Name: kinetic screening of nuclease activity using nucleic acid probes
Uploaded: 2019-11-01T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes at JoVE.com

Les auteurs aimeraient remercier Luiza I. Hernandez (Université de Link-ping) pour sa révision minutieuse du manuscrit et ses précieux conseils. Ce travail a été soutenu par la Fondation Knut et Alice Wallenberg et le Swedish Government Strategic Research Area in Materials Science on Advanced Functional Materials de l'Université Link-ping (Faculty Grant SFO-Mat-LiU no 2009-00971).

1. Conception et préparation de la bibliothèque Oligonucleotide
<ol><li>Conception de bibliothèque<ol>
<li>Sur la base des critères suivants, une bibliothèque de sondes d'oligonucléotides fluorescents étanchéités de 8 à 12 mers de long afin d'éviter la formation de structures secondaires, avec une longueur égale pour toutes les sondes.<ol>
<li>Inclure au moins un ADN et une séquence aléatoire d'ARN contenant une combinaison d'adénine (A), de guanine (G), de cytosine (C) et de thymine (T)/uracil (U)<stron...

<ol>
	<li>Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleases:+diversity+of+structure,+function+and+mechanism.">Nucleases: diversity of structure, function and mechanism.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 44 (1), 1-93 (2011).</li><li>Adli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR+tool+kit+for+genome+editing+and+beyond.">The CRISPR tool kit for genome editing and beyond.</a> Nature Communication. 9 (1), 1911 (2018).</li><li>Mason, P. A., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+DNA+exonucleases+in+protecting+genome+stability+and+their+impact+on+ageing.">The role of DNA exonucleases in protecting genome stability and their impact on ageing.</a> Age (Dordr). 34 (6), 1317-1340 (2012).</li><li>Berends, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclease+expression+by+Staphylococcus+aureus+facilitates+escape+from+neutrophil+extracellular+traps.">Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Innate Immunity. 2 (6), 576-586 (2010).</li><li>Kiedrowski, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+Nuc2+is+a+functional,+surface-attached+extracellular+nuclease.">Staphylococcus aureus Nuc2 is a functional, surface-attached extracellular nuclease.</a> PLoS One. 9 (4), 95574 (2014).</li><li>Morita, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall-anchored+nuclease+of+Streptococcus+sanguinis+contributes+to+escape+from+neutrophil+extracellular+trap-mediated+bacteriocidal+activity.">Cell wall-anchored nuclease of Streptococcus sanguinis contributes to escape from neutrophil extracellular trap-mediated bacteriocidal activity.</a> PLoS One. 9 (8), 103125 (2014).</li><li>Hasegawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+virulence-associated+and+cell-wall-located+DNase+of+Streptococcus+pyogenes.">Characterization of a virulence-associated and cell-wall-located DNase of Streptococcus pyogenes.</a> Microbiology. 156, 184-190 (2010).</li><li>Moon, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+catalytic+and+substrate+binding+mechanisms+of+the+strategic+EndA+nuclease+from+Streptococcus+pneumoniae.">Structural insights into catalytic and substrate binding mechanisms of the strategic EndA nuclease from Streptococcus pneumoniae.</a> Nucleic Acids Research. 39 (7), 2943-2953 (2011).</li><li>Li, L. Y., Luo, X., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endonuclease+G+is+an+apoptotic+DNase+when+released+from+mitochondria.">Endonuclease G is an apoptotic DNase when released from mitochondria.</a> Nature. 412 (6842), 95-99 (2001).</li><li>McDermott-Roe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endonuclease+G+is+a+novel+determinant+of+cardiac+hypertrophy+and+mitochondrial+function.">Endonuclease G is a novel determinant of cardiac hypertrophy and mitochondrial function.</a> Nature. 478 (7367), 114-118 (2011).</li><li>Wang, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+link+between+adipogenesis+and+innate+immunity:+RNase-L+promotes+3T3-L1+adipogenesis+by+destabilizing+Pref-1+mRNA.">A link between adipogenesis and innate immunity: RNase-L promotes 3T3-L1 adipogenesis by destabilizing Pref-1 mRNA.</a> Cell Death &amp; Disease. 7 (11), 2458 (2016).</li><li>Li, C. L., Yang, W. Z., Shi, Z., Yuan, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tudor+staphylococcal+nuclease+is+a+structure-specific+ribonuclease+that+degrades+RNA+at+unstructured+regions+during+microRNA+decay.">Tudor staphylococcal nuclease is a structure-specific ribonuclease that degrades RNA at unstructured regions during microRNA decay.</a> RNA. 24 (5), 739-748 (2018).</li><li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MTDH-SND1+interaction+is+crucial+for+expansion+and+activity+of+tumor-initiating+cells+in+diverse+oncogene-+and+carcinogen-induced+mammary+tumors.">MTDH-SND1 interaction is crucial for expansion and activity of tumor-initiating cells in diverse oncogene- and carcinogen-induced mammary tumors.</a> Cancer Cell. 26 (1), 92-105 (2014).</li><li>Keyel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dnases+in+health+and+disease.">Dnases in health and disease.</a> Developmental Biology. 429 (1), 1-11 (2017).</li><li>Hernandez, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+imaging+of+Staphylococcus+aureus+infections+with+a+nuclease-activated+probe.">Noninvasive imaging of Staphylococcus aureus infections with a nuclease-activated probe.