Name: kinetic screening of nuclease activity using nucleic acid probes
Uploaded: 2019-11-01T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes at JoVE.com

De auteurs willen Luiza I. Hernandez (Linköping University) erkennen voor haar zorgvuldige revisie van het manuscript en waardevol advies. Dit werk werd gesteund door de Stichting Knut en Alice Wallenberg en de strategische onderzoeksruimte van de Zweedse overheid in Materials Science over geavanceerde functionele materialen aan de Universiteit van Linköping (faculteits subsidie SFO-mat-LiU nr. 2009-00971).

1. ontwerp en voorbereiding van een oligonucleotide-bibliotheek
<ol><li>Bibliotheek ontwerp<ol>
<li>Op basis van de volgende criteria ontwerp een bibliotheek van afgeschrikt fluorescerende oligonucleotide sondes tussen 8 en 12-Mer lang om secundaire structuur vorming te voorkomen, met gelijke lengte voor alle sondes.<ol>
<li>Omvatten ten minste één DNA en één RNA willekeurige sequentie met een combinatie van adenine (A), Guanine (G), cytosine (C) en thymine (T)/uracil (U) (DNA-en RNA-sondes in tabel 1</stro...

<ol>
	<li>Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleases:+diversity+of+structure,+function+and+mechanism.">Nucleases: diversity of structure, function and mechanism.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 44 (1), 1-93 (2011).</li><li>Adli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR+tool+kit+for+genome+editing+and+beyond.">The CRISPR tool kit for genome editing and beyond.</a> Nature Communication. 9 (1), 1911 (2018).</li><li>Mason, P. A., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+DNA+exonucleases+in+protecting+genome+stability+and+their+impact+on+ageing.">The role of DNA exonucleases in protecting genome stability and their impact on ageing.</a> Age (Dordr). 34 (6), 1317-1340 (2012).</li><li>Berends, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclease+expression+by+Staphylococcus+aureus+facilitates+escape+from+neutrophil+extracellular+traps.">Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Innate Immunity. 2 (6), 576-586 (2010).</li><li>Kiedrowski, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+Nuc2+is+a+functional,+surface-attached+extracellular+nuclease.">Staphylococcus aureus Nuc2 is a functional, surface-attached extracellular nuclease.</a> PLoS One. 9 (4), 95574 (2014).</li><li>Morita, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall-anchored+nuclease+of+Streptococcus+sanguinis+contributes+to+escape+from+neutrophil+extracellular+trap-mediated+bacteriocidal+activity.">Cell wall-anchored nuclease of Streptococcus sanguinis contributes to escape from neutrophil extracellular trap-mediated bacteriocidal activity.</a> PLoS One. 9 (8), 103125 (2014).</li><li>Hasegawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+virulence-associated+and+cell-wall-located+DNase+of+Streptococcus+pyogenes.">Characterization of a virulence-associated and cell-wall-located DNase of Streptococcus pyogenes.</a> Microbiology. 156, 184-190 (2010).</li><li>Moon, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+catalytic+and+substrate+binding+mechanisms+of+the+strategic+EndA+nuclease+from+Streptococcus+pneumoniae.">Structural insights into catalytic and substrate binding mechanisms of the strategic EndA nuclease from Streptococcus pneumoniae.</a> Nucleic Acids Research. 39 (7), 2943-2953 (2011).</li><li>Li, L. Y., Luo, X., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endonuclease+G+is+an+apoptotic+DNase+when+released+from+mitochondria.">Endonuclease G is an apoptotic DNase when released from mitochondria.</a> Nature. 412 (6842), 95-99 (2001).</li><li>McDermott-Roe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endonuclease+G+is+a+novel+determinant+of+cardiac+hypertrophy+and+mitochondrial+function.">Endonuclease G is a novel determinant of cardiac hypertrophy and mitochondrial function.</a> Nature. 478 (7367), 114-118 (2011).</li><li>Wang, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+link+between+adipogenesis+and+innate+immunity:+RNase-L+promotes+3T3-L1+adipogenesis+by+destabilizing+Pref-1+mRNA.">A link between adipogenesis and innate immunity: RNase-L promotes 3T3-L1 adipogenesis by destabilizing Pref-1 mRNA.</a> Cell Death &amp; Disease. 7 (11), 2458 (2016).</li><li>Li, C. L., Yang, W. Z., Shi, Z., Yuan, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tudor+staphylococcal+nuclease+is+a+structure-specific+ribonuclease+that+degrades+RNA+at+unstructured+regions+during+microRNA+decay.">Tudor staphylococcal nuclease is a structure-specific ribonuclease that degrades RNA at unstructured regions during microRNA decay.</a> RNA. 24 (5), 739-748 (2018).</li><li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MTDH-SND1+interaction+is+crucial+for+expansion+and+activity+of+tumor-initiating+cells+in+diverse+oncogene-+and+carcinogen-induced+mammary+tumors.">MTDH-SND1 interaction is crucial for expansion and activity of tumor-initiating cells in diverse oncogene- and carcinogen-induced mammary tumors.</a> Cancer Cell. 26 (1), 92-105 (2014).</li><li>Keyel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dnases+in+health+and+disease.">Dnases in health and disease.</a> Developmental Biology. 429 (1), 1-11 (2017).