Name: kinetic screening of nuclease activity using nucleic acid probes
Uploaded: 2019-11-01T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes at JoVE.com

ويود أصحاب البلاغ الاعتراف بالسيدة لويزا ا. هيرنانديز (جامعه لينكوبينغ) لمراجعتها المتانيه للمخطوطة وإسداء المشورة القيمة لها. وقد حظي هذا العمل بدعم مؤسسه كنوت واليس فالينبرغ ومنطقه البحوث الاستراتيجية التابعة للحكومة السويدية في مجال علوم المواد المتعلقة بالمواد الوظيفية المتقدمة في جامعه لينكوبينغ (الكلية غرانت SFO-مات-ليو رقم 2009-00971).

1-تصميم المكتبات واعدادها
<ol><li>تصميم المكتبة<ol>
<li>بناء علي المعايير التالية تصميم مكتبه من الفلورسنت الفلورية القليلة من المجسات بين 8 و 12-مير طويلة لتجنب تشكيل الهيكل الثانوي ، مع طول متساو لجميع التحقيقات.<ol>
<li>وتشمل علي الأقل DNA واحد وتسلسل الحمض النووي الريبي عشوائية واحده تحتوي علي مز?...

<ol>
	<li>Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleases:+diversity+of+structure,+function+and+mechanism.">Nucleases: diversity of structure, function and mechanism.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 44 (1), 1-93 (2011).</li><li>Adli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR+tool+kit+for+genome+editing+and+beyond.">The CRISPR tool kit for genome editing and beyond.</a> Nature Communication. 9 (1), 1911 (2018).</li><li>Mason, P. A., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+DNA+exonucleases+in+protecting+genome+stability+and+their+impact+on+ageing.">The role of DNA exonucleases in protecting genome stability and their impact on ageing.</a> Age (Dordr). 34 (6), 1317-1340 (2012).</li><li>Berends, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclease+expression+by+Staphylococcus+aureus+facilitates+escape+from+neutrophil+extracellular+traps.">Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Innate Immunity. 2 (6), 576-586 (2010).</li><li>Kiedrowski, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+Nuc2+is+a+functional,+surface-attached+extracellular+nuclease.">Staphylococcus aureus Nuc2 is a functional, surface-attached extracellular nuclease.</a> PLoS One. 9 (4), 95574 (2014).</li><li>Morita, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall-anchored+nuclease+of+Streptococcus+sanguinis+contributes+to+escape+from+neutrophil+extracellular+trap-mediated+bacteriocidal+activity.">Cell wall-anchored nuclease of Streptococcus sanguinis contributes to escape from neutrophil extracellular trap-mediated bacteriocidal activity.</a> PLoS One. 9 (8), 103125 (2014).</li><li>Hasegawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+virulence-associated+and+cell-wall-located+DNase+of+Streptococcus+pyogenes.">Characterization of a virulence-associated and cell-wall-located DNase of Streptococcus pyogenes.</a> Microbiology. 156, 184-190 (2010).</li><li>Moon, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+catalytic+and+substrate+binding+mechanisms+of+the+strategic+EndA+nuclease+from+Streptococcus+pneumoniae.">Structural insights into catalytic and substrate binding mechanisms of the strategic EndA nuclease from Streptococcus pneumoniae.</a> Nucleic Acids Research. 39 (7), 2943-2953 (2011).</li><li>Li, L. Y., Luo, X., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endonuclease+G+is+an+apoptotic+DNase+when+released+from+mitochondria.">Endonuclease G is an apoptotic DNase when released from mitochondria.</a> Nature. 412 (6842), 95-99 (2001).</li><li>McDermott-Roe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endonuclease+G+is+a+novel+determinant+of+cardiac+hypertrophy+and+mitochondrial+function.">Endonuclease G is a novel determinant of cardiac hypertrophy and mitochondrial function.</a> Nature. 478 (7367), 114-118 (2011).</li><li>Wang, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+link+between+adipogenesis+and+innate+immunity:+RNase-L+promotes+3T3-L1+adipogenesis+by+destabilizing+Pref-1+mRNA.">A link between adipogenesis and innate immunity: RNase-L promotes 3T3-L1 adipogenesis by destabilizing Pref-1 mRNA.</a> Cell Death &amp; Disease. 7 (11), 2458 (2016).</li><li>Li, C. L., Yang, W. Z., Shi, Z., Yuan, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tudor+staphylococcal+nuclease+is+a+structure-specific+ribonuclease+that+degrades+RNA+at+unstructured+regions+during+microRNA+decay.">Tudor staphylococcal nuclease is a structure-specific ribonuclease that degrades RNA at unstructured regions during microRNA decay.</a> RNA. 24 (5), 739-748 (2018).</li><li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MTDH-SND1+interaction+is+crucial+for+expansion+and+activity+of+tumor-initiating+cells+in+diverse+oncogene-+and+carcinogen-induced+mammary+tumors.">MTDH-SND1 interaction is crucial for expansion and activity of tumor-initiating cells in diverse oncogene- and carcinogen-induced mammary tumors.</a> Cancer Cell. 26 (1), 92-105 (2014).</li><li>Keyel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dnases+in+health+and+disease.">Dnases in health and disease.</a> Developmental Biology. 429 (1), 1-11 (2017).</li><li>Hernandez, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+imaging+of+Staphylococcus+aureus+infections+with+a+nuclease-activated+probe.">Noninvasive imaging of Staphylococcus aureus infections with a nuclease-activated probe.