Name: specific labeling of mitochondrial nucleoids for time-lapse structured illumination microscopy
Uploaded: 2020-06-04T13:00:00
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저자는 아시파 아크타르와 안젤리카 람볼드 (면역 생물학 및 후성 유전학에 대한 막스 플랑크 연구소 모두) HeLa 세포를 제공하기위한 인정.

참고: 여기에서 언급된 모든 세포주들은 10% 태아 소 혈청(FBS), 글루타민, 페니실린/스트렙토마이신 및 피루바테로 보충된 고당포도도당 덜베코의 변형 된 독수리 배지 (DMEM)에서 배양되었습니다. 인큐베이터에서 최대 37°C까지 예열하여 라벨링 및 이미징 당일에 사용되는 모든 매체 및 보충제를 5%CO2로평형화한다. 라벨링을 포함한 모든 세포 배양 작업은 층류 후드 하에서 멸균...

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	<li>Kaufman, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+transcription+factor+TFAM+coordinates+the+assembly+of+multiple+DNA+molecules+into+nucleoid-like+structures.">The mitochondrial transcription factor TFAM coordinates the assembly of multiple DNA molecules into nucleoid-like structures.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (9), 3225-3236 (2007).</li><li>Farge, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+sliding+and+DNA+denaturation+are+essential+for+DNA+organization+by+human+mitochondrial+transcription+factor+A.">Protein sliding and DNA denaturation are essential for DNA organization by human mitochondrial transcription factor A.</a> Nature Communications. 3, 1013 (2012).</li><li>Bogenhagen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+nucleoid+structure.">Mitochondrial DNA nucleoid structure.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (9-10), 914-920 (2012).</li><li>Kang, D., Kim, S. H., Hamasaki, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+transcription+factor+A+(TFAM):+roles+in+maintenance+of+mtDNA+and+cellular+functions.">Mitochondrial transcription factor A (TFAM): roles in maintenance of mtDNA and cellular functions.</a> Mitochondrion. 7 (1-2), 39-44 (2007).</li><li>Tauber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+mitochondrial+nucleoids+upon+mitochondrial+network+fragmentation+and+network+reintegration+in+HEPG2+cells.">Distribution of mitochondrial nucleoids upon mitochondrial network fragmentation and network reintegration in HEPG2 cells.</a> International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 45 (3), 593-603 (2013).</li><li>Garrido, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+dynamics+of+human+mitochondrial+nucleoids.">Composition and dynamics of human mitochondrial nucleoids.</a> Molecular Biology of the Cell. 14 (4), 1583-1596 (2003).</li><li>Pernas, L., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mito-Morphosis:+Mitochondrial+Fusion,+Fission,+and+Cristae+Remodeling+as+Key+Mediators+of+Cellular+Function.">Mito-Morphosis: Mitochondrial Fusion, Fission, and Cristae Remodeling as Key Mediators of Cellular Function.</a> Annual Review of Physiology. 78, 505-531 (2016).</li><li>Caielli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidized+mitochondrial+nucleoids+released+by+neutrophils+drive+type+I+interferon+production+in+human+lupus.">Oxidized mitochondrial nucleoids released by neutrophils drive type I interferon production in human lupus.</a> Journal of Experimental Medicine. 213 (5), 697-713 (2016).</li><li>Okayama, S., Ohta, K., Higashi, R., Nakamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopic+observation+of+mitochondrial+DNA+in+mammalian+cells+by+using+focused-ion+beam+scanning+electron+microscopy.">Correlative light and electron microscopic observation of mitochondrial DNA in mammalian cells by using focused-ion beam scanning electron microscopy.</a> Microscopy (Oxf). 63 (Suppl 1), i35 (2014).</li><li>Alan, L., Spacek, T., Jezek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delaunay+algorithm+and+principal+component+analysis+for+3D+visualization+of+mitochondrial+DNA+nucleoids+by+Biplane+FPALM/dSTORM.">Delaunay algorithm and principal component analysis for 3D visualization of mitochondrial DNA nucleoids by Biplane FPALM/dSTORM.</a> European Biophysics Journal. 45 (5), 443-461 (2016).</li><li>Kukat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+reveals+that+mammalian+mitochondrial+nucleoids+have+a+uniform+size+and+frequently+contain+a+single+copy+of+mtDNA.">Super-resolution microscopy reveals that mammalian mitochondrial nucleoids have a uniform size and frequently contain a single copy of mtDNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13534-13539 (2011).</li><li>Kukat, C., Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mtDNA+makes+a+U-turn+for+the+mitochondrial+nucleoid.">mtDNA makes a U-turn for the mitochondrial nucleoid.</a> Trends in Cell Biology. 23 (9), 457-463 (2013).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Benke, A., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+dSTORM+of+cellular+DNA+based+on+direct+DNA+labeling.">Live-cell dSTORM of cellular DNA based on direct DNA labeling.</a> ChemBioChem. 13 (2), 298-301 (2012).</li><li>Ishigaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+super-resolution+imaging+of+mitochondria+labeled+with+TMRM+in+living+cells.">STED super-resolution imaging of mitochondria labeled with TMRM in living cells.</a> Mitochondrion. 28, 79-87 (2016).</li><li>Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy.">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15348 (2015).</li><li>Gustafsson, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination.">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li><li>Hirano, Y., Matsuda, A., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advancements+in+structured-illumination+microscopy+toward+live-cell+imaging.">Recent advancements in structured-illumination microscopy toward live-cell imaging.</a> Microscopy (Oxf). 64 (4), 237-249 (2015).</li><li>Brown, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+fluorescence+imaging+of+mitochondrial+nucleoids+reveals+their+spatial+range,+limits,+and+membrane+interaction.">Superresolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction.</a> Molecular and Cellular Biology. 31 (24), 4994-5010 (2011).</li><li>Lewis, S. C., Uchiyama, L. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AAA(+)+protein+ATAD3+has+displacement+loop+binding+properties+and+is+involved+in+mitochondrial+nucleoid+organization.">The AAA(+) protein ATAD3 has displacement loop binding properties and is involved in mitochondrial nucleoid organization.</a> Journal of Cell Biology. 176 (2), 141-146 (2007).</li><li>Ashley, N., Harris, D., Poulton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+mitochondrial+DNA+depletion+in+living+human+cells+using+PicoGreen+staining.">Detection of mitochondrial DNA depletion in living human cells using PicoGreen staining.</a> Experimental Cell Research. 303 (2), 432-446 (2005).</li><li>Jevtic, V., Kindle, P., Avilov, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SYBR+Gold+dye+enables+preferential+labeling+of+mitochondrial+nucleoids+and+their+time-lapse+imaging+by+structured+illumination+microscopy.">SYBR Gold dye enables preferential labeling of mitochondrial nucleoids and their time-lapse imaging by structured illumination microscopy.</a> PLoS One. 13 (9), e0203956 (2018).</li></ol>