</li><li>Hernandez, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+imaging+of+Staphylococcus+aureus+infections+with+a+nuclease-activated+probe.">Noninvasive imaging of Staphylococcus aureus infections with a nuclease-activated probe.</a> Nature Medicine. 20 (3), 301-306 (2014).</li><li>Flenker, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Detection+of+Urinary+Tract+Infections+via+Bacterial+Nuclease+Activity.">Rapid Detection of Urinary Tract Infections via Bacterial Nuclease Activity.</a> Molecular Therapy. 25 (6), 1353-1362 (2017).</li><li>Kannan, N., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tipping+the+balance:+MTDH-SND1+curbs+oncogene-induced+apoptosis+and+promotes+tumorigenesis.">Tipping the balance: MTDH-SND1 curbs oncogene-induced apoptosis and promotes tumorigenesis.</a> Cell Stem Cell. 15 (2), 118-120 (2014).</li><li>Kemmer, T. P., Malfertheiner, P., Buchler, M., Kemmer, M. L., Ditschuneit, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+ribonuclease+activity+in+the+diagnosis+of+pancreatic+disease.">Serum ribonuclease activity in the diagnosis of pancreatic disease.</a> International Journal of Pancreatology. 8 (1), 23-33 (1991).</li><li>Fernandez-Salas, E., Peracaula, R., Frazier, M. L., de Llorens, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleases+expressed+by+human+pancreatic+adenocarcinoma+cell+lines.">Ribonucleases expressed by human pancreatic adenocarcinoma cell lines.</a> European Journal of Biochemistry. 267 (5), 1484-1494 (2000).</li><li>Fujibayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+deoxyribonuclease+I+activity+can+be+a+useful+diagnostic+marker+for+the+early+diagnosis+of+unstable+angina+pectoris+or+non-ST-segment+elevation+myocardial+infarction.">Serum deoxyribonuclease I activity can be a useful diagnostic marker for the early diagnosis of unstable angina pectoris or non-ST-segment elevation myocardial infarction.</a> Journal of Cardiology. 59 (3), 258-265 (2012).</li><li>Kawai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+use+of+serum+deoxyribonuclease+I+activity+as+a+novel+early-phase+marker+in+acute+myocardial+infarction.">Diagnostic use of serum deoxyribonuclease I activity as a novel early-phase marker in acute myocardial infarction.</a> Circulation. 109 (20), 2398-2400 (2004).</li><li>Hernandez, L. I., Ozalp, V. C., Hernandez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclease+activity+as+a+specific+biomarker+for+breast+cancer.">Nuclease activity as a specific biomarker for breast cancer.</a> Chemical Communication (Cambridge). 52 (83), 12346-12349 (2016).</li><li>Machado, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+specific+detection+of+Salmonella+infections+using+chemically+modified+nucleic+acid+probes.">Rapid and specific detection of Salmonella infections using chemically modified nucleic acid probes.</a> Analytica Chimica Acta. 1054, 157-166 (2019).</li><li>Sanders, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aseptic+laboratory+techniques:+plating+methods.">Aseptic laboratory techniques: plating methods.</a> Journal of Visualized Experiment. (63), e3064 (2012).</li><li>Worthington Biochemical Corporation. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Clinical Enzyme Measurements. , (1972).</li><li>Burghardt, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+Culture-Free+Detection+of+Staphylococcus+aureus+Bacteremia.">Rapid, Culture-Free Detection of Staphylococcus aureus Bacteremia.</a> PLoS One. 11 (6), 0157234 (2016).</li><li>Bibette, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaining+confidence+in+high-throughput+screening.">Gaining confidence in high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (3), 649-650 (2012).</li><li>Hernandez, L. I., Machado, I., Schafer, T., Hernandez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers+overview:+selection,+features+and+applications.">Aptamers overview: selection, features and applications.</a> Current Topics in Medicinal Chemistry. 15 (12), 1066-1081 (2015).</li><li>Pande, J., Szewczyk, M. M., Grover, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display:+concept,+innovations,+applications+and+future.">Phage display: concept, innovations, applications and future.</a> Biotechnology Advances. 28 (6), 849-858 (2010).</li><li>Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+binding+proteins:+anticalins+-+harnessing+the+structural+plasticity+of+the+lipocalin+ligand+pocket+to+engineer+novel+binding+activities.">Alternative binding proteins: anticalins - harnessing the structural plasticity of the lipocalin ligand pocket to engineer novel binding activities.</a> FEBS Journal. 275 (11), 2677-2683 (2008).</li><li>Ku, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+Acid+Aptamers:+An+Emerging+Tool+for+Biotechnology+and+Biomedical+Sensing.">Nucleic Acid Aptamers: An Emerging Tool for Biotechnology and Biomedical Sensing.</a> Sensors (Basel). 15 (7), 16281-16313 (2015).</li><li>Jayasena, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers:+an+emerging+class+of+molecules+that+rival+antibodies+in+diagnostics.">Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics.</a> Clinical Chemistry. 45 (9), 1628-1650 (1999).</li><li>Gray, B. P., Brown, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+peptide+libraries:+mining+for+cell-binding+peptides.">Combinatorial peptide libraries: mining for cell-binding peptides.</a> Chemical Reviews. 114 (2), 1020-1081 (2014).</li></ol>

