Name: optical clearing and imaging of immunolabeled kidney tissue
Uploaded: 2019-07-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue at JoVE.com

O T. S. é apoiado por concessões da Fundação de pesquisa alemão de DFG (332853055), Else Kröner-Fresenius-Stiftung (2015_A197), e a faculdade médica do RWTH AIX-lo-Chapelle (programa do Returner de RWTH). V. G. P. é apoiado por bolsas de pesquisa da Deutsche Gesellschaft Fur Nephrologie, da Fundação Alexander von Humboldt, e do Conselho Nacional de saúde e pesquisa médica da Austrália. D. H. E é apoiado por Fondation LeDucq. R. K. é apoiado por subvenções do DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), o estado de Northrhinewestfalia (MIWF-NRW) e o Centro Interdisciplinar de pesquisa clínica na Universidade RWTH Aachen (O3-11).

Nota: Todos os procedimentos experimentais aqui descritos foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) da Oregon Health and Science University, Portland, Oregon, EUA, e autoridades locais relevantes em Aachen, Alemanha.
1. perfusão aórtica abdominal retrógrada e fixação de rins de rato
<ol><li>Prepare soluções no mesmo dia ou noite antes e armazene em uma geladeira durante a noite. Aqueça as soluções à temperatura ambiente (RT) a...

<ol>
	<li>Oh, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mesoscale+connectome+of+the+mouse+brain.">A mesoscale connectome of the mouse brain.</a> Nature. 508 (7495), 207-214 (2014).</li><li>Zhai, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+reconstruction+of+the+mouse+nephron.">3-D reconstruction of the mouse nephron.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 17 (1), 77-88 (2006).</li><li>Nyengaard, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereologic+methods+and+their+application+in+kidney+research.">Stereologic methods and their application in kidney research.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).</li><li>Puelles, V. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=We+can+see+clearly+now:+optical+clearing+and+kidney+morphometrics.">We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).</li><li>Ariel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+tissue+clearing.">A beginner's guide to tissue clearing.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 84, 35-39 (2017).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li><li>Kuwajima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearT:+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue.">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScaleS:+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging.">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).</li><li>Susaki, E. 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U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy:+3-D+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain.">Ultramicroscopy: 3-D visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3-DISCO.">3-D imaging of solvent-cleared organs using 3-DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li><li>Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent-protein+stabilization+and+high-resolution+imaging+of+cleared,+intact+mouse+brains.">Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains.</a> PLoS ONE. 10 (5), e0124650 (2015).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+PEGASOS+method.">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method.</a> Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).</li><li>Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2,2'-thiodiethanol:+a+new+water+soluble+mounting+medium+for+high+resolution+optical+microscopy.">2,2'-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy.</a> Microscopy Research and Technique. 70 (1), 1-9 (2007).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li><li>Hua, L., Zhou, R., Thirumalai, D., Berne, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urea+denaturation+by+stronger+dispersion+interactions+with+proteins+than+water+implies+a+2-stage+unfolding.">Urea denaturation by stronger dispersion interactions with proteins than water implies a 2-stage unfolding.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (44), 16928-16933 (2008).</li><li>Wan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+seven+optical+clearing+methods+in+mouse+brain.">Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain.</a> Neurophotonics. 5 (3), 035007 (2018).