Name: kinetic screening of nuclease activity using nucleic acid probes
Uploaded: 2019-11-01T12:30:00
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Die Autoren würdigen Luiza I. Hernandez (Linköping University) für ihre sorgfältige Überarbeitung des Manuskripts und wertvolle Ratschläge. Diese Arbeit wurde von der Knut and Alice Wallenberg Foundation und dem Strategic Research Area in Materials Science on Advanced Functional Materials der Universität Linköping (Faculty Grant SFO-Mat-LiU No. 2009-00971) unterstützt.

1. Oligonukleotid Bibliothek Design und Vorbereitung
<ol><li>Bibliotheksdesign<ol>
<li>Basierend auf den folgenden Kriterien entwerfen Sie eine Bibliothek von abgeschreckten fluoreszierenden Oligonukleotid-Sonden zwischen 8 und 12-mer lang, um sekundäre Strukturbildung zu vermeiden, mit gleicher Länge für alle Sonden.<ol>
<li>Schließen Sie mindestens eine DNA- und eine RNA-Zufallssequenz ein, die eine Kombination aus Adenin (A), Guanin (G), Cytosin (C) und Thymin (T)/Uracil (U) enthält (DNA- und RNA-Sonden...

<ol>
	<li>Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleases:+diversity+of+structure,+function+and+mechanism.">Nucleases: diversity of structure, function and mechanism.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 44 (1), 1-93 (2011).</li><li>Adli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR+tool+kit+for+genome+editing+and+beyond.">The CRISPR tool kit for genome editing and beyond.</a> Nature Communication. 9 (1), 1911 (2018).</li><li>Mason, P. A., Cox, L. 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Veränderungen der Nuklease-Aktivität wurden mit einer Vielzahl von Krankheitsphänotypen in Verbindung gebracht, einschließlich verschiedener Krebsarten und bakterieller Infektionen. Diese Veränderungen werden als Erreger einer Erkrankung14vorgeschlagen, während sie in anderen Fällen die Folge eines schädlichen physiologischen Ereignisses20 oder des Pathogens16,26sind. Es überrascht nicht, dass Versuche, Nuk...