</a> Nature Medicine. 20 (3), 301-306 (2014).</li><li>Flenker, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Detection+of+Urinary+Tract+Infections+via+Bacterial+Nuclease+Activity.">Rapid Detection of Urinary Tract Infections via Bacterial Nuclease Activity.</a> Molecular Therapy. 25 (6), 1353-1362 (2017).</li><li>Kannan, N., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tipping+the+balance:+MTDH-SND1+curbs+oncogene-induced+apoptosis+and+promotes+tumorigenesis.">Tipping the balance: MTDH-SND1 curbs oncogene-induced apoptosis and promotes tumorigenesis.</a> Cell Stem Cell. 15 (2), 118-120 (2014).</li><li>Kemmer, T. P., Malfertheiner, P., Buchler, M., Kemmer, M. L., Ditschuneit, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+ribonuclease+activity+in+the+diagnosis+of+pancreatic+disease.">Serum ribonuclease activity in the diagnosis of pancreatic disease.</a> International Journal of Pancreatology. 8 (1), 23-33 (1991).</li><li>Fernandez-Salas, E., Peracaula, R., Frazier, M. L., de Llorens, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleases+expressed+by+human+pancreatic+adenocarcinoma+cell+lines.">Ribonucleases expressed by human pancreatic adenocarcinoma cell lines.</a> European Journal of Biochemistry. 267 (5), 1484-1494 (2000).</li><li>Fujibayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+deoxyribonuclease+I+activity+can+be+a+useful+diagnostic+marker+for+the+early+diagnosis+of+unstable+angina+pectoris+or+non-ST-segment+elevation+myocardial+infarction.">Serum deoxyribonuclease I activity can be a useful diagnostic marker for the early diagnosis of unstable angina pectoris or non-ST-segment elevation myocardial infarction.</a> Journal of Cardiology. 59 (3), 258-265 (2012).</li><li>Kawai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+use+of+serum+deoxyribonuclease+I+activity+as+a+novel+early-phase+marker+in+acute+myocardial+infarction.">Diagnostic use of serum deoxyribonuclease I activity as a novel early-phase marker in acute myocardial infarction.</a> Circulation. 109 (20), 2398-2400 (2004).</li><li>Hernandez, L. I., Ozalp, V. C., Hernandez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclease+activity+as+a+specific+biomarker+for+breast+cancer.">Nuclease activity as a specific biomarker for breast cancer.</a> Chemical Communication (Cambridge). 52 (83), 12346-12349 (2016).</li><li>Machado, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+specific+detection+of+Salmonella+infections+using+chemically+modified+nucleic+acid+probes.">Rapid and specific detection of Salmonella infections using chemically modified nucleic acid probes.</a> Analytica Chimica Acta. 1054, 157-166 (2019).</li><li>Sanders, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aseptic+laboratory+techniques:+plating+methods.">Aseptic laboratory techniques: plating methods.</a> Journal of Visualized Experiment. (63), e3064 (2012).</li><li>Worthington Biochemical Corporation. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Clinical Enzyme Measurements. , (1972).</li><li>Burghardt, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+Culture-Free+Detection+of+Staphylococcus+aureus+Bacteremia.">Rapid, Culture-Free Detection of Staphylococcus aureus Bacteremia.</a> PLoS One. 11 (6), 0157234 (2016).</li><li>Bibette, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaining+confidence+in+high-throughput+screening.">Gaining confidence in high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (3), 649-650 (2012).</li><li>Hernandez, L. I., Machado, I., Schafer, T., Hernandez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers+overview:+selection,+features+and+applications.">Aptamers overview: selection, features and applications.</a> Current Topics in Medicinal Chemistry. 15 (12), 1066-1081 (2015).</li><li>Pande, J., Szewczyk, M. M., Grover, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display:+concept,+innovations,+applications+and+future.">Phage display: concept, innovations, applications and future.</a> Biotechnology Advances. 28 (6), 849-858 (2010).</li><li>Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+binding+proteins:+anticalins+-+harnessing+the+structural+plasticity+of+the+lipocalin+ligand+pocket+to+engineer+novel+binding+activities.">Alternative binding proteins: anticalins - harnessing the structural plasticity of the lipocalin ligand pocket to engineer novel binding activities.</a> FEBS Journal. 275 (11), 2677-2683 (2008).</li><li>Ku, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+Acid+Aptamers:+An+Emerging+Tool+for+Biotechnology+and+Biomedical+Sensing.">Nucleic Acid Aptamers: An Emerging Tool for Biotechnology and Biomedical Sensing.</a> Sensors (Basel). 15 (7), 16281-16313 (2015).</li><li>Jayasena, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers:+an+emerging+class+of+molecules+that+rival+antibodies+in+diagnostics.">Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics.</a> Clinical Chemistry. 45 (9), 1628-1650 (1999).</li><li>Gray, B. P., Brown, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+peptide+libraries:+mining+for+cell-binding+peptides.">Combinatorial peptide libraries: mining for cell-binding peptides.</a> Chemical Reviews. 114 (2), 1020-1081 (2014).</li></ol>