</a> Nature Medicine. 20 (3), 301-306 (2014).</li><li>Flenker, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Detection+of+Urinary+Tract+Infections+via+Bacterial+Nuclease+Activity.">Rapid Detection of Urinary Tract Infections via Bacterial Nuclease Activity.</a> Molecular Therapy. 25 (6), 1353-1362 (2017).</li><li>Kannan, N., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tipping+the+balance:+MTDH-SND1+curbs+oncogene-induced+apoptosis+and+promotes+tumorigenesis.">Tipping the balance: MTDH-SND1 curbs oncogene-induced apoptosis and promotes tumorigenesis.</a> Cell Stem Cell. 15 (2), 118-120 (2014).</li><li>Kemmer, T. P., Malfertheiner, P., Buchler, M., Kemmer, M. L., Ditschuneit, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+ribonuclease+activity+in+the+diagnosis+of+pancreatic+disease.">Serum ribonuclease activity in the diagnosis of pancreatic disease.</a> International Journal of Pancreatology. 8 (1), 23-33 (1991).</li><li>Fernandez-Salas, E., Peracaula, R., Frazier, M. L., de Llorens, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleases+expressed+by+human+pancreatic+adenocarcinoma+cell+lines.">Ribonucleases expressed by human pancreatic adenocarcinoma cell lines.</a> European Journal of Biochemistry. 267 (5), 1484-1494 (2000).</li><li>Fujibayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+deoxyribonuclease+I+activity+can+be+a+useful+diagnostic+marker+for+the+early+diagnosis+of+unstable+angina+pectoris+or+non-ST-segment+elevation+myocardial+infarction.">Serum deoxyribonuclease I activity can be a useful diagnostic marker for the early diagnosis of unstable angina pectoris or non-ST-segment elevation myocardial infarction.</a> Journal of Cardiology. 59 (3), 258-265 (2012).</li><li>Kawai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+use+of+serum+deoxyribonuclease+I+activity+as+a+novel+early-phase+marker+in+acute+myocardial+infarction.">Diagnostic use of serum deoxyribonuclease I activity as a novel early-phase marker in acute myocardial infarction.</a> Circulation. 109 (20), 2398-2400 (2004).</li><li>Hernandez, L. I., Ozalp, V. C., Hernandez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclease+activity+as+a+specific+biomarker+for+breast+cancer.">Nuclease activity as a specific biomarker for breast cancer.</a> Chemical Communication (Cambridge). 52 (83), 12346-12349 (2016).</li><li>Machado, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+specific+detection+of+Salmonella+infections+using+chemically+modified+nucleic+acid+probes.">Rapid and specific detection of Salmonella infections using chemically modified nucleic acid probes.</a> Analytica Chimica Acta. 1054, 157-166 (2019).</li><li>Sanders, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aseptic+laboratory+techniques:+plating+methods.">Aseptic laboratory techniques: plating methods.</a> Journal of Visualized Experiment. (63), e3064 (2012).</li><li>Worthington Biochemical Corporation. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Clinical Enzyme Measurements. , (1972).</li><li>Burghardt, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+Culture-Free+Detection+of+Staphylococcus+aureus+Bacteremia.">Rapid, Culture-Free Detection of Staphylococcus aureus Bacteremia.</a> PLoS One. 11 (6), 0157234 (2016).</li><li>Bibette, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaining+confidence+in+high-throughput+screening.">Gaining confidence in high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (3), 649-650 (2012).</li><li>Hernandez, L. I., Machado, I., Schafer, T., Hernandez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers+overview:+selection,+features+and+applications.">Aptamers overview: selection, features and applications.</a> Current Topics in Medicinal Chemistry. 15 (12), 1066-1081 (2015).</li><li>Pande, J., Szewczyk, M. M., Grover, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display:+concept,+innovations,+applications+and+future.">Phage display: concept, innovations, applications and future.</a> Biotechnology Advances. 28 (6), 849-858 (2010).</li><li>Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+binding+proteins:+anticalins+-+harnessing+the+structural+plasticity+of+the+lipocalin+ligand+pocket+to+engineer+novel+binding+activities.">Alternative binding proteins: anticalins - harnessing the structural plasticity of the lipocalin ligand pocket to engineer novel binding activities.</a> FEBS Journal. 275 (11), 2677-2683 (2008).</li><li>Ku, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+Acid+Aptamers:+An+Emerging+Tool+for+Biotechnology+and+Biomedical+Sensing.">Nucleic Acid Aptamers: An Emerging Tool for Biotechnology and Biomedical Sensing.</a> Sensors (Basel). 15 (7), 16281-16313 (2015).</li><li>Jayasena, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers:+an+emerging+class+of+molecules+that+rival+antibodies+in+diagnostics.">Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics.</a> Clinical Chemistry. 45 (9), 1628-1650 (1999).</li><li>Gray, B. P., Brown, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+peptide+libraries:+mining+for+cell-binding+peptides.">Combinatorial peptide libraries: mining for cell-binding peptides.</a> Chemical Reviews. 114 (2), 1020-1081 (2014).</li></ol>