Veranderingen van Nuclease activiteit zijn in verband gebracht met een breed scala aan ziekten fenotypes, met inbegrip van verschillende soorten kanker en bacteriële infecties. Deze wijzigingen worden voorgesteld als de veroorzaker van een aandoening14, terwijl in andere gevallen zij het gevolg zijn van een schadelijk fysiologisch voorval20 of pathogene agens16,26. Niet verrassend, pogingen om nucleasen en Nuclease...

Nucleasen zijn een klasse van enzymen die in staat zijn om de fosfodiësterbindingen die de ruggengraat structuur van nucleïnezuur moleculen vormen, te cleaven. De enorme diversiteit van nucleasen maakt hun classificatie nogal moeilijk. Er zijn echter enkele gemeenschappelijke criteria die worden gebruikt om nucleasen te beschrijven, zoals substraat voorkeur (deoxyribonucleïnezuur (DNA) of ribonucleïnezuur (RNA)), decolleté (endonucleases of exonucleases), of metaalionen afhankelijkheid, onder andere1. Nucleasen zijn sterk geconjugeerde katalytische enzymen die fundamentele rollen hebben in zowel prokaryote als eukaryote organismen en zijn gebruikt, en blijven worden gebruikt, als gen editing tools2. Ze zijn ook fundamentele actoren in DNA-onderhoud en-replicatie, helpen om genoom stabiliteit te houden en deel te nemen aan proof-reading processen3. In bacteriën, bijvoorbeeld, nucleasen zijn geïdentificeerd als belangrijke virulentie factoren, in staat om bacteriële overleving te bevorderen door het verminderen van de werkzaamheid van het immuunsysteem van de gastheer4,5,6,7 ,8. Bij zoogdieren zijn nucleasen gesuggereerd om betrokken te zijn bij apoptosis9, mitochondriale biogenese en onderhoud10 en bemiddeling van antibacteriële en antivirale aangeboren immuunresponsen11. Niet verrassend, Nuclease activiteit veranderingen, of verbetering of gebrek aan, zijn betrokken bij een breed scala van menselijke ziekten. Deze ziekten variëren van een breed scala aan kankers12,13 tot cardiale hypertrofie10 of auto-immuunziekten14. Daarom zijn nucleasen interessante kandidaten geworden als biomarkers voor een heterogene groep menselijke aandoeningen. In feite hebben nucleasen al hun potentieel aangetoond als succesvolle diagnostische hulpmiddelen voor het opsporen van infecties veroorzaakt door specifieke bacteriële agentia, zoals Staphylococcus aureus of Escherichia coli15, 16. in veel soorten kanker is expressie van stafylokokken Nuclease Domain-bevattende proteïne 1 (SND1) ribonuclease indicatief voor slechte prognose17. Bij patiënten met pancreaskanker zijn verhoogde ribonuclease I (RNase I) serumspiegels gemeld18 en voorgesteld om te worden geassocieerd met kankerachtige cel fenotypes19. In ischemische hartaandoeningen, zoals myocardinfarct of instabiele angina pectoris, deoxyribonuclease i (DNase i) serumspiegels is aangetoond dat een geldige diagnostische marker20,21.
Het heeft zijn veronderstelde dat de globale blauwdruk van Nuclease activiteit kan verschillen in gezonde en ziektetoestanden. In feite hebben recente rapporten gebruik gemaakt van verschillen in Nuclease activiteit om onderscheid te maken tussen gezonde en kankerachtige fenotypes22 of om pathogene bacteriële infecties te identificeren op een soortspecifieke manier15,23. Deze bevindingen hebben een nieuwe laan geopend voor het gebruik van nucleasen als biomarkers van de ziekte. Daarom bestaat er een noodzaak voor de ontwikkeling van een uitgebreide screeningsmethode die in staat is om systematisch met de ziekte samenhangende verschillen in Nuclease activiteit te identificeren, wat van cruciaal belang kan zijn bij de ontwikkeling van nieuwe diagnostische instrumenten.