프로토콜에는 몇 가지 중요한 구성 요소가 있습니다 : 미토콘드리아 DNA의 우선 라벨링을 얻으려면 배양 중에 DNA 결합 염료의 농도가 매우 낮게 유지되어야합니다 (예 : 일반적인 상용 재고의 1 :10,000 희석), 인큐베이션 시간은 30 분이어야합니다. 인큐베이션 시간은 1 h를 초과해서는 안됩니다. 다른 DNA 결합 염료는 낮은 농도에서 라벨링시 강한 신호를 생성할 만큼 충분히 밝지 않습니다.
<p class="...

원형 16.5 kbp DNA 분자는 미토콘드리아의 유전 물질을 구성하며, 미토콘드리아 산화 인산화 복합체에 필요한 22 tRNAs, 2 rRNAs 및 13개의 폴리펩티드를 인코딩합니다. 미토콘드리아 DNA는 미토콘드리아 전사 인자 a(TFAM) 및 여러 다른 단백질에 결합하여 미토콘드리아 핵형성1,,2,,3,,4. 미토콘드리아 핵형성은 세포 주기 상, 스트레스 및 기타 요인에 따라 형태학적리모델링,핵분열 또는 융합동안 미토콘드리아네트워크의성분 들 간에 이동 및 재분배(Pernas et al.7). 또한, 미토콘드리아 핵소자의 움직임은, 전신 성 홍반성 루푸스 질환8에 연루되어 다른 질병에 역할을 할 수 있다. 형광 현미경 검사법은 세포기관의 살아있는 세포 연구를 위한 간단한 기술입니다, 그러나 기술은 미토콘드리아 핵형성의 크기보다는 더 큰 >200 nm의 해결책을 가지고 있습니다 (~100,nm9,,10,,12).12 이러한 한계는 자극방출고갈(STED) 및 단일 분자 국소화 현미경(SMLM)13,,14와같은 소위 "초고해상도" 기술에 의해 회피되었다. 지금까지, 미토콘드리아 핵소자 및 기타 DNA는 직접 적인 현미경(dSTORM)15에의해 살아있는 세포에서 영상화되었다. mtDNA와 상관관계가 있는 위치를 가진 미세한 서브-미토콘드리아 구조는 살아있는세포(16)에서STED에 의해 관찰되었다. 그러나, 이러한 초고해상도 기술은 살아있는 세포에 광독성 효과를 일으키는 높은 발광 강도를 필요로17. 따라서 회절 한계를 초과하는 해상도를 가진 미토콘드리아 핵종의 시간 경과 이미징은 어렵습니다. 이 문제를 해결하기 위해 초해상도 구조조명 현미경(SR-SIM)18을사용했습니다. SIM은 STED 및 SMLM19보다훨씬 낮은 조명 전력 용량을 필요로합니다. 더욱이, STED 및 SMLM 기술과는 달리, SIM은 간단한 다색 3차원(3D) 이미징을 허용하며, 형광단 또는 이미징 버퍼조성물(19)의특정 광물리적 특성을 필요로 하지 않는다.
살아있는 세포에서 미토콘드리아 핵을 표지하기 위한 종래의 전략은 TFAM20과같은 미토콘드리아 핵형 단백질의 형광 태깅이다. 그러나 대부분의 경우 이 전략은 적합하지 않습니다. 더욱이, 형광 단백질 태그가 붙은 TFAM의 과발현은 심각한아티팩트(21)를생성한다. 유기 염료로 DNA를 표지하는 것은 형광 단백질 (FP) 기반 전략에 비해 장점이 있습니다. 유기 염료는 FP 태깅과 관련된 제한이 없습니다 : 그들은 세포 또는 조직의 모든 유형에 사용할 수 있으며 실험의 모든 시점에서 적용 할 수 있습니다. 미토콘드리아 핵소자의 살아있는 세포 이미징은 여러 DNA 결합 염료로 보고되었다: DAPI22,SYBR 그린23,비브란트 염료사이클24,및 피코그린15,,25,,26. 핵염균 표지를 위한 대부분의 DNA 결합 염료의 실질적인 결점은 세포 내의 모든 DNA를 얼룩지게 한다는 것입니다. 미토콘드리아 DNA에전적으로 염료를 표적으로 하는 것은 매우 바람직합니다. 이를 달성하기 위해서는 적절한 물리 화학 적 특성을 지닌 염료를 신중하게 선택해야합니다. 로다민(123)과 같은 국소화된 양성전하를 보유한 친유성 염료는 살아있는 미토콘드리아에 축적되어 부정적인 막 전위를 보존하는 것으로 알려져 있다. 또한, 미토콘드리아 핵소자의 특정 라벨링을 위한 이상적인 염료는 높은 친화력으로 DNA를 결합하고 DNA 결합시 밝은 형광을 방출해야 한다. 이러한 요구 사항을 고려할 때, 특정 시아닌은 유망하지만(예를 들어, 피코그린), 핵 DNA는 미토콘드리아 DNA15,,25,,26과동시에 이들 염료에 의해 풍부하게 염색된다. 본 프로토콜은 다른 시아닌 염료, SYBR 골드 (SG) 및 시간 경과 슈퍼 해상도 SIM 비디오에서 핵의 추적과 라이브 세포에서 미토콘드리아 핵의 특정 라벨을 설명합니다. 더욱이, SG 염색된 살아있는 세포는 살아있는 세포에 적합한 모든 유형의 반전형광 현미경(공초점, 회전 디스크, 에피네시 등)에 의해 이미지화될 수 있으며 488 nm 광원을 갖추고 있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Elyra PS1</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>multi-modal super-resolution microscope containing module for super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high glucose DMEM</td>
			<td>GIBCO/ThermoFisher</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi 35-mm dish, glass bottom</td>
			<td>Ibidi Gmbh</td>
			<td>81158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi 8-well microSlide, glass bottom</td>
			<td>Ibidi Gmbh</td>
			<td>80827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 8.4.1</td>
			<td>Bitplane/Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>image porcessing and visualisation software package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon 885</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td></td>
			<td>EMCCD camera with back-illuminated sensor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM880 Airyscan</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>laser scanning confocal microscope with array detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitotracker CMXRos Red</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td>M7512</td>
			<td>red live cell mitochondrial stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitotracker Deep Red FM</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td>M22426</td>
			<td>far red live cell mitochondrial stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>picoGreen</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td>P7581</td>
			<td>cell permeant DNA stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apochromat 100x/1.46 Oil objective</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td>S11494</td>
			<td>cell permeant DNA stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Black 2012 software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>image acquisition and processing software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