ارتبطت تعديلات نشاط النيواز بمجموعه واسعه من الأنماط الظاهرية للامراض ، بما في ذلك أنواع مختلفه من السرطان والتهابات البكتيرية. ويقترح ان تكون هذه التعديلات العامل المسبب للشرط14، في حين انها في حالات أخرى هي نتيجة لحدث فسيولوجي ضار20 أو العامل المسبب للامراض<sup cl...

Nucleases هي فئة من الانزيمات القادرة علي المرابط السندات فوسفوديستر التي تشكل الهيكل الأساسي لجزيئات الحمض النووي. التنوع الشاسع لل نوكليسيس يجعل تصنيفها صعبه نوعا ما. ومع ذلك ، هناك بعض المعايير الشائعة المستخدمة لوصف النوكلينس ، مثل تفضيل الركيزة (حمض ديكسيريبونريك (DNA) أو حمض الريبونسيك (RNA)) ، موقع الانشقاق (الكريات النووية أو التبرئة) ، أو التبعية أيون المعادن ، من بين أمور أخرى1. Nucleases هي الانزيمات الحفازه المحفوظة للغاية التي لها ادوار أساسيه في كل من الكائنات الحية النواة والنواة وقد استخدمت ، والاستمرار في استخدامها ، وأداات تحرير الجينات2. وهي أيضا جات فاعله أساسيه في صيانة الحمض النووي وتكراره ، مما يساعد علي الحفاظ علي استقرار الجينوم والمشاركة في عمليات القراءة المضادة3. في البكتيريا ، علي سبيل المثال ، تم تحديد نوكليسيس كعوامل الضراوة الهامه ، قادره علي تعزيز بقاء البكتيريا عن طريق الحد من فعاليه الجهاز المناعي للمضيف4،5،6،7 ،8. في الثدييات, وقد اقترح نوكليسيس ان تكون متورطة في المبرمج9, التكوين الحيوي الميتوكوندريا والصيانة10 والوساطة من الاستجابات المناعية الفطرية المضادة للبكتيريا والمضادة للفيروسات11. وليس من المستغرب ان تكون التغيرات في نشاط النيواز ، سواء كانت تعزيزا أو نقصا ، متورطة في مجموعه واسعه من الامراض البشرية. وتتراوح هذه الامراض من مجموعه واسعه من السرطانات12,13 إلى تضخم القلب10 أو امراض المناعة الذاتية14. ولذلك ، أصبحت نوكليسيس المرشحين مثيره للاهتمام كما المؤشرات الحيوية لمجموعه غير متجانسة من الظروف البشرية. في الواقع, وقد أظهرت بالفعل نوكليسيس إمكاناتها كاداات تشخيصيه ناجحه للكشف عن الإصابات الناجمة عن عوامل بكتيرية محدده, مثل المكورات العنقودية الذهبية أو القولونية15, 16. في العديد من أنواع السرطان ، والتعبير عن مكورات النيوداز التي تحتوي علي المجال البروتين 1 (SND1) ريبونكليوداز يدل علي سوء التكهن17. في مرضي سرطان البنكرياس ، تم الإبلاغ عن مستويات المصل المرتفعة (RNase I)18 واقترح ان تكون مرتبطة بالأنماط الظاهرية للخلايا السرطانية19. في حالات القلب الدماغية ، مثل احتشاء العضلة القلبية أو الذبحة الصدرية غير المستقرة ، فقد ثبت ان مستويات مصل الدم (dnase i) لتكون علامة تشخيصيه صالحه20،21.
وقد تم الافتراض بان المخطط العالمي للنشاط النواسي قد يكون مختلفا في الدول الصحية والامراض. في الواقع ، استخدمت التقارير الاخيره الاختلافات في نشاط النيوداز للتمييز بين الأنماط الظاهرية الصحية والسرطانية22 أو للتعرف علي العدوى البكتيرية المسببة للامراض بطريقه محدده من النوع15،23. وقد فتحت هذه النتائج وسيله جديده لاستخدام الجزيئات الحيوية للمرض. ولذلك ، توجد ضرورة لوضع طريقه فرز شامله قادره علي التحديد المنهجي للاختلافات المرتبطة بالامراض في نشاط النيوداز ، والتي قد تكون ذات اهميه رئيسيه في تطوير أدوات تشخيصيه جديده.