Hierin introduceren en beschrijven we een nieuwe in-vitro screening aanpak (Figuur 1) om gevoelige en specifieke sondes te identificeren die kunnen discrimineren tussen Nuclease activiteit in gezond en ongezond, of activiteit specifiek voor een type cel of bacteriën. Door gebruik te maken van de modulariteit van nucleïnezuren, ontwierpen we een initiële bibliotheek van gebluste fluorescerende oligonucleotide sondes bestaande uit een uitgebreide set van verschillende sequenties en chemici, beide zijn belangrijke parameters voor het ontwerp van de bibliotheek. Deze oligonucleotide sondes worden geflankeerd door een de (fluorescein amidite, fam) en een dorstlesser (Tide dorstlesser 2, TQ2) aan respectievelijk 5 ' en 3 ' uiteinden (tabel 1). Door gebruik te maken van deze fluorometrische assay op basis van fluorescerende resonantie energie overdracht (FRET) om de kinetiek van enzymatische afbraak te meten, konden we kandidaatsondes identificeren met het potentieel om differentiaal patronen van Nuclease activiteit te discrimineren geassocieerd met gezonde of ziektetoestanden. We ontwierpen een iteratief proces, waarin nieuwe bibliotheken worden gemaakt op basis van de beste kandidaat-sondes, die het mogelijk maakt om steeds specifiekere kandidaat-sondes te identificeren in volgende screenings stappen. Bovendien maakt deze aanpak gebruik van de katalytische aard van nucleasen om de gevoeligheid te verhogen. Dit wordt bereikt door gebruik te maken van de activeerbaar aard van de reporter sondes en het vermogen van nucleasen om substraat moleculen voortdurend te verwerken, die beide belangrijke voordelen ten opzichte van alternatieve antilichamen of kleine op moleculen gebaseerde screeningsmethoden vertegenwoordigen.
Deze aanpak biedt een zeer modulair, flexibel en eenvoudig te implementeren screening tool voor de identificatie van specifieke nucleïnezuur voelers die kunnen discrimineren tussen gezonde en ziektetoestanden, en een uitstekend platform voor de ontwikkeling van nieuwe diagnostische hulpmiddelen die kunnen worden aangepast voor toekomstige klinische toepassingen. Als zodanig werd deze benadering gebruikt om de Nuclease activiteit te identificeren die is afgeleid van salmonella typhimurium (hierna salmonellagenoemd) voor de specifieke identificatie van deze bacteriën. In het volgende Protocol rapporteren we over een methode voor het scherm voor bacteriële Nuclease-activiteit met behulp van kinetische analyse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:759px;" width="759">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Black bottom, non-treated 96 well plate</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10000631</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Cytation1</td>
			<td style="width:199px;">BioTek</td>
			<td style="width:128px;">CYT1FAV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Eppendorf tubes</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td style="width:128px;">11926955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Escherichia coli</td>
			<td style="width:199px;">ATCC</td>
			<td style="width:128px;">25922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Microbank cryogenic storage vial containing beads</td>
			<td style="width:199px;">Pro-Lab Diagnostics</td>
			<td style="width:128px;">22-286-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Nucleic acid probes</td>
			<td style="width:199px;">Biomers.net</td>
			<td style="width:128px;">#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Phosphate Buffer Saline containing MgCl2 and CaCl2</td>
			<td style="width:199px;">Gibco&#8482;</td>
			<td style="width:128px;">14040117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Salmonella enterica subs. Enterica</td>
			<td style="width:199px;">ATCC</td>
			<td style="width:128px;">14028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Tris-EDTA</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10647633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Tryptone Soya Agar with defibrinated sheep blood</td>
			<td style="width:199px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10362223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:199px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">22092</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