Des modifications de l'activité nucléase ont été associées à une grande variété de phénotypes de la maladie, y compris différents types de cancer et d'infections bactériennes. Ces modifications sont proposées pour être l'agent causal d'une condition14, tandis que dans d'autres cas, elles sont la conséquence d'un événement physiologique préjudiciable20 ou agent pathogène16,26. Comme on pouvait s'y a...

Les nucléases sont une classe d'enzymes capables de ciquer les liaisons phosphodiester qui forment la structure dorsale des molécules d'acide nucléique. La grande diversité des nucléases rend leur classification assez difficile. Cependant, certains critères communs sont utilisés pour décrire les nucléases, comme la préférence pour le substrat (acide désoxyribonucléique (ADN) ou acide ribonucléique (ARN), le site de clivage (endonucleases ou exonuclées), ou la dépendance aux ions métalliques, entre autres1. Les nucléases sont des enzymes catalytiques hautement conservées qui ont des rôles fondamentaux dans les organismes procaryotes et eucaryotes et ont été utilisées, et continuent d'être utilisées, comme outils d'édition de gènes2. Ils sont également des acteurs fondamentaux dans l'entretien et la réplication de l'ADN, aidant à maintenir la stabilité du génome et participant aux processus de relecture3. Chez les bactéries, par exemple, les nucléases ont été identifiées comme des facteurs de virulence importants, capables de promouvoir la survie bactérienne en réduisant l'efficacité du système immunitaire de l'hôte4,5,6,7 ,8. Chez les mammifères, on a suggéré que les nucléases soient impliquées dans l'apoptose9, la biogenèse et l'entretien mitochondriaux10 et la médiation des réponses immunitaires innées antibactériennes et antivirales11. Comme on pouvait s'y attendre, des altérations de l'activité nucléane, qu'elles soient améliorées ou en l'absence, ont été impliquées dans un large éventail de maladies humaines. Ces maladies vont d'une grande variété de cancers12,13 à l'hypertrophie cardiaque10 ou les maladies auto-immunes14. Par conséquent, les nucléases sont devenues des candidats intéressants comme biomarqueurs pour un groupe hétérogène de conditions humaines. En fait, les nucléases ont déjà démontré leur potentiel en tant qu'outils de diagnostic efficaces pour la détection des infections causées par des agents bactériens spécifiques, tels que Staphylococcus aureus ou Escherichia coli15, 16. Dans beaucoup de types de cancer, l'expression de la protéine de domaine de nucléase staphylococcique-contenante 1 (SND1) ribonuclease est indicative du pronostic pauvre17. Dans les patients de cancer pancréatique, les niveaux élevés de sérum de ribonuclease I (RNase I) ont été rapportés18 et ont proposé d'être associés aux phénotypes cancéreux de cellules19. Dans les affections cardiaques ischémiques, telles que l'infarctus du myocarde ou l'angine de poitrine instable, les niveaux de sérum de désoxyribonuclease I (DNase I) se sont avérés être un marqueur diagnostique valide20,21.
On a émis l'hypothèse que le plan global de l'activité nucléase peut être différent dans les états sains et les états de maladie. En fait, des rapports récents ont utilisé des différences dans l'activité nucléase pour distinguer entre les phénotypes sains et cancéreux22 ou pour identifier les infections bactériennes pathogènes d'une manière spécifique à l'espèce15,23. Ces résultats ont ouvert une nouvelle voie pour l'utilisation des nucléases comme biomarqueurs de la maladie. Par conséquent, il est nécessaire de mettre au point une méthode de dépistage complète capable d'identifier systématiquement les différences associées à la maladie dans l'activité nucléase, qui peuvent être d'une importance capitale dans le développement de nouveaux outils de diagnostic.