Nukleasen sind eine Klasse von Enzymen, die in der Lage sind, die Phosphodiesterbindungen zu spalten, die die Rückgratstruktur von Nukleinsäuremolekülen bilden. Die große Vielfalt der Nukleasen macht ihre Klassifizierung ziemlich schwierig. Es gibt jedoch einige gängige Kriterien, die zur Beschreibung von Nukleasen verwendet werden, wie substratpräferenzium (Deoxyribonukleinsäure (DNA) oder Ribonukleinsäure (RNA)), Spaltungsstelle (Endonukleasen oder Exonukleasen) oder Metallionenabhängigkeit, unter anderem1. Nukleasen sind hochkonservierte katalytische Enzyme, die sowohl in prokaryotischen als auch in eukaryotischen Organismen eine grundlegendeRolle spielen und als Genbearbeitungswerkzeuge verwendet wurden und weiterhin verwendet werden 2 . Sie sind auch grundlegende Akteure in der DNA-Wartung und -Replikation, helfen, die Genomstabilität zu erhalten und nehmen an Korrekturverfahren teil3. Bei Bakterien wurden beispielsweise Nukleasen als wichtige Virulenzfaktoren identifiziert, die das überleben der Bakterien fördern können, indem sie die Wirksamkeit desImmunsystemsdes Wirts 4,5,6,7 ,8. Bei Säugetieren, Nukleasen wurden vorgeschlagen, in Apoptose9verwickelt werden , mitochondriale Biogenese und Wartung10 und Vermittlung von antibakteriellen und antiviralen angeborenen Immunantworten11. Es überrascht nicht, dass Nuklease-Aktivitätsänderungen, ob Verbesserung oder Fehlen von, in eine Vielzahl von menschlichen Krankheiten verwickelt sind. Diese Krankheiten reichen von einer Vielzahl von Krebsarten12,13 bis zu Herzhypertrophie10 oder Autoimmunerkrankungen14. Daher sind Nukleasen zu interessanten Kandidaten als Biomarker für eine heterogene Gruppe menschlicher Bedingungen geworden. Tatsächlich haben Nukleasen bereits ihr Potenzial als erfolgreiche diagnostische Instrumente zum Nachweis von Infektionen gezeigt, die durch bestimmte bakterielle Wirkstoffe wie Staphylococcus aureus oder Escherichia coli15 verursacht werden. 16. Bei vielen Krebsarten ist die Expression von Staphylokokkennuklease-Domänen-haltigem Protein 1 (SND1) Ribonuklease ein Hinweis auf eine schlechte Prognose17. Bei Patienten mit Bauchspeicheldrüsenkrebs wurden erhöhte Ribonuklease-I-Serumspiegel18 berichtet und vorgeschlagen, mit Krebszellphänotypen in Verbindung gebracht zu werden19. Bei ischämischen Herzerkrankungen, wie Myokardinfarkt oder instabiler Angina pectoris, desoxyribonuklease I (DNase I) Serumspiegel haben sich als ein gültiger diagnostischer Marker20,21.
Es wurde vermutet, dass die globale Blaupause der Nuklease-Aktivität in gesunden und Krankheitszuständen unterschiedlich sein kann. Tatsächlich haben jüngste Berichte Unterschiede in der Nukleaseaktivität verwendet, um zwischen gesunden und krebsernen Phänotypen22 zu unterscheiden oder pathogene bakterielle Infektionen artspezifisch zu identifizieren15,23. Diese Erkenntnisse haben einen neuen Weg für den Einsatz von Nukleasen als Biomarker von Krankheiten eröffnet. Daher besteht die Notwendigkeit für die Entwicklung einer umfassenden Screening-Methode, die in der Lage ist, krankheitsassoziierte Unterschiede in der Nukleaseaktivität systematisch zu identifizieren, die bei der Entwicklung neuer diagnostischer Instrumente von entscheidender Bedeutung sein können.
Hierin führen wir einen neuen In-vitro-Screening-Ansatz ein (Abbildung 1), um empfindliche und spezifische Sonden zu identifizieren, die in der Lage sind, zwischen Nukleaseaktivität bei gesunder und ungesundem Oder einer spezifischen Aktivität einer Zell- oder Bakterienart zu unterscheiden. Unter Ausnutzung der Modularität von Nukleinsäuren haben wir eine erste Bibliothek von abgeschreckten fluoreszierenden Oligonukleotid-Sonden entwickelt, die aus einem umfassenden Satz verschiedener Sequenzen und Chemikalien bestehen, die beide wichtige Parameter für die Bibliotheksgestaltung sind. Diese Oligonukleotid-Sonden werden von einem Fluorophor (Fluorescein-Amidit, FAM) und einem Quencher (Tide Quencher 2, TQ2) an den 5' bzw. 3' Enden(Tabelle 1) flankiert. Durch die Verwendung dieses fluoreszierenden Resonanzenergietransfers (FRET) basierenden fluormetrischen Assays zur Messung der Kinetik des enzymatischen Abbaus konnten wir Kandidatensonden mit dem Potenzial identifizieren, differentiale Muster der Nukleaseaktivität zu unterscheiden. mit gesunden oder Krankheitszuständen verbunden sind. Wir haben einen iterativen Prozess entwickelt, bei dem neue Bibliotheken auf der Grundlage der besten Kandidatensonden erstellt werden, der es ermöglicht, immer spezifischere Kandidatensonden in nachfolgenden Screening-Schritten zu identifizieren. Darüber hinaus nutzt dieser Ansatz die katalytische Natur von Nukleasen, um die Empfindlichkeit zu erhöhen. Dies wird erreicht, indem die aktivierbare Natur der Reportersonden und die Fähigkeit von Nukleasen genutzt werden, Substratmoleküle kontinuierlich zu verarbeiten, die beide wichtige Vorteile gegenüber alternativen Antikörpern oder kleinen molekülbasierten Screening-Methoden darstellen.
Dieser Ansatz bietet ein hochmodulares, flexibles und einfach zu implementierendes Screening-Tool zur Identifizierung spezifischer Nukleinsäuresonden, die in der Lage sind, gesunde und krankheitsfördernde Erkrankungen zu unterscheiden, und eine hervorragende Plattform für die Entwicklung neuer diagnostische Nagenzwerkzeuge, die für zukünftige klinische Anwendungen angepasst werden können. Als solcher wurde dieser Ansatz verwendet, um die Nuklease-Aktivität von Salmonella Typhimurium (hier als Salmonellabezeichnet ) für die spezifische Identifizierung dieser Bakterien abgeleitet zu identifizieren. Im folgenden Protokoll berichten wir über eine Methode zum Abschirmen auf bakterielle Nukleaseaktivität mittels kinetischer Analyse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:759px;" width="759">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Black bottom, non-treated 96 well plate</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10000631</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Cytation1</td>
			<td style="width:199px;">BioTek</td>
			<td style="width:128px;">CYT1FAV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Eppendorf tubes</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td style="width:128px;">11926955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Escherichia coli</td>
			<td style="width:199px;">ATCC</td>
			<td style="width:128px;">25922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Microbank cryogenic storage vial containing beads</td>
			<td style="width:199px;">Pro-Lab Diagnostics</td>
			<td style="width:128px;">22-286-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Nucleic acid probes</td>
			<td style="width:199px;">Biomers.net</td>
			<td style="width:128px;">#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Phosphate Buffer Saline containing MgCl2 and CaCl2</td>
			<td style="width:199px;">Gibco&#8482;</td>
			<td style="width:128px;">14040117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Salmonella enterica subs. Enterica</td>
			<td style="width:199px;">ATCC</td>
			<td style="width:128px;">14028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Tris-EDTA</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10647633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Tryptone Soya Agar with defibrinated sheep blood</td>
			<td style="width:199px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10362223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:199px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">22092</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