kinetic screening of nuclease activity using nucleic acid probes

Nucleasen zijn een klasse van enzymen die nucleïnezuren afbreken door de hydrolyse van de fosfodiësterbindingen die de ribose-suikers koppelen, te katalyseren. Nucleasen vertonen een verscheidenheid aan vitale fysiologische rollen in prokaryotische en eukaryote organismen, variërend van het handhaven van genoom stabiliteit tot het bieden van bescherming tegen pathogenen. Veranderde Nuclease activiteit is geassocieerd met verschillende pathologische aandoeningen, waaronder bacteriële infecties en kanker. Om dit te doen, Nuclease activiteit heeft aangetoond groot potentieel om te worden uitgebuit als een specifieke biomarker. Een robuuste en reproduceerbare screeningsmethode op basis van deze activiteit blijft echter zeer wenselijk.
Hierin introduceren we een methode die screening mogelijk maakt voor Nuclease activiteit met behulp van nucleïnezuur sondes als substraten, met de reikwijdte van het differentiëren tussen pathologische en gezonde omstandigheden. Deze methode biedt de mogelijkheid van het ontwerpen van nieuwe probe-Bibliotheken, met toenemende specificiteit, op een iteratieve manier. Zo zijn meerdere screenings rondes nodig om het ontwerp van de probes te verfijnen met verbeterde functies, waarbij gebruik wordt maken van de beschikbaarheid van chemisch gemodificeerde nucleïnezuren. Het aanzienlijke potentieel van de voorgestelde technologie ligt in de flexibiliteit, hoge reproduceerbaarheid en veelzijdigheid voor de screening van Nuclease activiteit in verband met ziekte omstandigheden. Verwacht wordt dat deze technologie de ontwikkeling van veelbelovende diagnostische hulpmiddelen mogelijk maakt met een groot potentieel in de kliniek.

Figuur 1 toont de werkstroom van deze methodologie, die is onderverdeeld in twee screenings rondes. In de eerste screening ronde gebruikten we 5 DNA-sondes (DNA, DNA poly A, DNA poly T, DNA poly C en DNA Poly G) en ook 5 RNA sondes (RNA, RNA poly A, RNA poly U RNA poly C en RNA Poly G). De ruwe gegevens van deze screening ronde zijn te vinden in aanvullende tabel 1. In de tweede ronde werden chemisch gemodificeerde sondes gesynthetiseerd door de RNA-sequentie te vervangen do...

Watch this Scientific Journal Video about Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes at JoVE.com

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Veranderde Nuclease activiteit is in verband gebracht met verschillende menselijke omstandigheden, die onderliggende zijn potentieel als een biomarker. De modulaire en eenvoudig te implementeren screenings methodiek die in dit document wordt gepresenteerd, maakt het mogelijk specifieke nucleïnezuur voelers te selecteren voor het benutten van Nuclease activiteit als een biomarker van de ziekte.

