의 수축과 같은 일반적으로 사용되는 리포터 단백질의 내인성 형광의 담금질입니다. 탈수14,15,16,17,18,19,20,21. 그러나, 용매 기반 방법은 간단하고 시간 효율적이며 다양한 조직 유형에서 작동할 수 있다.
수성 기반 방법은 1.38-1.528,11,12,22,23,24 범위의 굴절 지수가있는 수성 용액에 조직의 침지에 의존합니다. . 이러한 방법은 내인성 형광 리포터 단백질 방출을 보존하고 탈수 유발 수축을 방지하기 위해 개발되었지만, 대부분의 수성 계 청산 방법의 한계는 프로토콜의 더 긴 지속 기간, 조직 확장, 및 단백질 변형 (즉, ScaleA2와 같은 과수성 프로토콜에서 요소로 단백질의 부분 변성) 7,11,23,25. ScaleS는 요소-유도 조직 확장을 탈수시킴으로써 균형을 이룬 소르비톨과 우레아를 결합하여 조직 확장을 해결하고, 전자 현미경 검사법10에의해 평가된 바와 같이 조직 초구조를 보존하였다. 조직 수축 또는 확장은 구조물의 절대 크기, 물체 사이의 거리 또는 부피당 세포 밀도에 영향을 미칩니다. 따라서, 조직의 정리 시 크기 변화의 측정은 얻어진결과 7,26을해석하는 데 도움이 될 수 있다.
일반적으로 광학 클리어링을 위한 프로토콜은 전처리, 투과, 면역 라벨링(필요한 경우), 굴절률 매칭 및 고급 광 현미경(예: 2광자, 공초점 또는 광시트 형광 현미경 검사법). 대부분의 클리어링 접근법은 신경 조직을 시각화하기 위해 개발되었으며, 새로운 연구는 다른장기에서 의 응용 프로그램을 검증했습니다 5. 이 포괄적인 도구는 사구체27,28,면역 침투28, 혈관 구조28,및 수관 분절을 포함하여 신장 구조의 안정적이고 효율적인 분석을 허용하는 것으로 이전에 입증되었습니다. 29,그것은 건강과 질병에 사구 기능 및 tubule 리모델링의 이해를 더 나은 이상적인 접근이다.
여기서 요약하면 신장 관의 면역 염색을 결합하는 용매 기반 방법이다. 저렴하고 무독성이며 즉시 사용이 간 화학 물질인 에틸 시나메이트(ECi)가 있는 광학 클리어링; 완전한 수화 시각화 및 정량화를 허용하는 공초점 현미경 이미징. 이 방법은 간단하고, 신장 슬라이스의 항원 회수와 상업용 항체의 얼룩을 결합하며, 대부분의 실험실에서 접근 할 수있는 특수 장비를 필요로하지 않습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 gauge butterfly needle</td>
			<td>Braun</td>
			<td>Venofix</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-way stopcock</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K420163-4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D analyis software</td>
			<td>Bitplane AG</td>
			<td>IMARIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D analyis software</td>
			<td>Cellprofiler</td>
			<td></td>
			<td>free open-source software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 silk suture</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18020-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml plastic syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-817-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BrdU monoclonal antibody</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11296736001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S0809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-647</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>102516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate-based antigen retrieval solution</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved hemostat</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-812-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Wash Buffer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S3006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissecting microscope</td>
			<td>Motic</td>
			<td>DSK-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding cassettes</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>E478.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl cinnamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>112372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible film/Parafilm M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-AQP2</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-9882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guinea pig anti-NKCC2</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>DOI: 10.1681/ASN.2012040404</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P074.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td>401-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemostat</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>312-471-140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>horizontal rocker</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>S2035-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging dish</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>MWI Animal Health</td>
			<td>501090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro serrefine</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18052-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors</td>
			<td>Merit</td>
			<td>97-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>O4042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-phoshoThr53-NCC</td>
			<td>PhosphoSolutions</td>
			<td>p1311-53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer</td>
			<td>World Precision Instruments Kwik-Sil</td>
			<td>KWIK-SIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue slicer</td>
			<td>Zivic Instruments</td>
			<td>HSRA001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC215682500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Lancer</td>
			<td>Series 1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>MWI Animal Health</td>
			<td>AnaSed Inj SA (Xylazine)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical clearing and imaging of immunolabeled kidney tissue