</li><li>Puelles, V. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+3-D+Method+for+Counting+and+Sizing+Podocytes+in+Whole+Glomeruli.">Validation of a 3-D Method for Counting and Sizing Podocytes in Whole Glomeruli.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 27 (10), 3093-3104 (2016).</li><li>Puelles, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+3-D+analysis+using+optical+tissue+clearing+documents+the+evolution+of+murine+rapidly+progressive+glomerulonephritis.">Novel 3-D analysis using optical tissue clearing documents the evolution of murine rapidly progressive glomerulonephritis.</a> Kidney International (in press). , (2019).</li><li>Saritas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Clearing+in+the+Kidney+Reveals+Potassium-Mediated+Tubule+Remodeling.">Optical Clearing in the Kidney Reveals Potassium-Mediated Tubule Remodeling.</a> Cell Reports. 25 (10), 2668-2675 (2018).</li><li>Masselink, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+applicability+of+a+streamlined+ethyl+cinnamate-based+clearing+procedure.">Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure.</a> Development. 146 (3), (2019).</li><li>Clark, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Representation+and+relative+abundance+of+cell-type+selective+markers+in+whole-kidney+RNA-Seq+data.">Representation and relative abundance of cell-type selective markers in whole-kidney RNA-Seq data.</a> Kidney International. 95 (4), 787-796 (2019).</li><li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FDISCO:+Advanced+solvent-based+clearing+method+for+imaging+whole+organs.">FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs.</a> Science Advances. 5 (1), eaau8355 (2019).</li><li>Sylwestrak, E. L., Rajasethupathy, P., Wright, M. A., Jaffe, A., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+Intact-Tissue+Transcriptional+Analysis+at+Cellular+Resolution.">Multiplexed Intact-Tissue Transcriptional Analysis at Cellular Resolution.</a> Cell. 164 (4), 792-804 (2016).</li><li>Shah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+RNA+detection+at+depth+by+hybridization+chain+reaction+and+tissue+hydrogel+embedding+and+clearing.">Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing.</a> Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).</li><li>Gleave, J. A., Lerch, J. P., Henkelman, R. M., Nieman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+3-D+immunostaining+and+optical+imaging+of+the+mouse+brain+demonstrated+in+neural+progenitor+cells.">A method for 3-D immunostaining and optical imaging of the mouse brain demonstrated in neural progenitor cells.</a> PLoS ONE. 8 (8), e72039 (2013).</li><li>Saritas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+CUL3-mediated+ubiquitination+causes+proximal+tubule+injury+and+kidney+fibrosis.">Disruption of CUL3-mediated ubiquitination causes proximal tubule injury and kidney fibrosis.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4596 (2019).</li><li>Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+electrotransport+selectively+enhances+the+transport+of+highly+electromobile+molecules.">Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), E6274-E6283 (2015).</li><li>Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C., Gentleman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+of+acrylamide+sodium+dodecyl+sulphate+(SDS)-based+tissue+clearing+(FASTClear):+a+novel+protocol+of+tissue+clearing+for+3-D+visualization+of+human+brain+tissues.">Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for 3-D visualization of human brain tissues.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).</li><li>Xu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+free-of-acrylamide+clearing+tissue+(FACT)-an+optimized+new+protocol+for+rapid,+high-resolution+imaging+of+3-D+brain+tissue.">Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of 3-D brain tissue.</a> Scientific Reports. 7 (1), 9895 (2017).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159 (4), 911-924 (2014).</li><li>Matryba, P., Bozycki, L., Pawlowska, M., Kaczmarek, L., Stefaniuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+perfusion-based+CUBIC+protocol+for+the+efficient+whole-body+clearing+and+imaging+of+rat+organs.">Optimized perfusion-based CUBIC protocol for the efficient whole-body clearing and imaging of rat organs.</a> Journal of Biophotonics. 11 (5), e201700248 (2018).</li></ol>