kinetic screening of nuclease activity using nucleic acid probes

Nukleasen sind eine Klasse von Enzymen, die Nukleinsäuren abbauen, indem sie die Hydrolyse der Phosphodiesterbindungen katalysieren, die die Ribosezucker verbinden. Nukleasen weisen eine Vielzahl lebenswichtiger physiologischer Rollen in prokaryotischen und eukaryotischen Organismen auf, die von der Aufrechterhaltung der Genomstabilität bis hin zum Schutz vor Krankheitserregern reichen. Veränderte Nuklease-Aktivität wurde mit mehreren pathologischen Bedingungen verbunden, einschließlich bakterieller Infektionen und Krebs. Zu diesem Zweck hat die Nukleaseaktivität ein großes Potenzial gezeigt, als spezifischer Biomarker genutzt zu werden. Ein robustes und reproduzierbares Screening-Verfahren auf der Grundlage dieser Aktivität ist jedoch nach wie vor sehr wünschenswert.
Hierin führen wir ein Verfahren ein, das das Screening auf Nukleaseaktivität mit Nukleinsäuresonden als Substraten ermöglicht, mit dem Umfang der Unterscheidung zwischen pathologischen und gesunden Bedingungen. Diese Methode bietet die Möglichkeit, neue Sondenbibliotheken mit zunehmender Spezifität iterativ zu gestalten. Daher sind mehrere Screening-Runden notwendig, um das Design der Sonden mit verbesserten Eigenschaften zu verfeinern und dabei die Verfügbarkeit chemisch modifizierter Nukleinsäuren zu nutzen. Das beträchtliche Potenzial der vorgeschlagenen Technologie liegt in ihrer Flexibilität, hohen Reproduzierbarkeit und Vielseitigkeit für das Screening von Nukleaseaktivitäten im Zusammenhang mit Krankheitszuständen. Es wird erwartet, dass diese Technologie die Entwicklung vielversprechender diagnostischer Werkzeuge mit großem Potenzial in der Klinik ermöglichen wird.