Dans ce cas, nous introduisons et décrivons une nouvelle approche de dépistage in vitro (figure 1) pour identifier les sondes sensibles et spécifiques capables de discriminer entre l'activité nucléase en bonne santé et malsaine, ou l'activité spécifique à un type de cellule ou de bactéries. Profitant de la modularité des acides nucléiques, nous avons conçu une première bibliothèque de sondes oligonucléotides fluorescentes étanchées composées d'un ensemble complet de différentes séquences et chimies, les deux étant des paramètres importants pour la conception de la bibliothèque. Ces sondes d'oligonucléotide sont flanquées d'un fluorophore (fluorescein amidite, FAM) et d'un quencher (tide quencher 2, TQ2) aux 5' et 3' extrémités respectivement (tableau 1). En utilisant cet air fluorométrique basé sur le transfert d'énergie par résonance fluorescente (FRET) pour mesurer la cinétique de la dégradation enzymatique, nous avons pu identifier les sondes candidates ayant le potentiel de discriminer les modèles différentiels d'activité nucléane associés à des états sains ou malades. Nous avons conçu un processus itératif, dans lequel de nouvelles bibliothèques sont créées sur la base des meilleures sondes candidates, qui permet d'identifier des sondes candidates toujours plus spécifiques dans les étapes de dépistage ultérieures. De plus, cette approche tire parti de la nature catalytique des nucléases pour augmenter la sensibilité. Ceci est réalisé en tirant parti de la nature activatable des sondes de reporter et de la capacité des nucléases à traiter continuellement des molécules de substrat, représentant tous deux des avantages clés par rapport aux anticorps alternatifs ou aux méthodes de criblage à base de petites molécules.
Cette approche offre un outil de dépistage hautement modulaire, flexible et facile à mettre en œuvre pour l'identification de sondes d'acide nucléique spécifiques capables de discriminer entre les états sains et les états pathiques, et une excellente plate-forme pour le développement de nouveaux diagnostics qui peuvent être adaptés pour de futures applications cliniques. En tant que tel, cette approche a été utilisée pour identifier l'activité de nucléane dérivée de Salmonella Typhimurium (ci-dessus appelé Salmonella) pour l'identification spécifique de cette bactérie. Dans le protocole suivant, nous rendons compte d'une méthode pour dépister l'activité bactérienne de nucléase utilisant l'analyse cinétique.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:759px;" width="759">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Black bottom, non-treated 96 well plate</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10000631</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Cytation1</td>
			<td style="width:199px;">BioTek</td>
			<td style="width:128px;">CYT1FAV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Eppendorf tubes</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td style="width:128px;">11926955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Escherichia coli</td>
			<td style="width:199px;">ATCC</td>
			<td style="width:128px;">25922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Microbank cryogenic storage vial containing beads</td>
			<td style="width:199px;">Pro-Lab Diagnostics</td>
			<td style="width:128px;">22-286-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Nucleic acid probes</td>
			<td style="width:199px;">Biomers.net</td>
			<td style="width:128px;">#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Phosphate Buffer Saline containing MgCl2 and CaCl2</td>
			<td style="width:199px;">Gibco&#8482;</td>
			<td style="width:128px;">14040117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Salmonella enterica subs. Enterica</td>
			<td style="width:199px;">ATCC</td>
			<td style="width:128px;">14028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Tris-EDTA</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10647633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Tryptone Soya Agar with defibrinated sheep blood</td>
			<td style="width:199px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10362223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:199px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">22092</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