Técnicas de compensação óptica receberam ampla atenção para visualização 3-D e quantificação de microanatomia em vários órgãos. Aqui, o método solvente-baseado do esclarecimento (ECI) foi combinado com o Immunolabeling para a imagem latente 3-D de túbulos inteiros em fatias do rim. Este método é simples, barato e rápido. No entanto, outras questões de pesquisa podem ser melhor respondidas com outros protocolos de compensação5. Também é importante ter em mente que os métodos...

O crescente interesse em estudar órgãos inteiros ou grandes estruturas multicelulares levou ao desenvolvimento de métodos de compensação óptica que envolvem imagens de tecido transparente em três dimensões. Até recentemente, os melhores métodos para estimar o número de células, o comprimento ou o volume de estruturas inteiras foram a estereologia ou o corte Serial exaustivo, que se baseia na amostragem sistêmica do tecido para posterior análise em duas dimensões1, 2. º , 3. no entanto, estes métodos são demorados e necessitam de um elevado nível de formação e especialização4. Os métodos de compensação óptica superam esses problemas equilibrando o índice de refração ao longo de uma amostra para tornar o tecido translúcido para imagens 3-D5,6,7.
Vários métodos de compensação óptica foram desenvolvidos, que se enquadram em duas categorias principais: métodos à base de solvente e aquosa. Métodos de base aquosa podem ser divididos emimersão simples8,9, hiperhidratação10,11e hidrogel incorporando12,13. Os métodos à base de solvente desidratam o tecido, removem os lipídios e normalizam o índice de refração para um valor em torno de 1,55. As limitações da maioria dos métodos baseados em solventes são a têmpera de fluorescência endógena de proteínas de repórter comumente usadas, como GFP, toxicidade por solventes, capacidade de dissolver colas usadas em algumas câmaras de imagem ou lentes objetivas, e encolhimento de tecido durante desidratação14,15,16,17,18,19,20,21. Entretanto, os métodos solvente-baseados são simples, tempo-eficientes, e podem trabalhar em um número de tipos diferentes do tecido.
Os métodos de base aquosa dependem da imersão do tecido em soluções aquosas que possuem índices de refração na faixa de 1,38-1,528,11,12,22,23,24 . Estes métodos foram desenvolvidos para preservar a emissão de proteínas de repórter fluorescente endógena e prevenir o encolhimento induzido por desidratação, mas as limitações da maioria dos métodos de compensação à base de aquosa incluem uma duração mais longa do protocolo, expansão tecidual e modificação protéica (ou seja, desnaturação parcial de proteínas por ureia em protocolos hiperhidratantes como SCALea2)7,11,23,25. SCALeS abordou a expansão tecidual através da combinação de ureia com sorbitol, que contrapesos por desidratação a expansão tecidual induzida por ureia, e preservou a ultraestrutura tecidual avaliada pela microscopia eletrônica10. O encolhimento ou a expansão tecidual afetam os tamanhos absolutos das estruturas, as distâncias entre objetos ou a densidade celular por volume; assim, a mensuração das alterações de tamanho na compensação do tecido pode ajudar a interpretar os resultados obtidos7,26.
Em geral, um protocolo para compensação óptica consiste em várias etapas, incluindo pré-tratamento, permeabilização, imunolabeling (se necessário), correspondência de índice de refração e imagem com microscopia de luz avançada (por exemplo, dois fótons, confocal ou microscopia de fluorescência da luz-folha). A maioria das abordagens de compensação foram desenvolvidas para visualizar o tecido neuronal, e estudos emergentes validou sua aplicação em outros órgãos5. Esta ferramenta abrangente tem sido demonstrada anteriormente para permitir a análise confiável e eficiente de estruturas renais, incluindo glomérulos27,28, imune infiltrados28, vasculatura28, e segmentos túbulo 29, e é uma aproximação ideal para melhorar a compreensão da remodelação da função glomerular e do túbulo na saúde e na doença.
Resumido aqui é um método baseado em solvente que combina imunocoloração de túbulos renais; clareira óptica com produtos químicos de etilo (ECi), não tóxico e pronto a utilizar; e a imagem latente da microscopia confocal que permite a visualização e a quantificação completas do túbulo. Este método é simples, combina o antígeno-recuperação de fatias do rim com mancha de anticorpos comerciais, e não exige o equipamento especializado, que o faz acessível à maioria de laboratórios.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 gauge butterfly needle</td>
			<td>Braun</td>
			<td>Venofix</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-way stopcock</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K420163-4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D analyis software</td>
			<td>Bitplane AG</td>
			<td>IMARIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D analyis software</td>
			<td>Cellprofiler</td>
			<td></td>
			<td>free open-source software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 silk suture</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18020-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml plastic syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-817-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BrdU monoclonal antibody</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11296736001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S0809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-647</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>102516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate-based antigen retrieval solution</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved hemostat</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-812-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Wash Buffer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S3006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissecting microscope</td>
			<td>Motic</td>
			<td>DSK-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding cassettes</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>E478.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl cinnamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>112372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible film/Parafilm M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-AQP2</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-9882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guinea pig anti-NKCC2</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>DOI: 10.1681/ASN.2012040404</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P074.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td>401-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemostat</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>312-471-140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>horizontal rocker</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>S2035-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging dish</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>MWI Animal Health</td>
			<td>501090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro serrefine</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18052-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors</td>
			<td>Merit</td>
			<td>97-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>O4042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-phoshoThr53-NCC</td>
			<td>PhosphoSolutions</td>
			<td>p1311-53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer</td>
			<td>World Precision Instruments Kwik-Sil</td>
			<td>KWIK-SIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue slicer</td>
			<td>Zivic Instruments</td>
			<td>HSRA001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC215682500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Lancer</td>
			<td>Series 1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>MWI Animal Health</td>
			<td>AnaSed Inj SA (Xylazine)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical clearing and imaging of immunolabeled kidney tissue