specific labeling of mitochondrial nucleoids for time-lapse structured illumination microscopy

미토콘드리아 핵형성은 단백질로 코팅된 미토콘드리아 DNA 분자에 의해 형성된 소형 입자입니다. 미토콘드리아 DNA는 tRNA, rRNAs 및 몇몇 필수 미토콘드리아 폴리펩티드를 인코딩합니다. 미토콘드리아 핵형성은 핵분열/융합 및 기타 형태학적 변화를 겪는 동적 미토콘드리아 네트워크 내에서 분열및 분배됩니다. 고해상도 라이브 형광 현미경 검사법은 핵신의 위치와 움직임을 특성화하는 간단한 기술입니다. 이 기술을 위해, 핵형성은 그들의 단백질 분대, 즉 전사 인자 a (TFAM)의 형광 태그를 통해 일반적으로 표지됩니다. 그러나 이 전략은 아티팩트(TFAM에 대해 보고됨)를 유발할 수 있는 형광 단백질 태그가 지정된 구성물의 과발현이 필요하며 많은 경우에 실현 가능하지 않습니다. 유기 DNA 결합 염료는 이러한 단점을 가지고 있지 않습니다. 그러나, 그(것)들은 항상 핵과 미토콘드리아 DNA 둘 다의 얼룩을 보여주기, 따라서 미토콘드리아 핵형성에 특이성이 결여됩니다. 이러한 염료의 물리 화학적 특성을 고려하여 핵산 젤 얼룩(SYBR Gold)을 선택하고 살아있는 세포에서 미토콘드리아 핵세포의 우대 라벨링을 달성했습니다. 염료의 특성, 특히 DNA에 결합시 높은 밝기는 초고해상도 구조 조명 이미지의 타임 시리즈를 사용하여 미토콘드리아 핵운동의 후속 정량화를 허용합니다.

SG를 통해 라이브 셀 라벨링의 특성화 먼저, 다양한 희석제에서 염료를 배양시 세포내SG의 분포는 공초점 현미경으로 특징지어졌다. SG 또는 피코그린의 고농도로 배양한 후, 둘 다 염료는 대부분 핵에 표지하고 세포질에서 반점 염색을 나타내었다(도1),유사하게 다른 양전하파된 사이아닌 염료(즉, 피코그린)에 대한 출판된 데이터와 유...

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Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

이 프로토콜은 시판되는 DNA 젤 얼룩이 있는 미토콘드리아 핵종의 특정 라벨링, 초고해상도 구조조명 현미경(SR-SIM)에 의한 라이브 라벨링 세포의 타임랩스 시리즈 획득, 핵운동의 자동 추적을 설명합니다.

시간 경과 구조화 조명 현미경 검사법에 대한 미토콘드리아 핵의 특정 라벨링

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...