kinetic screening of nuclease activity using nucleic acid probes

Les nucléases sont une classe d'enzymes qui décomposent les acides nucléiques en catalysant l'hydrolyse des liaisons phosphodiester qui relient les sucres ribose. Les nucléases présentent une variété de rôles physiologiques vitaux dans les organismes procaryotes et eucaryotes, allant du maintien de la stabilité du génome à la protection contre les agents pathogènes. L'activité modifiée de nucléase a été associée à plusieurs conditions pathologiques comprenant des infections bactériennes et le cancer. À cette fin, l'activité de nucléane a montré un grand potentiel d'exploitation comme biomarqueur spécifique. Cependant, une méthode de dépistage robuste et reproductible basée sur cette activité demeure hautement souhaitable.
Ici, nous introduisons une méthode qui permet le criblage pour l'activité de nucléane utilisant des sondes d'acide nucléique comme substrats, avec la portée de différencier entre les conditions pathologiques et saines. Cette méthode offre la possibilité de concevoir de nouvelles bibliothèques de sondes, avec une spécificité croissante, d'une manière itérative. Ainsi, plusieurs séries de criblage sont nécessaires pour affiner la conception des sondes avec des caractéristiques améliorées, en profitant de la disponibilité d'acides nucléiques chimiquement modifiés. Le potentiel considérable de la technologie proposée réside dans sa flexibilité, sa haute reproductibilité et sa polyvalence pour le dépistage de l'activité nucléase associée aux maladies. On s'attend à ce que cette technologie permette le développement d'outils diagnostiques prometteurs avec un grand potentiel dans la clinique.

La figure 1 montre le flux de travail de cette méthodologie, qui est divisée en deux cycles de sélection. Dans la première série de dépistage, nous avons utilisé 5 sondes d'ADN (ADN, ADN Poly A, ADN Poly T, ADN Poly C et ADN Poly G) et aussi 5 sondes d'ARN (ARN, ARN Poly A, ARN Poly U RNA Poly C et RNA Poly G). Les données brutes de cette ronde de dépistage se trouvent dans le tableau supplémentaire 1. Au deuxième tour, les sondes modifiées chimiquement ont été...

Watch this Scientific Journal Video about Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes at JoVE.com

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

L'activité altérée de nucléase a été associée à différentes conditions humaines, sous-jacenteà son potentiel en tant que biomarqueur. La méthodologie modulaire et facile à mettre en œuvre de criblage présentée dans ce document permet la sélection des sondes spécifiques d'acide nucléique pour exploiter l'activité de nucléane comme biomarqueur de la maladie.