As técnicas óticas do esclarecimento rendem o tecido transparente equilibrando o índice refração durante todo uma amostra para a imagem latente tridimensional (3-D) subseqüente. Eles receberam grande atenção em todas as áreas de pesquisa para o potencial de analisar estruturas multicelulares microscópicas que se estendem por distâncias macroscópicas. Dado que os túbulos do rim, a vasculatura, os nervos, e os glomérulos estendem em muitos sentidos, que foram capturados somente parcialmente por técnicas bidimensionais tradicionais até agora, o esclarecimento do tecido igualmente abriu muitas áreas novas da pesquisa do rim. A lista de métodos de compensação óptica está crescendo rapidamente, mas continua a ser difícil para iniciantes neste campo escolher o melhor método para uma determinada questão de pesquisa. Fornecido aqui é um método simples que combina a rotulagem do anticorpo de fatias grossas do rim do rato; compensação óptica com cinetato de etilo químico barato, não tóxico e pronto a usar; e imagem latente confocal. Este protocolo descreve como perfuse rins e usa uma etapa do antígeno-recuperação para aumentar o anticorpo-emperramento sem exigir o equipamento especializado. Sua aplicação é apresentada em estruturas multicelulares diferentes da imagem latente dentro do rim, e como pesquisar defeitos a penetração pobre do anticorpo no tecido é endereçada. Discutimos também as dificuldades potenciais de fluoróforos endógenos de imagem e adquirindo amostras muito grandes e como superá-las. Este protocolo simples fornece uma ferramenta easy-to-setup e detalhada para estudar o tecido em três dimensões.

Os rins são órgãos complexos compostos por 43 diferentes tipos de células31. A maioria dessas células formam grandes estruturas multicelulares, como glomérulos e túbulos, e sua função é altamente dependente de interações entre si. As técnicas histológicas clássicas de 2-D capturam parcialmente estas grandes estruturas e podem faltar mudanças focais dentro das estruturas intactas31. Assim, a análise 3-D usando técnicas de compensação óptica ajuda a enten...

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Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

Esclarecimento ótico e imagem latente do tecido Immunolabeled do rim

A combinação da rotulagem do anticorpo, do esclarecimento ótico, e da microscopia de luz avançada permite a análise tridimensional de estruturas ou de órgãos completos. Descrito aqui é um método simples para combinar o Immunolabeling de fatias de rim grossas, o esclarecimento ótico com cinnamate do Ethyl, e a imagem latente confocal que permite o visualização e a quantificação de estruturas tridimensionais do rim.

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...