이 프로토콜은 살아있는 세포에 있는 미토콘드리아 핵의 특정 표시및 고해상도에 그들의 운동의 정량적인 연구를 허용합니다. 형광염으로 배양하는 것은 형광성 단백질의 필요성을 우회하여 관련 유물및 한계를 피하고 우리의 프로토콜이 비트랜스펙트 세포에 적용될 수 있도록 합니다. 우대 핵 염색을 달성하기 위해, 하나는 우리가 최적화 한 조건하에서 SYBR 골드와 다른 아무것도 사용해야합니다.그렇지 않으면, 총 세포 DNA는 얼룩질 수 있습니다. 라벨링 시술 하루 전에, 35mm 페트리 접시에 있는 매체의 2밀리리터에서 다섯 번째 HeLa 세포에 4 번 10배 배양합니다. 다음 아침, 페놀 레드 프리 배양 배지 의 1 밀리리터와 적절한 2X 라벨링 용액의 1 밀리리터를 추가하기 전에 PBS의 2 밀리리터로 세포를 세척합니다.섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 30분 후, 각 35mm 페트리 접시에서 슈퍼티티가 함유된 염료를 조심스럽게 흡인시키고 PBS 2밀리리터로 세포를 씻어내세요. 그런 다음 신선한 페놀 적색 세포 배양 배지로 세포를 공급하고 살아있는 이미징까지 빛으로부터 보호되는 세포 배양 인큐베이터로 배양을 반환한다. 라이브 세포 이미징의 경우, 이미징 세션 1시간 전, 스테이지 탑 인큐베이터를 초해상도 구조조명 현미경 단계에 배치하고 온도를 섭씨 37도로 설정하고 이산화탄소 농도는 레이저를 포함한 현미경의 모든 구성 요소에 5%로 설정하고 고배율, 고숫자 조리개 침전을 선택하여 미세한 분해능을 권장하는 미세한 구조로 제조하였다.레이저가 워밍업되면 35mm 페트리 접시를 현미경 단계에 설치하고 안구를 사용하여 접시 바닥에 부착된 세포와 관심 있는 영역을 찾습니다. 초해상도 구조화 조명 현미경 이미지를 획득하려면 백 엔드 하이 엔드 전자곱 커플링 장치 카메라를 사용하십시오. 이미지 수집 소프트웨어에서 카메라에 권장되는 대로 높은 전자 곱을 곱한 게인을 설정합니다.핵 추적을 위한 타임랩스 시리즈를 획득하기 전에, 미토콘드리아 염색을 위한 한 채널에서 동일한 시야의 2색 초해상도 구조화 조명 현미경 이미지를 획득하고 SYBR 골드에 대한 또 다른 것을 획득한다. 미토콘드리아 이미지 컬러 채널을 사용 하 여 미토콘드리아 얼룩에 대 한 적절 한 여기 및 방출에 설정 하 고 SYBR 금 염료에 대 한 적절 한 여기 및 뱅 패스 방출 필터를 설정 합니다. 두 채널 모두에서 가능한 가장 낮은 레이저 전원을 설정합니다.현미경이 순차적으로만 채널을 획득하는 경우 미토콘드리아 얼룩 검출을 위해 채널을 끕니다. 소프트웨어의 Z 스택 상자를 선택 해제하여 Z 스택 인수를 해제하여 단일 초점 평면의 인수를 설정하고 가능한 카메라 노출 시간을 가장 짧게 설정합니다. 그리드의 3회전을 설정하고 여러 레이저 전력 값과 여러 노출 시간에 표지된 셀의 2차원 이미지를 획득하여 카메라 노출 시간에 레이저 전력을 최적화합니다.미토콘드리아의 밝은 반점이 있는 구조화 조명 현미경 이미지를 거의 또는 전혀 아티팩트없이 산출하고 최적화된 설정을 사용하여 타임랩스 시리즈의 획득을 시작하는 레이저 출력 및 카메라 노출 시간을 선택합니다. 