Dépistage cinétique de l'activité nucléane à l'aide de sondes d'acide nucléique

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Ce protocole offre une alternative puissante pour le dépistage de l’activité nucléase en tant que biomarqueur de la maladie, avec une méthodologie facile à mettre en œuvre, même pour les chercheurs qui ne sont pas aussi spécialisés dans les sondes d’acide nucléique. Le principal avantage de cette technique est la capacité de sélectionner des sondes d’acide nucléique qui peuvent identifier les activités nucléase connues et inconnues, en profitant de l’interaction dynamique sonde-nucléase. D’autres avantages de cette méthodologie sont sa flexibilité, sa haute reproductibilité et sa facilité d’utilisation.La démonstration sera effectuée par Khadija, étudiante à la maîtrise, et Baris, un postdoc de notre laboratoire. Lors de la conception d’une bibliothèque d’oligonucléotide, inclure au moins un ADN et une séquence aléatoire ARN contenant une combinaison d’adénine, guanine, cytosine et thiamine ou uracil. Pour préparer les sondes oligonucléotides, faites tourner les sondes oligonucléotides lyophilisées et diluez chaque sonde dans le tampon Tris-EDTA à une concentration de 500 picomolaires par microlitre pour prévenir la dégradation des nucléases.Pour la culture bactérienne sur le milieu solide, rouler une seule perle de verre poreuse de stockage cryogénique directement sur un plat de culture contenant TSA complété par du sang de mouton défibrinated pour strier les colonies bactériennes individuelles. Placez ensuite la plaque à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Pour la culture bactérienne dans le milieu liquide, transférer une seule colonie d’une culture moyenne solide à 50 millilitres de BST pour incubation à 37 degrés Celsius pendant 24 heures à 200 rotations par minute.Le lendemain, diluer la culture à un rapport de un à 500 dans le BST frais et incuber la bactérie pendant 24 heures supplémentaires à 37 degrés Celsius et 200 rotations par minute dans un incubateur secouant. Pour mettre en place un test d’activité nucléase, préchauffez d’abord un fluoromètre à 37 degrés Celsius et ajoutez soigneusement 96 microlitres de TSB stérile ou de supernatant provenant d’une culture moyenne liquide salmonella ou E.Coli à un tube de microcentrifugeuse sans nucléase de 1,5 millilitre par sonde. Ajoutez quatre microlitres de solution de travail de sonde à chaque tube et utilisez une pipette pour bien mélanger chaque contenu de tube jusqu’à ce que des solutions homogènes soient réalisées, en prenant soin d’éviter les bulles.Ensuite, chargez soigneusement 95 microlitres de chaque solution près de la paroi des puits individuels d’un fond noir, plaque de puits non traitée 96, en prenant soin d’éviter les bulles. Lorsque toutes les solutions ont été ajoutées, couvrez la plaque et inspectez visuellement le couvercle pour décexer les marques de stylo ou la poussière qui peuvent introduire des artefacts de mesure. Pour configurer le logiciel de mesure de l’activité nucléase, ouvrez un logiciel d’acquisition approprié.Sélectionnez Lire maintenant à partir de la fenêtre Gestionnaire de tâches, et sélectionnez Nouveau pour créer le protocole de mesure cinétique. Cliquez sur Définir la température pour sélectionner 37 degrés Celsius et confirmer et enregistrer les paramètres en cliquant sur OK. Cliquez sur Démarrer Kinetics. Dans la fenêtre contexturée, sélectionnez deux heures dans la boîte d’entrée Run Time et deux minutes dans la boîte d’entrée d’intervalle avant de cliquer sur OK pour confirmer et enregistrer les paramètres.Cliquez sur Lire. Dans la fenêtre contexturée, sélectionnez l’intensité de fluorescence comme méthode de détection, endpoint cinétique comme type de lecture et filtres comme type optique. Ensuite, cliquez sur OK. Dans la fenêtre contextée, sélectionnez Vert dans l’ensemble de filtres et cliquez sur OK. Dans la fenêtre Procédure, sélectionnez Couvercle d’utilisation et cliquez sur Valider.Une fenêtre contextée apparaîtra confirmant que le protocole créé est valide. Dans le menu Protocole, sélectionnez Procédure. Dans la fenêtre Procédure, définissez les puits à mesurer et entrez le nom de l’expérience dans la boîte d’entrée du nom du fichier.Chargez ensuite la plaque dans le lecteur de plaque, en prenant soin que la plaque est dans la bonne orientation et cliquez sur le bouton Lire nouveau pour commencer l’acquisition. Pour l’analyse des données, ouvrez les données dans le logiciel d’analyse approprié et sélectionnez l’un des puits mesurés dans la fenêtre de la plaque. Cliquez sur Sélectionnez Puits et incluez tous les puits mesurés dans la fenêtre Dialogue de sélection des puits avant de cliquer sur OK. Sélectionnez ensuite données dans la plaque une fenêtre pour visualiser les résultats compilés et cliquez sur QuickExport pour exporter les données vers une feuille de calcul.Dans une feuille de calcul, étiquetez les colonnes de données comme appropriées pour chaque échantillon et sonde, et tracez les unités de fluorescence relative par rapport au temps pour que les données génèrent des graphiques cinétiques. Dans cette expérience représentative, après la première série de dépistage, les supernatants de la culture Salmonella ont signalé une nette préférence pour les sondes ARN par rapport aux sondes d’ADN. Basée sur l’identification de l’ARN comme type d’acide nucléique préféré par les nucléases salmonella, une nouvelle bibliothèque à ARN seulement est conçue pour être utilisée dans la deuxième série de dépistage.En revanche, E.Coli dans les contrôles moyens de culture a démontré une capacité très limitée de dégrader les sondes d’ARN. Après une deuxième série de criblages utilisant des nucléotides chimiquement modifiés visant à augmenter la spécificité des sondes d’ARN, la pyrimidine d’ARN 2'O-méthyl et le purine d’ARN 2'O-méthyl pourraient être identifiés sur la base de leurs modifications chimiques comme présentant le comportement cinétique le plus performant par rapport à l’ARN pyrimidine 2'fluoro et ARN purine 2'fluoro respectivement. Ces résultats suggèrent que Salmonella a une activité importante de RNAse avec la préférence différentielle de chimie de substrat qui peut être employée pour sélectionner des sondes capables de reconnaître spécifiquement cette bactérie.Cette procédure permet la sélection de sondes capables d’identifier les activités nucléases associées à des maladies telles que le cancer ou l’infection bactérienne, permettant le développement de nouveaux outils diagnostiques cliniques.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Polyaniline-based Sensor of Nucleic Acids