Abbildung 1 zeigt den Arbeitsablauf dieser Methode, die in zwei Screening-Runden unterteilt ist. In der ersten Runde des Screenings verwendeten wir 5 DNA-Sonden (DNA, DNA Poly A, DNA Poly T, DNA Poly C und DNA Poly G) sowie 5 RNA-Sonden (RNA, RNA Poly A, RNA Poly U RNA Poly C und RNA Poly G). Die Rohdaten dieser Screening-Runde sind in der Ergänzenden Tabelle 1 zu finden. In der zweiten Runde wurden chemisch modifizierte Sonden synthetisiert, indem die RNA-Sequenz durch che...

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Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Veränderte Nuklease-Aktivität wurde mit verschiedenen menschlichen Bedingungen verbunden, die ihr Potenzial als Biomarker zugrunde liegen. Die modulare und einfach zu implementierende Screening-Methodik, die in diesem Papier vorgestellt wird, ermöglicht die Auswahl spezifischer Nukleinsäuresonden zur Nutzung der Nukleaseaktivität als Biomarker von Krankheiten.

Kinetisches Screening der Nuklease-Aktivität mit Nukleinsäuresonden

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Dieses Protokoll bietet eine leistungsstarke Alternative zum Screening der Nukleaseaktivität als Biomarker von Krankheiten, mit einer einfach umzusetzenden Methodik auch für Forscher, die sich nicht so sehr auf Nukleinsäuresonden spezialisiert haben. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Fähigkeit, Nukleinsäuresonden auszuwählen, die sowohl bekannte als auch unbekannte Nukleaseaktivitäten identifizieren können, wobei die dynamische Interaktion zwischen Sonde und Nuklease genutzt wird. Weitere Vorteile dieser Methode sind flexibilitätsmöglich, hohe Reproduzierbarkeit und Benutzerfreundlichkeit.Die Demonstration wird von Khadija, einem Master-Studenten, und Baris, einem Postdoc aus unserem Labor, durchgeführt. Bei der Entwicklung einer Oligonukleotid-Bibliothek, enthalten Mindestens eine DNA und eine RNA Zufallssequenz enthält eine Kombination von Adenin, Guanin, Cytosin und Thiamin oder Uracil. Zur Vorbereitung der Oligonukleotid-Sonden die lyophilisierten Oligonukleotid-Sonden herunterdrehen und jede Sonde im Tris-EDTA-Puffer mit einer Konzentration von 500 Picomolar pro Mikroliter verdünnen, um einen Nukleaseabbau zu verhindern.Für die Bakterienkultur auf festem Medium, rollen Sie eine einzelne poröse Glasperle aus kryogener Lagerung direkt auf eine Kulturschale mit TSA, ergänzt mit abgezäuntem Schafblut, um einzelne Bakterienkolonien auszustreichen. Dann legen Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden. Für bakterienkultur im flüssigen Medium, übertragen Sie eine einzelne Kolonie von einer festen mittleren Kultur auf 50 Milliliter TSB für die Inkubation bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden bei 200 Umdrehungen pro Minute.Am nächsten Tag verdünnen Sie die Kultur im Verhältnis eins bis 500 in frischem TSB und bebrüten die Bakterien zusätzlich 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 200 Umdrehungen pro Minute in einem Schüttelinkubator. Um einen Nuklease-Aktivitätstest einzurichten, sollte zunächst ein Fluorometer auf 37 Grad Celsius vorwärmen und 96 Mikroliter steriles TSB oder Überstand aus einer Salmonellen- oder E.Coli-Flüssigkeitsmediumkultur vorsichtig zu einer 1,5-Milliliter-Nuklease-freien Mikrozentrifugenröhre pro Sonde hinzufügen. Fügen Sie vier Mikroliter Sondenarbeitslösung zu jedem Rohr hinzu und verwenden Sie eine Pipette, um jeden Rohrinhalt gründlich zu mischen, bis homogene Lösungen erreicht sind, wobei darauf geachtet wird, Blasen zu vermeiden.Als nächstes, sorgfältig laden 95 Mikroliter jeder Lösung in der Nähe der Wand der einzelnen Brunnen einer schwarzen Boden, unbehandelt 96 Brunnenplatte, sorgfältig