هنا ، نقدم ونقدم وصفا لنهج الفحص الجديد في المختبر (الشكل 1) لتحديد المجسات الحساسة والمحددة القادرة علي التمييز بين نشاط النيوداز في صحة وغير صحية ، أو النشاط المحدد لنوع من الخلايا أو البكتيريا. الاستفادة من نمطيه الأحماض النووية ، قمنا بتصميم مكتبه أوليه من المجسات الفلورية التي تتكون من مجموعه شامله من المتواليات المختلفة والكيميائية ، وكلاهما معلم مهم لتصميم المكتبة. ويحيط بهذه المسبارات القليلة النواة فلوكوفيري (فلوريسئين اميسيت ، فأم) والمروي (المد والجزر 2 ، TQ2) في 5 ' و 3 ' ينتهي علي التوالي (الجدول 1). باستخدام هذا الرنين الفلوري نقل الطاقة (الحنق) علي أساس الفحص الفلوري لقياس حركيه التحلل الانزيمي ، تمكنا من تحديد التحقيقات المرشح مع امكانيه التمييز بين الأنماط التفاضلية للنشاط النيوداز المرتبطة بالدول الصحية أو المرض. قمنا بتصميم عمليه تكراريه ، حيث يتم إنشاء المكتبات الجديدة استنادا إلى أفضل التحقيقات المرشحة ، والتي تسمح بتحديد التحقيقات المرشحة الأكثر تحديدا في خطوات الفرز اللاحقة. وعلاوة علي ذلك ، فان هذا النهج يستفيد من الطبيعة الحفازه لل نوكليسيس لزيادة الحساسية. ويتحقق ذلك من خلال الاستفادة من طبيعة activatable من التحقيقات مراسل وقدره نوكليسيس لمعالجه جزيئات الركيزة باستمرار ، وكلاهما يمثل المزايا الرئيسية علي الأجسام المضادة البديلة أو الصغيرة المستندة إلى جزيء طرق الفرز.
ويوفر هذا النهج أداه فحص ذات وحدات عاليه ومرنه وسهله التنفيذ لتحديد المجسات الخاصة بالأحماض النووية القادرة علي التمييز بين الدول الصحية والامراض ، ومنصة ممتازة لتطوير أدوات التشخيص التي يمكن تكييفها للتطبيقات السريرية في المستقبل. وعلي هذا النحو ، استخدم هذا النهج لتحديد النشاط النيوداز المستمدة من السالمونيلا التيفوئيد (المشار اليها هنا باسم السالمونيلا) لتحديد محدد لهذه البكتيريا. في البروتوكول التالي ، نقوم بالإبلاغ عن طريقه لفحص نشاط النيوداز البكتيري باستخدام التحليل الحركي.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:759px;" width="759">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Black bottom, non-treated 96 well plate</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10000631</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Cytation1</td>
			<td style="width:199px;">BioTek</td>
			<td style="width:128px;">CYT1FAV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Eppendorf tubes</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td style="width:128px;">11926955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Escherichia coli</td>
			<td style="width:199px;">ATCC</td>
			<td style="width:128px;">25922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Microbank cryogenic storage vial containing beads</td>
			<td style="width:199px;">Pro-Lab Diagnostics</td>
			<td style="width:128px;">22-286-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Nucleic acid probes</td>
			<td style="width:199px;">Biomers.net</td>
			<td style="width:128px;">#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Phosphate Buffer Saline containing MgCl2 and CaCl2</td>
			<td style="width:199px;">Gibco&#8482;</td>
			<td style="width:128px;">14040117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Salmonella enterica subs. Enterica</td>
			<td style="width:199px;">ATCC</td>
			<td style="width:128px;">14028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Tris-EDTA</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10647633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Tryptone Soya Agar with defibrinated sheep blood</td>
			<td style="width:199px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10362223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:199px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">22092</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