O crescente interesse em estudar grandes estruturas multicelulares levou ao desenvolvimento desta técnica de compensação óptica que permite uma visualização tridimensional e quantificação de grandes estruturas dentro de órgãos transparentes. Este protocolo fornece uma ferramenta simples, barata, fácil de configurar e abrangente para investigar tecidos em três dimensões. A natureza multicamadas de uma doença nem sempre pode ser simulada por técnicas bidimensionais tradicionais.A análise tridimensional do tecido pode ajudar a diagnosticar e monitorar melhor a doença. Este método não se restringe ao tecido renal e pode ser aplicado a qualquer tecido normal e doente. Este protocolo simples é fácil de seguir para qualquer cientista com alguma experiência em manejo animal.É importante testar diferentes anticorpos em caso de rotulagem de anticorpos pobres, e realizar controles secundários de anticorpos. Comece preparando heparina contendo PBS e 3,0% paraformaldeído em 1X PBS de acordo com as instruções do manuscrito e transferindo as soluções para seringas plásticas separadas de 50 mL. Paraformaldeído é tóxico e deve ser preparado no capô da fumaça.Coletar e profuser o rim de acordo com as instruções do manuscrito. Em seguida, remova a cápsula e corte o rim em fatias coronais de um mm de espessura. Mergulhe as fatias renais com a solução preparada paraformaldeído em um tubo cônico de 15 mL.Após a fixação, lave a fatia de rim duas vezes com tampão de lavagem 1X por uma hora em um roqueiro horizontal e, em seguida, proceda com a recuperação de antígeno. Aqueça 300 mL de solução de unmasking de antígeno 1X em um béquer de 500 mL. Em seguida, inclua uma fatia de rim em uma fita de incorporação permeável ao tampão aquecido e mexa-a por uma hora a 92 a 98 graus Celsius.É importante manter a temperatura estável entre 92 e 98 graus Celsius para esta etapa de recuperação de antígenos. Em seguida, transfira a fatia em 10 mL de tampão de lavagem 1X com 0,1% Triton X-100 e arrase durante a noite. No dia seguinte, lave a fatia duas vezes com 10 mL de tampão de lavagem 1X fresco por uma hora.Diluir o anticorpo primário em 500 microliters de anticorpos normais diluídos. Balance suavemente a fatia de rim em anticorpo primário diluído por quatro dias a 37 graus Celsius. Após a incubação, lave a fatia de rim em 10 mL de tampão de lavagem de 1X durante a noite em temperatura ambiente, alterando o buffer uma vez após oito horas.Diluir os anticorpos secundários em 500 microliters de anticorpos normais diluídos e incubar com a fatia de rim por quatro dias a 37 graus Celsius. Por favor, note que a partir deste passo em frente, a fatia de rim deve ser protegida da luz. Após a incubação com anticorpos secundários, lave a fatia de rim em 10 mL de tampão de lavagem de 1X durante a temperatura ambiente.Para desidratar a fatia renal, transfira-a para cinco mL de alto grau 100% etanol e abale-a por duas horas em temperatura ambiente, refrescando o etanol após uma hora. Mergulhe a fatia de rim em dois mL de cinnamate etílico e arrase suavemente durante a noite. Quando estiver pronto para a imagem do tecido, adicione 600 a 1000 microliters de cinnamate etílico em um prato de fundo de vidro e transfira a fatia de rim para o prato.Coloque um deslizamento de cobertura redonda na fatia de rim e sele o prato com filme de parafina. Coloque o prato sobre a plataforma de imagem do microscópio e imagem do tecido de acordo com as instruções do manuscrito. Este protocolo tem sido usado para realizar com sucesso a análise 3D no tecido renal e avaliar funções e interações celulares.O método pode causar a extinção de repórteres fluorescentes, mas outras proteínas fluorescentes fortes podem resistir à extinção do sinal. Profusão de aoórtica abdominal pode melhorar a difusão de anticorpos. Em alguns casos, a má penetração de anticorpos resulta em um sinal superficial.Isso pode ser corrigido com maiores concentrações ou reposição de anticorpos. O parto intravascular deve ser considerado se o antígeno de interesse for expresso na vasculatura renal. No entanto, anticorpos que visam proteínas na membrana apical das células epiteliais do túbulo não cruzam a barreira de filtração glomerular e causam sinais inespecíficos.O tecido pode ser rotulado com os anticorpos para detectar uma população celular específica ou para visualizar segmentos de túbulos inteiros. Além disso, a colocalização de proteínas em 3D pode ser alcançada combinando múltiplos anticorpos. É importante lembrar que a rotulagem de anticorpos pode ser melhorada com boa profusão renal, uso de passo de recuperação de antígeno e alta concentração de anticorpos.Algumas proteínas fortes dos repórteres podem resistir à extinção do sinal fluorescente seguindo este protocolo. Para testar isso, pule as etapas de recuperação de antígenos e rotulagem de anticorpos. Essa técnica respeita a natureza tridimensional das estruturas e abre muitas novas áreas para a pesquisa.Elimina as suposições e interferências necessárias associadas à análise bidimensional tradicional.

Research

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Dual-mode de imagem de oxigenação dos tecidos cutâneos e Função Vascular

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Perinatal brain injury remains a significant cause of infant mortality  and morbidity, but there is not yet an effective bedside tool that can  accurately ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

In Vivo Imagem Óptico de tumores cerebrais e artrite Usando fluorescente SAPC-DOPS nanovesículas

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

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Cerenkov luminescência imagem de Interscapular Brown tecido adiposo

Brown adipose tissue (BAT), widely known as a &#8220;good fat&#8221; plays pivotal roles for thermogenesis in mammals. This special tissue is closely ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

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Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation

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