광학 클리어링 기술은 후속 3차원(3차원) 이미징을 위해 샘플 전체에 걸쳐 굴절률을 평형화하여 조직을 투명하게 만듭니다. 그(것)들은 거시적인 거리를 통해 확장하는 현미경 다세포 구조물을 분석하는 잠재력을 위한 모든 연구 지역에 있는 큰 관심을 받았습니다. 신장 tubules, 혈관, 신경 및 사구체가 많은 방향으로 확장한다는 것을 감안할 때, 지금까지 전통적인 2 차원 기술에 의해 부분적으로 포착된, 조직 정리는 또한 신장 연구의 많은 새로운 지역을 열었습니다. 광학 클리어링 방법의 목록은 빠르게 성장하고 있지만,이 분야의 초보자가 주어진 연구 질문에 가장 적합한 방법을 선택하는 것은 여전히 어렵습니다. 여기에 제공된 두꺼운 마우스 신장 슬라이스의 항체 라벨링을 결합하는 간단한 방법이 있다; 저렴하고 무독성이며 즉시 사용할 수있는 화학 물질 인 에틸 시나 메이트 (ethyl cinnamate)가있는 광학 클리어링; 및 공초점 이미징. 이 프로토콜은 신장을 침투시키고 항원 회수 단계를 사용하여 항체-결합을 증가시키는 방법을 전문 장비를 필요로 하지 않고 설명한다. 그것의 응용은 신장 내의 다른 다세포 구조물을 화상 진찰에서 제출되고, 조직에 나쁜 항체 침투를 해결하는 방법은 해결됩니다. 우리는 또한 내인성 형광을 화상 진찰의 잠재적인 어려움및 아주 큰 견본을 취득하고 그(것)들을 극복하는 방법 토론합니다. 이 간단한 프로토콜은 3차원으로 조직을 연구할 수 있는 설치가 간편하고 포괄적인 도구를 제공합니다.

신장은 43개의 다른 세포 모형31로이루어져 있는 복잡한 기관입니다. 이 세포의 대부분은 사구체및 tubules와 같은 큰 다세포 구조물을 형성하고, 그들의 기능은 서로 상호 작용에 높게 의존합니다. 고전적 2-D 조직학 기법은 부분적으로 이러한 큰 구조물을 포착하고 그대로구조(31)내에서 초점 변화를 놓칠 수 있다. 따라서 광학 클리어링 기술을 사용한 3D 분석은 ?...

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Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

면역 표지된 신장 조직의 광학 클리어링 및 화상 진찰

항체 라벨링, 광학 클리어링 및 고급 광 현미경의 조합은 완전한 구조 또는 장기의 3차원 분석을 가능하게 합니다. 여기에 설명된 간단한 방법은 두꺼운 신장 슬라이스의 면역 라벨링, 에틸 시나메이트와 광학 클리어링, 3차원 신장 구조의 시각화 및 정량화를 가능하게 하는 공초점 이미징을 결합하는 간단한 방법입니다.

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...