kinetic screening of nuclease activity using nucleic acid probes

Nucleases هي فئة من الانزيمات التي تكسر الأحماض النووية عن طريق تحفيز التحلل المائي من السندات الفوسفاوديستر التي تربط السكريات الريبوز. عرض nucleases مجموعه متنوعة من الأدوار الفسيولوجية الحيوية في الكائنات البدائية النواة والنواة الحقيقية ، بدءا من الحفاظ علي استقرار الجينوم لتوفير الحماية ضد مسببات الامراض. وقد ارتبط النشاط النيوداز المتغيرة مع العديد من الحالات المرضية بما في ذلك العدوى البكتيرية والسرطان. وتحقيقا لهذه الغاية ، اظهر نشاط النيوداز امكانيه كبيره للاستغلال باعتباره مؤشرا إحيائيا محددا. ومع ذلك ، فان طريقه الفرز القوية والقابلة للتكرار المستندة إلى هذا النشاط لا تزال مستصوبه للغاية.
هنا ، نقدم طريقه تمكن من فحص نشاط النيوداز باستخدام مجسات الحمض النووي كركائز ، مع نطاق التمييز بين الظروف المرضية والصحية. هذا الأسلوب يوفر امكانيه تصميم مكتبات التحقيق الجديدة ، مع زيادة الخصوصية ، بطريقه تكراريه. التالي ، فان جولات متعددة من الفحص ضرورية لصقل تصميم المجسات مع ميزات محسنه ، مع الاستفادة من توافر الأحماض النووية المعدلة كيميائيا. وتكمن الإمكانات الكبيرة للتكنولوجيا المقترحة في مرونتها واستنساخها العالية وبراعتها في فحص نشاط النيوداز المرتبط بظروف المرض. ومن المتوقع ان تسمح هذه التكنولوجيا تطوير أدوات التشخيص واعده مع إمكانات كبيره في العيادة.

ويبين الشكل 1 تدفق العمل لهذه المنهجية ، الذي ينقسم إلى جولتين للفحص. ويمكن الاطلاع علي البيانات الاوليه لجولة الفرز هذه في الجدول التكميلي 1. في الجولة الثانية ، تم توليفها التحقيقات المعدلة كيميائيا عن طريق استبدال تسلسل الجيش النيبالي الريبي مع النيونوسيدس الم...

Watch this Scientific Journal Video about Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes at JoVE.com

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

وقد ارتبط النشاط النيوداز المتغيرة مع الظروف البشرية المختلفة ، الكامنة وراء إمكاناتها باعتبارها البيولوجية. تسمح منهجيه الفحص النموذجية وسهله التنفيذ المعروضة في هذه الورقة باختيار مجسات محدده من الأحماض النووية لتسخير نشاط النيوداز كمؤشر حيوي للمرض.