시간 경과 이미지의 분석을 위해 변환된 구조화 조명 현미경 이미지와 스팟 추적 모듈이 있는 적절한 이미지 분석 소프트웨어를 열고 새로운 스팟을 클릭하여 스팟 생성 마법사를 시작합니다. 만들기 탭에서 시간이 지남에 따라 트랙 스팟을 클릭하고 마법사의 두 번째 단계로 진행합니다.추정 된 x-y 직경을 0.1 ~ 0.15 마이크로미터로 설정합니다. 배경 빼기를 클릭하고 마법사의 세 번째 단계로 진행합니다. 히스토그램내의 수직선을 드래그하여 대부분의 뉴클레오티드가 검출될 때까지 품질 필터의 임계값을 조정하여 각 프레임 내에서 검출되지 않는 유물의 반점으로 검출된다.마법사의 네 번째 및 다섯 번째 단계로 이동하여 자동 회귀 모션 알고리즘을 선택합니다. 최대 거리를 0.5 마이크로미터로 설정하고 최대 간격 크기를 0으로 설정합니다. 미세 조정된 매개 변수를 통해 소프트웨어가 모든 반점을 감지하고 트랙을 올바르게 빌드할 수 있게 되면 화살표 를 클릭하여 트랙 생성을 확인하고 통계 아이콘을 클릭하여 트랙 통계를 추출합니다.그런 다음 필요한 통계 매개 변수를 선택하고 저장 As를 클릭하여 값을 정량화 및 시각화를 위해 점 CSV 파일로 내보냅니다. SYBR 금 또는 PicoGreen의 고농도로 라벨링하면 핵이 풍부하게 염색되고 세포질 내에서 얼룩지게 됩니다. 낮은 농도에서, 희미한 SYBR 금 신호는 세포질 내에서 관찰되는 밝은 반점의 패턴에서 핵 내에 나타납니다.낮은 농도에서 PicoGreen 라벨은 주로 핵 염색을 산출합니다. 먼 붉은 미토콘드리아 염료에서 SYBR 금의 낮은 농도와 동시에 염색하면 거의 모든 SYBR 금 얼룩이 미토콘드리아 내에서 발생하며 고농도로 라벨을 부착하면 핵과 세포질이 유의하게 염색되는 결과를 낳는다. 시간 경과 이미징은 45 분 후에 핵염 염색이 포화에 가깝다는 것을 밝힙니다.고정은 핵에 염료의 약간의 재분배를 일으키는 원인이 되고, 고정된 세포의 투과화는 미토콘드리아의 점선 염색 패턴을 제거하고 핵 염색을 향상시킵니다. SYBR 금이 고정 및 투과화 후 세포에 첨가되면 염료가 세포질과 핵을 균일하게 분산시켜 염색 특이성을 상실하게 됩니다. 슈퍼 분해능 구조화 조명 현미경에 의한 살아있는 세포 3D 화상 진찰은 미토콘드리아 내의 밝은 반점으로 미토콘드리아 핵로이드를 드러낸다.회절 한계를 초과하는 해상도에서 핵의 위치를 추적하는 것은 대부분의 핵이 미토콘드리아 네트워크에 국한된 짧은 거리 무작위 운동을 나타낸다는 것을 보여줍니다. 이 프로토콜은 샘플의 고정과 호환되지 않는다는 점에 유의해야 합니다. 그러나, 우리의 프로토콜은 분자와 세포기관의 형태학, 역학 및 활동의 연구를 위한 살아있는 세포 화상 진찰 기지를 둔 분석의 넓은 범위와 호환되어야 합니다.우리의 연구는 세포 기지를 둔 기술에 대한 비 유기 염료를 리타게팅의 장점을 보여줍니다. 그것은 세포 연구에서 그들의 응용 프로그램에 대 한 다른 형광 염료의 탐구영감을 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