darauf achten, Blasen zu vermeiden. Wenn alle Lösungen hinzugefügt wurden, bedecken Sie die Platte und überprüfen Sie den Deckel visuell auf Stiftmarkierungen oder Staub, der Messartefakte einführen kann. Um die Software für die Nukleaseaktivitätsmessung einzurichten, öffnen Sie ein geeignetes Erfassungssoftwareprogramm.Wählen Sie Jetzt lesen aus dem Task-Manager-Fenster aus, und wählen Sie Neu aus, um das kinetische Messprotokoll zu erstellen. Klicken Sie auf Temperatur festlegen, um 37 Grad Celsius auszuwählen und die Einstellungen zu bestätigen und zu speichern, indem Sie auf OK klicken. Klicken Sie auf Kinetik starten. Wählen Sie im Popupfenster zwei Stunden im Eingabefeld Laufzeit und zwei Minuten im Intervalleingabefeld aus, bevor Sie auf OK klicken, um die Einstellungen zu bestätigen und zu speichern.Klicken Sie auf Lesen. Wählen Sie im Popupfenster Fluoreszenzintensität als Erkennungsmethode, Endpunktkinkinetik als Lesetyp und Filter als Optiktyp aus. Klicken Sie dann auf OK. Wählen Sie im Popup-Fenster aus dem Filtersatz Grün aus, und klicken Sie auf OK. Wählen Sie im Fenster Prozedur die Option Deckel verwenden aus, und klicken Sie auf Überprüfen.Es wird ein Popupfenster angezeigt, das bestätigt, dass das erstellte Protokoll gültig ist. Wählen Sie im Menü Protokoll prozeduraz. Definieren Sie im Fenster Prozedur die zu messenden Bohrungen, und geben Sie den Namen des Experiments in das Eingabefeld Dateiname ein.Dann laden Sie die Platte in den Plattenleser, wobei Sie darauf achten, dass sich die Platte in der richtigen Ausrichtung befindet, und klicken Sie auf die Schaltfläche Neu lesen, um mit der Erfassung zu beginnen. Öffnen Sie für die Datenanalyse die Daten in der entsprechenden Analysesoftware, und wählen Sie eine der gemessenen Bohrungen in einem Fenster auf der Platte aus. Klicken Sie auf Brunnen auswählen und schließen Sie alle gemessenen Brunnen in das Fenster Brunnenauswahldialog ein, bevor Sie auf OK klicken. Wählen Sie dann Daten in einem Fenster auf der Platte aus, um die tabellarischen Ergebnisse zu visualisieren, und klicken Sie auf QuickExport, um die Daten in eine Kalkulationstabelle zu exportieren.Beschriften Sie in einer Kalkulationstabelle die Datenspalten als für jede Probe und Sonde geeignet, und zeichnen Sie die relativen Fluoreszenzeinheiten im Vergleich zur Zeit für die Daten zum Generieren kinetischer Diagramme. In diesem repräsentativen Experiment berichteten die Salmonella-Kulturüberfälle nach der ersten Screening-Runde von einer klaren Präferenz für RNA-Sonden gegenüber den DNA-Sonden. Basierend auf der Identifizierung von RNA als bevorzugtem Nukleinsäuretyp durch Salmonella-Nukleasen soll eine neue RNA-Bibliothek in der zweiten Screening-Runde verwendet werden.Im Gegensatz dazu zeigten E.Coli in Kulturmedium-Kontrollen eine sehr begrenzte Fähigkeit, RNA-Sonden zu degradieren. Nach einer zweiten Screening-Runde mit chemisch modifizierten Nukleotiden zur Erhöhung der Spezifität der RNA-Sonden konnten RNA pyrimidin 2'O-Methyl und RNA Purin 2'O-methyl anhand ihrer chemischen Modifikationen als das leistungsstärkste kinetische Verhalten im Vergleich zu den RNA Pyrimidin 2'fluoro bzw. RNA Purin 2'fluoro identifiziert werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Salmonellen eine wichtige RNAse-Aktivität mit Differentialsubstratchemie bevorzugt haben, die für die Auswahl von Sonden verwendet werden kann, die diese Bakterien spezifisch erkennen können.Dieses Verfahren ermöglicht die Auswahl von Sonden, die nuklease-Aktivitäten im Zusammenhang mit Krankheitszuständen wie Krebs oder bakteriellen Infektionen identifizieren können, was die Entwicklung neuer klinischer Diagnoseinstrumente ermöglicht.