الفحص الحركي للنشاط النواسي باستخدام مجسات الحمض النووي

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

يوفر هذا البروتوكول بديلاً قوياً لفحص نشاط النوى كعلامة بيولوجية للمرض، مع منهجية سهلة التنفيذ حتى بالنسبة للباحثين الذين ليسوا متخصصين في مسابير الحمض النووي. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القدرة على اختيار مسابير الحمض النووي التي يمكن أن تحدد كلا من الأنشطة النوى المعروفة وغير المعروفة، والاستفادة من التفاعل الديناميكي مسبار نوكلياز. ومن المزايا الأخرى لهذه المنهجية مرونتها، وإمكانية استنساخها العالية وسهولة استخدامها.سيتم تنفيذ العرض من قبل خديجة، طالبة الماجستير، وباريس، وهو ما بعد الدكتوراه من مختبرنا. عند تصميم مكتبة oligonucleotide، وتشمل ما لا يقل عن واحد DNA واحد وNA واحدة تسلسل عشوائي يحتوي على مزيج من الأدينين، جوانين، السيتوسين والثيامين أو أوراسيل. لإعداد تحقيقات القلة، تدور أسفل تحقيقات أوليجنوكليوتيد الlyophilized وتمييع كل مسبار في مخزن Tris-EDTA في تركيز 500 picomolar لكل ميكرولتر لمنع تدهور النوى.للثقافة البكتيرية على المتوسطة الصلبة، لفة حبة زجاجية واحدة مسامية من التخزين المبرد مباشرة على طبق ثقافة واحد يحتوي على TSA تكملها دم الأغنام المتبلورة إلى خط من المستعمرات البكتيرية الفردية. ثم ضع اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بالنسبة للثقافة البكتيرية في الوسط السائل، قم بنقل مستعمرة واحدة من ثقافة متوسطة صلبة إلى 50 ملليلتر من TSB للحضانة بمعدل 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة بمعدل 200 دوران في الدقيقة.في اليوم التالي ، تمييع الثقافة بنسبة 1 إلى 500 في TSB الطازجة واحتضان البكتيريا لمدة 24 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية و 200 دوران في الدقيقة في حاضنة تهتز. لإعداد فحص نشاط نووي ، أولاً قبل تسخين جهاز قياس الفلور إلى 37 درجة مئوية وإضافة 96 ميكرولترات من TSB العقيمة أو السوبر من ثقافة السالمونيلا أو E.Coli السائلة المتوسطة إلى أنبوب واحد 1.5 ملليلتر خالية من النيوكلاز في أنبوب ميكروسنتريفوج لكل مسبار. إضافة أربعة ميكروليترس من حل عمل التحقيق لكل أنبوب واستخدام ماصة لخلط محتويات كل أنبوب بدقة حتى يتم تحقيق حلول متجانسة، مع الحرص على تجنب فقاعات.المقبل، بعناية تحميل 95 ميكرولترات من كل حل على مقربة من جدار الآبار الفردية من أسفل أسود، غير المعالجة 96 جيدا لوحة، مع الحرص على تجنب فقاعات. عندما يتم إضافة جميع الحلول، قم بتغطية اللوحة وفحص الغطاء بصريًا بحثاً عن علامات القلم أو الغبار الذي قد يقدم نتائج القياس. لإعداد البرنامج لقياس نشاط النوى، افتح برنامج اقتناء مناسب.حدد القراءة الآن من نافذة إدارة المهام، وحدد جديد لإنشاء بروتوكول القياس الحركي. انقر على تعيين درجة الحرارة لتحديد 37 درجة مئوية وتأكيد وحفظ الإعدادات بالنقر فوق موافق. انقر فوق بدء الحركية. في النافذة المنبثقة، حدد ساعتين في مربع إدخال وقت التشغيل ودقيقتين في مربع الإدخال الفاصل الزمني قبل النقر فوق موافق لتأكيد الإعدادات وحفظها.انقر فوق قراءة. في النافذة المنبثقة، حدد كثافة الفلوريسينكين كأسلوب الكشف، نقطة النهاية الحركية كنوع القراءة والفلاتر كنوع البصريات. ثم انقر فوق موافق. في النافذة المنبثقة، حدد الأخضر من "مجموعة التصفية" وانقر فوق موافق. في النافذة الإجراء، حدد استخدام غطاء وانقر فوق التحقق من الصحة.سيظهر إطار منبثق يؤكد صحة البروتوكول الذي تم إنشاؤه. ضمن القائمة بروتوكول ، حدد الإجراء. في إطار الإجراء، حدد الآبار التي سيتم قياسها وأدخل اسم التجربة في المربع إدخال اسم الملف.ثم قم بتحميل اللوحة في قارئ اللوحة ، مع الحرص على أن اللوحة في الاتجاه الصحيح وانقر على الزر اقرأ جديد لبدء الاستحواذ. لتحليل البيانات، افتح البيانات في برنامج التحليل المناسب، وحدد أحد الآبار المقاسة في اللوحة النافذة الواحدة. انقر فوق تحديد Wells وتضمين كل الآبار المقاسة في إطار حوار اختيار البئر قبل النقر فوق موافق. ثم حدد البيانات في إطار واحد لوحة لتصور النتائج الجدولة وانقر QuickExport لتصدير البيانات إلى جدول بيانات.في جدول بيانات، قم بتسمية أعمدة البيانات على أنها مناسبة لكل عينة و probe، و قم برسم وحدات الفلورسينت النسبية مقابل الوقت للبيانات لإنشاء رسومات بيانية حركية. في هذه التجربة التمثيلية ، بعد الجولة الأولى من الفحص ، أبلغ عظمى ثقافة السالمونيلا عن تفضيل واضح لمسبار الحمض النووي الريبي على مسابير الحمض النووي. استنادا إلى تحديد الحمض النووي الريبي كنوع الحمض النووي المفضل من قبل نوكيلا السالمونيلا، تم تصميم مكتبة RNA فقط جديدة لاستخدامها في الجولة الثانية من الفحص.وعلى النقيض من ذلك، أظهر E.Coli في الضوابط المتوسطة الثقافة قدرة محدودة للغاية على تدهور تحقيقات الحمض النووي الريبي. بعد جولة ثانية من الفحص باستخدام النيوكليوتيدات المعدلة كيميائيا تهدف إلى زيادة خصوصية تحقيقات RNA، يمكن تحديد RNA بيريميدين 2'O-ميثيل وRNA البيورين 2'O-الميثيل على أساس تعديلاتها الكيميائية كما تظهر أفضل أداء السلوك الحركي بالمقارنة مع البيريمدين RNA 2'fluoro وRNA بورين 2 fluoro على التوالي. وتشير هذه النتائج إلى أن السالمونيلا لديها نشاط RNAse الهامة مع تفضيل الكيمياء الركيزة التفاضلية التي يمكن استخدامها لاختيار تحقيقات قادرة على الاعتراف تحديدا هذه البكتيريا.هذا الإجراء يتيح اختيار المسابير التي هي قادرة على تحديد النوى الأنشطة المرتبطة بأمراض الظروف، مثل السرطان أو العدوى البكتيرية، مما يسمح لتطوير أدوات التشخيص السريرية الجديدة.

kinetic-screening-of-nuclease-activity-using-nucleic-acid-probes

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Polyaniline-based Sensor of Nucleic Acids

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies rely on enzymatic modification that can introduce bias and artifacts. A critical element of next generation detection platforms will be direct molecular sensing, thereby avoiding a need for amplification or labels. Advanced nanomaterials may provide the suitable chemical modalities to realize label-free sensors. Conjugated polymers are ideal for biological sensing, possessing properties compatible with biomolecules and exhibit high sensitivity to localized environmental changes. In this article, a method is presented for detecting nucleic acids using the electroconductive polymer polyaniline. Simple DNA "probe" oligonucleotides complementary to target nucleic acids are attached electrostatically to the polymer, creating a sensor system that can differentiate single nucleotide differences in target molecules. Outside the specific and unbiased nature of this technology, it is highly cost effective.