대형 다세포 구조를 연구하는 데 대한 관심이 높아짐에 따라 투명한 장기 내에서 대형 구조물의 3차원 시각화 및 정량화를 가능하게 하는 이 광학 클리어링 기술의 개발로 이어졌습니다. 이 프로토콜은 간단하고 저렴하며 쉽게 설정하고 조직을 3 차원으로 조사하는 포괄적 인 도구를 제공합니다. 질병의 다층 특성은 항상 기존의 2 차원 기술에 의해 시뮬레이션 될 수 없습니다.조직의 3차원 분석은 질병을 더 잘 진단하고 모니터링하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 신장 조직에 국한되지 않으며 정상 및 질병 조직에 적용 될 수 있습니다. 이 간단한 프로토콜은 동물 취급경험이 있는 과학자를 위해 쉽게 따라갈 수 있습니다.불량 한 항체 라벨링의 경우에 다른 항체를 시험하고, 이차 항체 만 통제를 하는 것이 중요합니다. 원고 방향에 따라 PBS와 3.0%의 파라포름알데히드를 1X PBS로 포함하는 헤파린을 준비하고 솔루션을 별도의 50mL 플라스틱 주사기로 전송하는 것으로 시작합니다. 파라포름알데히드는 독성이 있으며 연기 후드에 준비해야 합니다.원고 의 지시에 따라 신장을 수집하고 교묘하게 하십시오. 그런 다음 캡슐을 제거하고 신장을 1mm 두께의 관상 슬라이스로 자른다. 15mL 원문 튜브에 준비된 파라포름알데히드 용액으로 신장 슬라이스를 담급하십시오.고정 후, 수평 로커에 1 시간 동안 1X 세척 버퍼로 신장 슬라이스를 두 번 세척 한 다음 항원 검색을 진행합니다. 500mL 비커에 1X 항원 미마스킹 용액300mL를 가열합니다. 그런 다음 가열된 완충액에 투과할 수 있는 포함 된 카세트에 신장 슬라이스를 동봉하고 섭씨 92에서 98도에서 1 시간 동안 저어줍니다.이 항원 회수 단계에 대해 섭씨 92도에서 98도 사이의 온도를 안정적으로 유지하는 것이 중요합니다. 그런 다음 슬라이스를 0.1% Triton X-100으로 1X 세척 버퍼의 10mL로 옮기고 하룻밤 동안 흔들어 주세요. 다음 날, 1 시간 동안 신선한 1X 세척 버퍼의 10 mL로 슬라이스를 두 번 씻으시다.일반 항체 희석제의 500 마이크로리터에서 1차 항체를 희석시. 섭씨 37도에서 4일 동안 희석된 1차 항체의 신장 슬라이스를 부드럽게 흔들어 주세요. 인큐베이션 후, 신장 슬라이스를 실온에서 하룻밤 동안 10mL의 10mL로 씻어 8시간 후에 완충제를 한 번 변경한다.이차 항체를 정상 항체 희석제 500 마이크로리터로 희석하고 섭씨 37도에서 4일 동안 신장 슬라이스로 배양한다. 이 단계에서는 신장 조각을 빛으로부터 보호해야 합니다. 이차 항체로 인큐베이션 후, 실온에서 하룻밤 동안 10mL의 10mL로 신장 슬라이스를 씻는다.신장 슬라이스를 탈수하려면, 100% 에탄올의 5mL로 옮기고 실온에서 2시간 동안 흔들어 1시간 후에 에탄올을 상쾌하게 한다. 신장 슬라이스를 에틸 시나메이트 2mL에 담그고 하룻밤 동안 부드럽게 흔들어 주세요. 조직을 이미지화할 준비가 되면 에틸 시나메이트 600~1,000마이크로리터를 유리 바닥 접시에 넣고 신장 슬라이스를 접시에 옮길 수 있습니다.신장 슬라이스에 둥근 커버 슬립을 놓고 파라핀 필름으로 접시를 밀봉하십시오. 현미경 이미징 플랫폼에 접시를 놓고 원고 의 지시에 따라 조직을 이미지합니다. 이 프로토콜은 성공적으로 신장 조직에 3D 분석을 수행하고 세포 기능 및 상호 작용을 평가하는 데 사용되었습니다.이 방법은 형광 기자담금을 유발할 수 있지만 다른 강력한 형광 단백질은 신호 담금질에 저항할 수 있다. 복부 대동맥 풍부혈은 항체 확산을 향상시킬 수 있습니다. 어떤 경우에는 항체 침투가 좋지 못하여 피상적 신호가 발생합니다.이것은 항체의 더 높은 농도 또는 보충으로 정정될 수 있습니다. 관심있는 항원이 신장 혈관에서 표현되는 경우에 내트라바산 전달은 고려되어야 합니다. 그러나, 관상피 세포의 정압 막에서 단백질을 표적으로 하는 항체는 구체 여과 장벽을 교차하지 않으며 특이하지 않은 신호를 일으키는 원인이 되지 않습니다.조직은 특정 세포 집단을 검출하거나 전체 관균 세그먼트를 시각화하기 위하여 항체로 표지될 수 있습니다. 더욱이, 3D에서 단백질의 공동지역화는 다중 항체를 결합하여 달성될 수 있다. 항체 라벨링은 좋은 신장 풍부, 항원 회수 단계의 사용 및 높은 항체 농도로 개선될 수 있다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.몇몇 강한 기자 단백질은 이 프로토콜에 따라 형광 신호의 담금질에 저항할 수 있습니다. 이를 테스트하려면 항원 검색 및 항체 라벨링 단계를 건너뜁니다. 이 기술은 구조의 입체적 특성을 존중하고 연구를위한 많은 새로운 영역을 엽니 다.기존의 2차원 분석과 관련된 필요한 가정과 간섭을 제거합니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

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피부 조직 산소와 혈관 기능의 듀얼 모드 영상

Accurate assessment of cutaneous tissue oxygenation and vascular function is important for appropriate detection, staging, and treatment of many health ...

연구

의학

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