kinetic-screening-of-nuclease-activity-using-nucleic-acid-probes

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Polyaniline-based Sensor of Nucleic Acids

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies rely on enzymatic modification that can introduce bias and artifacts. A critical element of next generation detection platforms will be direct molecular sensing, thereby avoiding a need for amplification or labels. Advanced nanomaterials may provide the suitable chemical modalities to realize label-free sensors. Conjugated polymers are ideal for biological sensing, possessing properties compatible with biomolecules and exhibit high sensitivity to localized environmental changes. In this article, a method is presented for detecting nucleic acids using the electroconductive polymer polyaniline. Simple DNA "probe" oligonucleotides complementary to target nucleic acids are attached electrostatically to the polymer, creating a sensor system that can differentiate single nucleotide differences in target molecules. Outside the specific and unbiased nature of this technology, it is highly cost effective.

Nucleic acids are common analytes for assessing biological systems; however, bias from enzymatic manipulation can cause concern. Here a method is described for label-free detection of nucleic acids using polyaniline. This sensitive, cost-effective sensor technology can distinguish single nucleotide differences between molecules.

Ein Polyanilin basierenden Sensor von Nucleic Acids

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies ...

Forschung

Biochemie

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical probe that targets the enzyme&#39;s active sites. A reporter tag introduced into the probe allows for the detection of the labeled enzyme by in-gel fluorescence scanning, protein blot, fluorescence microscopy, or liquid chromatography-mass spectrometry. Here, we describe the preparation and use of the compound ARN14686, a click chemistry activity-based probe (CC-ABP) that selectively recognizes the enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA). NAAA is a cysteine hydrolase that promotes inflammation by deactivating endogenous peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)-alpha agonists such as palmitoylethanolamide (PEA) and oleoylethanolamide (OEA). NAAA is synthesized as an inactive full-length proenzyme, which is activated by autoproteolysis in the acidic pH of the lysosome. Localization studies have shown that NAAA is predominantly expressed in macrophages and other monocyte-derived cells, as well as in B-lymphocytes. We provide examples of how ARN14686 can be used to detect and quantify active NAAA ex vivo in rodent tissues by protein blot and fluorescence microscopy.

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Here, we describe the preparation and use of an activity-based probe (ARN14686, undec-10-ynyl-N-[(3S)-2-oxoazetidin-3-yl]carbamate) that allows for the detection and quantification of the active form of the proinflammatory enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA), both in vitro and ex vivo.

Vorbereitung und<em&gt; In Vivo</em&gt; Die Verwendung eines aktivitätsbasierte Sonde für<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine Säure Amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic purification methods. This manuscript illustrates the technical details involved in the anaerobic purification process, including the preparation of buffers and reagents, the methods for column chromatography in a glove box, and the desalting of the protein prior to kinetics. Also described are the methods for preparing and using an oxygen electrode to perform kinetic characterization of an oxygen-utilizing enzyme. These methods are illustrated using the dioxygenase enzyme DesB, a gallate dioxygenase from the bacterium Sphingobium sp. strain SYK-6.

Here we present a protocol for anaerobic protein purification, anaerobic protein concentration, and subsequent kinetic characterization using an oxygen electrode system. The method is illustrated using the enzyme DesB, a dioxygenase enzyme which is more stable and active when purified and stored in an anaerobic environment.