Nucleic acids are common analytes for assessing biological systems; however, bias from enzymatic manipulation can cause concern. Here a method is described for label-free detection of nucleic acids using polyaniline. This sensitive, cost-effective sensor technology can distinguish single nucleotide differences between molecules.

والاستشعار القائم بولي آنلين من الأحماض النووية

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies ...

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical probe that targets the enzyme&#39;s active sites. A reporter tag introduced into the probe allows for the detection of the labeled enzyme by in-gel fluorescence scanning, protein blot, fluorescence microscopy, or liquid chromatography-mass spectrometry. Here, we describe the preparation and use of the compound ARN14686, a click chemistry activity-based probe (CC-ABP) that selectively recognizes the enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA). NAAA is a cysteine hydrolase that promotes inflammation by deactivating endogenous peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)-alpha agonists such as palmitoylethanolamide (PEA) and oleoylethanolamide (OEA). NAAA is synthesized as an inactive full-length proenzyme, which is activated by autoproteolysis in the acidic pH of the lysosome. Localization studies have shown that NAAA is predominantly expressed in macrophages and other monocyte-derived cells, as well as in B-lymphocytes. We provide examples of how ARN14686 can be used to detect and quantify active NAAA ex vivo in rodent tissues by protein blot and fluorescence microscopy.

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Here, we describe the preparation and use of an activity-based probe (ARN14686, undec-10-ynyl-N-[(3S)-2-oxoazetidin-3-yl]carbamate) that allows for the detection and quantification of the active form of the proinflammatory enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA), both in vitro and ex vivo.

إعداد و<em&gt; في فيفو</em&gt; استخدام من التحقيق على أساس آخر ل<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine حمض أميداز

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic purification methods. This manuscript illustrates the technical details involved in the anaerobic purification process, including the preparation of buffers and reagents, the methods for column chromatography in a glove box, and the desalting of the protein prior to kinetics. Also described are the methods for preparing and using an oxygen electrode to perform kinetic characterization of an oxygen-utilizing enzyme. These methods are illustrated using the dioxygenase enzyme DesB, a gallate dioxygenase from the bacterium Sphingobium sp. strain SYK-6.

Here we present a protocol for anaerobic protein purification, anaerobic protein concentration, and subsequent kinetic characterization using an oxygen electrode system. The method is illustrated using the enzyme DesB, a dioxygenase enzyme which is more stable and active when purified and stored in an anaerobic environment.

تنقية البروتين اللاهوائية وتحليل الحركية عبر مسرى الأوكسجين لدراسة النشاط ديوكسيجيناسي دسب وتثبيط

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, fluorophores are prone to loss of signal via photobleaching by dissolved oxygen (O2). To prevent photobleaching and extend the fluorophore lifetime, oxygen scavenging systems (OSS) are employed to reduce O2. Commercially available OSS may be contaminated by nucleases that damage or degrade nucleic acids, confounding interpretation of experimental results. Here we detail a protocol for the expression and purification of highly active Pseudomonas putida protocatechuate-3,4-dioxygenase (PCD) with no detectable nuclease contamination. PCD can efficiently remove reactive O2 species by conversion of the substrate protocatechuic acid (PCA) to 3-carboxy-cis,cis-muconic acid. This method can be used in any aqueous system where O2 plays a detrimental role in data acquisition. This method is effective in producing highly active, nuclease free PCD in comparison with commercially available PCD.

Protocatechuate 3,4-dioxygenase (PCD) can enzymatically remove free diatomic oxygen from an aqueous system using its substrate protocatechuic acid (PCA). This protocol describes the expression, purification, and activity analysis of this oxygen scavenging enzyme.

التعبير وتنقيه الأكسجين خاليه من النيوداز الزبال بروتوكاتيتشواتي 3 ، 4-ديوكسيجيناسي

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls and is an aromatic heteropolymer primarily composed of three monolignols with significant industrial importance. Lignin plays an important role in plant growth and development, protects&#160;from biotic and abiotic stresses, and in the quality of animal fodder, the wood, and industrial lignin products. Accurate estimation of lignin content is essential for both fundamental understanding of the lignin biosynthesis and industrial applications of biomass. The thioglycolic acid (TGA) method is a highly reliable method of estimating the total lignin content in the plant biomass. This method estimates the lignin content by forming thioethers with the benzyl alcohol groups of lignin, which are soluble in alkaline conditions and insoluble in acidic conditions. The total lignin content is estimated using a standard curve generated from commercial bamboo lignin.