Kinetische screening van Nuclease activiteit met behulp van nucleïnezuur sondes

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Dit protocol biedt een krachtig alternatief voor het screenen van nuclease-activiteit als biomarker van de ziekte, met een eenvoudig te implementeren methodologie, zelfs voor onderzoekers die niet zo gespecialiseerd zijn in nucleïnezuursondes. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om nucleïnezuursondes te selecteren die zowel bekende als onbekende nuclease-activiteiten kunnen identificeren, waarbij gebruik wordt gemaakt van de sonde-nuclease dynamische interactie. Andere voordelen van deze methodologie zijn de flexibiliteit, hoge reproduceerbaarheid en gebruiksgemak.De demonstratie wordt uitgevoerd door Khadija, een masters student, en Baris, een postdoc uit ons laboratorium. Bij het ontwerpen van een oligonucleotide bibliotheek, omvatten ten minste een DNA en een RNA willekeurige sequentie met een combinatie van adenine, guanine, cytosine en thiamine of uracil. Om de oligonucleotidesondes voor te bereiden, draai je de lyophilized oligonucleotidesondes naar beneden en verdun je elke sonde in tris-EDTA-buffer bij een 500 picomolar per microliterconcentratie om nuclease afbraak te voorkomen.Voor bacteriële cultuur op vast medium, rol een enkele poreuze glazen kraal van cryogene opslag rechtstreeks op een cultuur schotel met TSA aangevuld met gedefibrineerd schapenbloed te strepen uit individuele bacteriële kolonies. Plaats de plaat dan 24 uur op 37 graden Celsius. Voor bacteriële cultuur in vloeibaar medium, breng een enkele kolonie van een solide medium cultuur naar 50 milliliter TSB voor incubatie bij 37 graden Celsius gedurende 24 uur bij 200 rotaties per minuut.De volgende dag, verdun de cultuur op een een tot 500 verhouding in verse TSB en broeden de bacteriën voor een extra 24 uur op 37 graden Celsius en 200 rotaties per minuut in een schudden incubator. Om een nuclease activiteitstest op te zetten, verwarm eerst een fluorometer tot 37 graden Celsius en voeg voorzichtig 96 microliter steriele TSB of supernatant van een Salmonella of E.Coli vloeibare medium cultuur toe aan één 1,5 milliliter nuclease-vrije microcentrifuge buis per sonde. Voeg vier microliters van sonde werkoplossing aan elke buis en gebruik een pipet om grondig mengen elke buis inhoud tot homogene oplossingen zijn bereikt, het verzorgen van bubbels te voorkomen.Laad vervolgens voorzichtig 95 microliter van elke oplossing dicht bij de wand van individuele putten van een zwarte bodem, niet-behandelde 96 putplaat, waarbij u ervoor zorgt dat bellen worden vermeden. Wanneer alle oplossingen zijn toegevoegd, dek de plaat af en inspecteer visueel het deksel op penmarkeringen of stof dat meetartefacten kan introduceren. Open een geschikt acquisitiesoftwareprogramma om de software voor nuclease-activiteitsmeting in te stellen.Selecteer Nu lezen in het venster Taakbeheer en selecteer Nieuw om het kinetische metingsprotocol te maken. Klik op Temperatuur instellen om 37 graden Celsius te selecteren en bevestig en sla de instellingen op door op OK te klikken. Klik op Kinetiek starten. Selecteer in het pop-upvenster twee uur in het invoervak Tijd uitvoeren en twee minuten in het intervalinvoervak voordat u op OK klikt om de instellingen te bevestigen en op te slaan.Klik op Lezen. Selecteer in het pop-upvenster Fluorescentieintensiteit als detectiemethode, Eindpunt kinetisch als leestype en filters als optiektype. Klik vervolgens op OK. Selecteer Groen in het pop-upvenster in de filterset en klik op OK. Selecteer in het venster Procedure het deksel gebruiken en klik op Valideren.Er verschijnt een pop-upvenster waarin wordt bevestigd dat het gemaakte protocol geldig is. Selecteer procedure onder het menu Protocol. Definieer in het venster Procedure de te meten putten en voer de naam van het experiment in het invoervak Bestandsnaam in.Laad vervolgens de plaat in de plaatlezer, zorg ervoor dat de plaat in de juiste richting en klik op de knop Nieuw lezen om de overname te beginnen. Open voor gegevensanalyse de gegevens in de juiste analysesoftware en selecteer een van de gemeten putten in de plaat één venster. Klik op Putten selecteren en voeg alle gemeten putten toe in het dialoogvenster Putselectie voordat u op OK klikt. Selecteer vervolgens Gegevens in het hoofdvenster van de plaat om de getabuleerde resultaten te visualiseren en klik op QuickExport om de gegevens naar een spreadsheet te exporteren.Label in een spreadsheet de gegevenskolommen naar gelang van het geval voor elk monster en elke sonde en zet de relatieve fluorescentie-eenheden in kaart ten opzichte van de tijd voor de gegevens om kinetische grafieken te genereren. In dit representatieve experiment, na de eerste testronde, rapporteerden de Salmonella-cultuursupernatants een duidelijke voorkeur voor RNA-sondes boven de DNA-sondes. Op basis van de identificatie van RNA als het gewenste nucleïnezuurtype door Salmonella nucleases, is een nieuwe RNA-only bibliotheek ontworpen om te worden gebruikt in de tweede screeningsronde.E.Coli in de medium controles in de cultuur toonde daarentegen een zeer beperkt vermogen om RNA-sondes te degraderen. Na een tweede screeningsronde met behulp van chemisch gemodificeerde nucleotiden die gericht zijn op het verhogen van de specificiteit van de RNA-sondes, kon RNA pyrimidine 2'O-methyl en RNA purine 2'O-methyl op basis van hun chemische modificaties worden geïdentificeerd als het best presterende kinetische gedrag in vergelijking met respectievelijk het RNA pyrimidine 2'fluoro en RNAine 2'fluoro. Deze resultaten suggereren dat Salmonella heeft een belangrijke RNAse activiteit met differentiële substraat chemie voorkeur die kan worden gebruikt voor het selecteren van sondes in staat om specifiek te herkennen deze bacteriën.Deze procedure maakt het mogelijk om sondes te selecteren die in staat zijn om nuclease-activiteiten in verband met ziekteomstandigheden te identificeren, zoals kanker of bacteriële infectie, waardoor nieuwe klinische diagnostische instrumenten kunnen worden ontwikkeld.

kinetic-screening-of-nuclease-activity-using-nucleic-acid-probes

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Polyaniline-based Sensor of Nucleic Acids

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies rely on enzymatic modification that can introduce bias and artifacts. A critical element of next generation detection platforms will be direct molecular sensing, thereby avoiding a need for amplification or labels. Advanced nanomaterials may provide the suitable chemical modalities to realize label-free sensors. Conjugated polymers are ideal for biological sensing, possessing properties compatible with biomolecules and exhibit high sensitivity to localized environmental changes. In this article, a method is presented for detecting nucleic acids using the electroconductive polymer polyaniline. Simple DNA "probe" oligonucleotides complementary to target nucleic acids are attached electrostatically to the polymer, creating a sensor system that can differentiate single nucleotide differences in target molecules. Outside the specific and unbiased nature of this technology, it is highly cost effective.