시간 경과 현미경과 분해 굴지 모니터링

연구

생물학

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

siRNA Transfection 후의 유사 분열의 시간 저속 영상

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

상순 Embryogenesis의 시간 경과 현미경 Caenorhabditis 엘레간스

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

시간 경과 비디오 현미경을 이용한 세포의 무작위 마이 그 레이션의 정량 분석

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

에 산소 결핍 유도 일시 중지 된 애니메이션을 시각화하기 위해 시간 경과에 현미경을 사용<em&gt; C. elegans</em&gt; 태아

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

sox10의 두개 안면 개발의 시각화 : 단풍 나무 형질 전환 제브라 피쉬의 선은 시간 경과 공 초점 현미경을 사용하여

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

고속 3D 구조 조명 현미경을 사용하여 라이브 박테리아의 Cytokinetic Z 반지의 슈퍼 해상도 이미징 (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Time-Lapse Video Microscopy for Assessment of EYFP-Parkin Aggregation as a Marker for Cellular Mitophagy

휴대 Mitophagy을위한 마커 EYFP - 파킨 집계의 평가를위한 시간 경과 비디오 현미경

Time-lapse video microscopy can be defined as the real time imaging of living cells. This technique relies on the collection of images at different time ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

형광 현미경으로 살아있는 세포의 잠재적 인 미토콘드리아의 칼슘과 미토콘드리아 막의 동시 측정

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

Intravital 시간 경과 영상에 대 한 애기 를 장착 하는 다양 한 방법을 나뭇잎합니다

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...