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

Here, we present a modified TGA method for estimation of lignin content in herbaceous plant biomass. This method estimates the lignin content by forming specific thioether bonds with lignin and presents an advantage over the Klason method, as it requires a relatively small sample for lignin content estimation.

تقدير محتوى اللجنين الكتلة الحيوية النباتية باستخدام حمض ثيوغليكوليك (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes measurements on freely diffusing biomolecules more accessible. This overview includes a step-by-step protocol for using this instrument to make measurements of precise FRET efficiencies in duplex DNA samples, including details of the sample preparation, instrument setup and alignment, data acquisition, and complete analysis routines. The presented approach, which includes how to determine all the correction factors required for accurate FRET-derived distance measurements, builds on a large body of recent collaborative work across the FRET Community, which aims to establish standard protocols and analysis approaches. This protocol, which is easily adaptable to a range of biomolecular systems, adds to the growing efforts in democratising smFRET for the wider scientific community.

This article provides step-by-step instructions for making fully-corrected accurate FRET measurements on individual, freely diffusing biomolecules using the open-source, inexpensive smfBox, from switch on, through alignment and focusing, to data collection and analysis.

إجراء قياسات دقيقة ودقيقة أحادية الجزيء FRET باستخدام smfBox مفتوح المصدر

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

Determining the Thermodynamic and Kinetic Association of a DNA Aptamer and Tetracycline Using Isothermal Titration Calorimetry

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for application. Due to the drastic differences between the aptamer and small molecules, scientists need to put much effort into characterizing their binding properties. Isothermal Titration Calorimetry (ITC) is a powerful approach for this purpose. ITC goes beyond determining disassociation constants (Kd) and can provide the enthalpy changes and binding stoichiometry of the interaction between two molecules in the solution phase. This approach conducts continuous titration using label-free molecules and records released heat over time upon the binding events produced by each titration, so the process can sensitively measure the binding between macromolecules and their small targets. Herein, the article introduces a step-by-step procedure of the ITC measurement of a selected aptamer with a small target, tetracycline. This example proves the versatility of the technique and its potential for other applications.

The present protocol describes the use of Isothermal Titration Calorimetry (ITC) to analyze the association and dissociation kinetics of the binding between a DNA aptamer and tetracycline, including sample preparation, running standards and samples, and interpreting the resulting data.

تحديد الارتباط الديناميكي الحراري والحركي لأبتامر الحمض النووي والتتراسيكلين باستخدام كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for ...

تحديد رباعيات G في قالب الحمض النووي باستخدام رسم الخرائط الكيميائية

In Vitro Chemical Mapping of G-Quadruplex DNA Structures by Bis-3-Chloropiperidines

G-quadruplexes (G4s) are biologically relevant, non-canonical DNA structures that play an important role in gene expression and diseases, representing significant therapeutic targets. Accessible methods are required for the in vitro characterization of DNA within potential G-quadruplex-forming sequences (PQSs). B-CePs are a class of alkylating agents that have proven to be useful chemical probes for investigation of the higher-order structure of nucleic acids. This paper describes a new chemical mapping assay exploiting the specific reactivity of B-CePs with the N7 of guanines, followed by direct strand cleavage at the alkylated Gs. 
Namely, to distinguish G4 folds from unfolded DNA forms, we use B-CeP 1 to probe the thrombin-binding aptamer (TBA), a 15-mer DNA able to assume the G4 arrangement. Reaction of B-CeP-responding guanines with B-CeP 1 yields products that can be resolved by high-resolution polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) at a single-nucleotide level by locating individual alkylation adducts and DNA strand cleavage at the alkylated guanines. Mapping using B-CePs is a simple and powerful tool for the in vitro characterization of G-quadruplex-forming DNA sequences, enabling the precise location of guanines involved in the formation of G-tetrads.

تسليط الضوء على المؤلف: توصيف الحمض النووي G-quadruplex بواسطة رسم الخرائط الكيميائية القائمة على Bis-3-Chloropiperidine 

Bis-3-chloropiperidines (B-CePs) are useful chemical probes to identify and characterize G-quadruplex structures in DNA templates in vitro. This protocol details the procedure to perform probing reactions with B-CePs and to resolve reaction products by high-resolution polyacrylamide gel electrophoresis.

في المختبر رسم الخرائط الكيميائية لهياكل الحمض النووي G-quadruplex بواسطة Bis-3-chloropiperidines

G-quadruplexes (G4s) are biologically relevant, non-canonical DNA structures that play an important role in gene expression and diseases, representing ...