Nucleic acids are common analytes for assessing biological systems; however, bias from enzymatic manipulation can cause concern. Here a method is described for label-free detection of nucleic acids using polyaniline. This sensitive, cost-effective sensor technology can distinguish single nucleotide differences between molecules.

Een polyaniline gebaseerde sensor van nucleïnezuren

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies ...

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical probe that targets the enzyme&#39;s active sites. A reporter tag introduced into the probe allows for the detection of the labeled enzyme by in-gel fluorescence scanning, protein blot, fluorescence microscopy, or liquid chromatography-mass spectrometry. Here, we describe the preparation and use of the compound ARN14686, a click chemistry activity-based probe (CC-ABP) that selectively recognizes the enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA). NAAA is a cysteine hydrolase that promotes inflammation by deactivating endogenous peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)-alpha agonists such as palmitoylethanolamide (PEA) and oleoylethanolamide (OEA). NAAA is synthesized as an inactive full-length proenzyme, which is activated by autoproteolysis in the acidic pH of the lysosome. Localization studies have shown that NAAA is predominantly expressed in macrophages and other monocyte-derived cells, as well as in B-lymphocytes. We provide examples of how ARN14686 can be used to detect and quantify active NAAA ex vivo in rodent tissues by protein blot and fluorescence microscopy.

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Here, we describe the preparation and use of an activity-based probe (ARN14686, undec-10-ynyl-N-[(3S)-2-oxoazetidin-3-yl]carbamate) that allows for the detection and quantification of the active form of the proinflammatory enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA), both in vitro and ex vivo.

voorbereiding en<em&gt; In Vivo</em&gt; Gebruik van een Activity-based Probe voor<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine Acid amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic purification methods. This manuscript illustrates the technical details involved in the anaerobic purification process, including the preparation of buffers and reagents, the methods for column chromatography in a glove box, and the desalting of the protein prior to kinetics. Also described are the methods for preparing and using an oxygen electrode to perform kinetic characterization of an oxygen-utilizing enzyme. These methods are illustrated using the dioxygenase enzyme DesB, a gallate dioxygenase from the bacterium Sphingobium sp. strain SYK-6.

Here we present a protocol for anaerobic protein purification, anaerobic protein concentration, and subsequent kinetic characterization using an oxygen electrode system. The method is illustrated using the enzyme DesB, a dioxygenase enzyme which is more stable and active when purified and stored in an anaerobic environment.

Anaërobe EiwitReiniging en kinetische analyse via zuurstof-elektrode voor het bestuderen van de activiteit van de DesB Dioxygenase en inhibitie

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, fluorophores are prone to loss of signal via photobleaching by dissolved oxygen (O2). To prevent photobleaching and extend the fluorophore lifetime, oxygen scavenging systems (OSS) are employed to reduce O2. Commercially available OSS may be contaminated by nucleases that damage or degrade nucleic acids, confounding interpretation of experimental results. Here we detail a protocol for the expression and purification of highly active Pseudomonas putida protocatechuate-3,4-dioxygenase (PCD) with no detectable nuclease contamination. PCD can efficiently remove reactive O2 species by conversion of the substrate protocatechuic acid (PCA) to 3-carboxy-cis,cis-muconic acid. This method can be used in any aqueous system where O2 plays a detrimental role in data acquisition. This method is effective in producing highly active, nuclease free PCD in comparison with commercially available PCD.

Protocatechuate 3,4-dioxygenase (PCD) can enzymatically remove free diatomic oxygen from an aqueous system using its substrate protocatechuic acid (PCA). This protocol describes the expression, purification, and activity analysis of this oxygen scavenging enzyme.

Expressie en zuivering van Nuclease-vrije zuurstof Scavenger Protocatechuate 3, 4-dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls and is an aromatic heteropolymer primarily composed of three monolignols with significant industrial importance. Lignin plays an important role in plant growth and development, protects&#160;from biotic and abiotic stresses, and in the quality of animal fodder, the wood, and industrial lignin products. Accurate estimation of lignin content is essential for both fundamental understanding of the lignin biosynthesis and industrial applications of biomass. The thioglycolic acid (TGA) method is a highly reliable method of estimating the total lignin content in the plant biomass. This method estimates the lignin content by forming thioethers with the benzyl alcohol groups of lignin, which are soluble in alkaline conditions and insoluble in acidic conditions. The total lignin content is estimated using a standard curve generated from commercial bamboo lignin.