Un capteur à base de polyaniline d&#39;acides nucléiques

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies ...

Recherche

Biochimie

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Préparation et<em&gt; In Vivo</em&gt; L&#39;utilisation d&#39;une sonde basée sur les activités pour<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine Amidase Acid

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Purification de protéine anaérobie et l’analyse cinétique via la sonde à oxygène pour l’étude de l’Inhibition et l’activité DesB Dioxygenase

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers

Identifier les surproducteurs d'acides aminés à l'aide de marqueurs rares-codon-riches

To satisfy the ever-growing market for amino acids, high-performance production strains are needed. The amino acid overproducers are conventionally ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Expression et purification de nuclease-Free Oxygen Sccatechuate 3,4-Dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

Dépistage des phytoestrogènes à l’aide d’un récepteur d’œstrogènes à base β de Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

Dérivation des cristaux protéiques avec I3C à l’aide du criblage aléatoire de matrice microséeed

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

Estimation de la teneur en lignine de la biomasse végétale à l’aide de l’acide thioglycolique (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Effectuer des mesures FRET à molécule unique précises et précises à l’aide de la smfBox open source

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

Determining the Thermodynamic and Kinetic Association of a DNA Aptamer and Tetracycline Using Isothermal Titration Calorimetry

Détermination de l’association thermodynamique et cinétique d’un aptamère d’ADN et d’une tétracycline à l’aide de la calorimétrie de titrage isotherme

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for ...