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

Here, we present a modified TGA method for estimation of lignin content in herbaceous plant biomass. This method estimates the lignin content by forming specific thioether bonds with lignin and presents an advantage over the Klason method, as it requires a relatively small sample for lignin content estimation.

Schatting van het ligninegehalte van plantaardige biomassa met thioglycolzuur (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes measurements on freely diffusing biomolecules more accessible. This overview includes a step-by-step protocol for using this instrument to make measurements of precise FRET efficiencies in duplex DNA samples, including details of the sample preparation, instrument setup and alignment, data acquisition, and complete analysis routines. The presented approach, which includes how to determine all the correction factors required for accurate FRET-derived distance measurements, builds on a large body of recent collaborative work across the FRET Community, which aims to establish standard protocols and analysis approaches. This protocol, which is easily adaptable to a range of biomolecular systems, adds to the growing efforts in democratising smFRET for the wider scientific community.

This article provides step-by-step instructions for making fully-corrected accurate FRET measurements on individual, freely diffusing biomolecules using the open-source, inexpensive smfBox, from switch on, through alignment and focusing, to data collection and analysis.

Nauwkeurige en nauwkeurige FRET-metingen met één molecuul uitvoeren met behulp van de Open-Source smfBox

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

Determining the Thermodynamic and Kinetic Association of a DNA Aptamer and Tetracycline Using Isothermal Titration Calorimetry

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for application. Due to the drastic differences between the aptamer and small molecules, scientists need to put much effort into characterizing their binding properties. Isothermal Titration Calorimetry (ITC) is a powerful approach for this purpose. ITC goes beyond determining disassociation constants (Kd) and can provide the enthalpy changes and binding stoichiometry of the interaction between two molecules in the solution phase. This approach conducts continuous titration using label-free molecules and records released heat over time upon the binding events produced by each titration, so the process can sensitively measure the binding between macromolecules and their small targets. Herein, the article introduces a step-by-step procedure of the ITC measurement of a selected aptamer with a small target, tetracycline. This example proves the versatility of the technique and its potential for other applications.

The present protocol describes the use of Isothermal Titration Calorimetry (ITC) to analyze the association and dissociation kinetics of the binding between a DNA aptamer and tetracycline, including sample preparation, running standards and samples, and interpreting the resulting data.

Het bepalen van de thermodynamische en kinetische associatie van een DNA-aptamer en tetracycline met behulp van isothermische titratiecalorimetrie

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for ...

Identificatie van G-quadruplexen in een DNA-sjabloon met behulp van chemische mapping

In Vitro Chemical Mapping of G-Quadruplex DNA Structures by Bis-3-Chloropiperidines

G-quadruplexes (G4s) are biologically relevant, non-canonical DNA structures that play an important role in gene expression and diseases, representing significant therapeutic targets. Accessible methods are required for the in vitro characterization of DNA within potential G-quadruplex-forming sequences (PQSs). B-CePs are a class of alkylating agents that have proven to be useful chemical probes for investigation of the higher-order structure of nucleic acids. This paper describes a new chemical mapping assay exploiting the specific reactivity of B-CePs with the N7 of guanines, followed by direct strand cleavage at the alkylated Gs. 
Namely, to distinguish G4 folds from unfolded DNA forms, we use B-CeP 1 to probe the thrombin-binding aptamer (TBA), a 15-mer DNA able to assume the G4 arrangement. Reaction of B-CeP-responding guanines with B-CeP 1 yields products that can be resolved by high-resolution polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) at a single-nucleotide level by locating individual alkylation adducts and DNA strand cleavage at the alkylated guanines. Mapping using B-CePs is a simple and powerful tool for the in vitro characterization of G-quadruplex-forming DNA sequences, enabling the precise location of guanines involved in the formation of G-tetrads.

Auteur in de schijnwerpers: Karakterisering van DNA G-quadruplex door op bis-3-chloorpiperidine gebaseerde chemische kartering 

Bis-3-chloropiperidines (B-CePs) are useful chemical probes to identify and characterize G-quadruplex structures in DNA templates in vitro. This protocol details the procedure to perform probing reactions with B-CePs and to resolve reaction products by high-resolution polyacrylamide gel electrophoresis.

In vitro Chemisch in kaart brengen van G-quadruplex DNA-structuren door Bis-3-Chloropiperidines

G-quadruplexes (G4s) are biologically relevant, non-canonical DNA structures that play an important role in gene expression and diseases, representing ...