Anaerobe Proteinreinigung und kinetische Analyse über Sauerstoff-Elektrode für das Studium DesB Dioxygenase Aktivität und Hemmung

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, fluorophores are prone to loss of signal via photobleaching by dissolved oxygen (O2). To prevent photobleaching and extend the fluorophore lifetime, oxygen scavenging systems (OSS) are employed to reduce O2. Commercially available OSS may be contaminated by nucleases that damage or degrade nucleic acids, confounding interpretation of experimental results. Here we detail a protocol for the expression and purification of highly active Pseudomonas putida protocatechuate-3,4-dioxygenase (PCD) with no detectable nuclease contamination. PCD can efficiently remove reactive O2 species by conversion of the substrate protocatechuic acid (PCA) to 3-carboxy-cis,cis-muconic acid. This method can be used in any aqueous system where O2 plays a detrimental role in data acquisition. This method is effective in producing highly active, nuclease free PCD in comparison with commercially available PCD.

Protocatechuate 3,4-dioxygenase (PCD) can enzymatically remove free diatomic oxygen from an aqueous system using its substrate protocatechuic acid (PCA). This protocol describes the expression, purification, and activity analysis of this oxygen scavenging enzyme.

Expression und Reinigung von Nuklease-freier Sauerstofffänger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls and is an aromatic heteropolymer primarily composed of three monolignols with significant industrial importance. Lignin plays an important role in plant growth and development, protects&#160;from biotic and abiotic stresses, and in the quality of animal fodder, the wood, and industrial lignin products. Accurate estimation of lignin content is essential for both fundamental understanding of the lignin biosynthesis and industrial applications of biomass. The thioglycolic acid (TGA) method is a highly reliable method of estimating the total lignin content in the plant biomass. This method estimates the lignin content by forming thioethers with the benzyl alcohol groups of lignin, which are soluble in alkaline conditions and insoluble in acidic conditions. The total lignin content is estimated using a standard curve generated from commercial bamboo lignin.

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

Here, we present a modified TGA method for estimation of lignin content in herbaceous plant biomass. This method estimates the lignin content by forming specific thioether bonds with lignin and presents an advantage over the Klason method, as it requires a relatively small sample for lignin content estimation.

Abschätzung des Ligningehalts von pflanzlicher Biomasse mit Thioglykolsäure (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes measurements on freely diffusing biomolecules more accessible. This overview includes a step-by-step protocol for using this instrument to make measurements of precise FRET efficiencies in duplex DNA samples, including details of the sample preparation, instrument setup and alignment, data acquisition, and complete analysis routines. The presented approach, which includes how to determine all the correction factors required for accurate FRET-derived distance measurements, builds on a large body of recent collaborative work across the FRET Community, which aims to establish standard protocols and analysis approaches. This protocol, which is easily adaptable to a range of biomolecular systems, adds to the growing efforts in democratising smFRET for the wider scientific community.

This article provides step-by-step instructions for making fully-corrected accurate FRET measurements on individual, freely diffusing biomolecules using the open-source, inexpensive smfBox, from switch on, through alignment and focusing, to data collection and analysis.

Präzise und genaue Einzelmolekül-FRET-Messungen mit der Open-Source-smfBox

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

Determining the Thermodynamic and Kinetic Association of a DNA Aptamer and Tetracycline Using Isothermal Titration Calorimetry

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for application. Due to the drastic differences between the aptamer and small molecules, scientists need to put much effort into characterizing their binding properties. Isothermal Titration Calorimetry (ITC) is a powerful approach for this purpose. ITC goes beyond determining disassociation constants (Kd) and can provide the enthalpy changes and binding stoichiometry of the interaction between two molecules in the solution phase. This approach conducts continuous titration using label-free molecules and records released heat over time upon the binding events produced by each titration, so the process can sensitively measure the binding between macromolecules and their small targets. Herein, the article introduces a step-by-step procedure of the ITC measurement of a selected aptamer with a small target, tetracycline. This example proves the versatility of the technique and its potential for other applications.

The present protocol describes the use of Isothermal Titration Calorimetry (ITC) to analyze the association and dissociation kinetics of the binding between a DNA aptamer and tetracycline, including sample preparation, running standards and samples, and interpreting the resulting data.

Bestimmung der thermodynamischen und kinetischen Assoziation eines DNA-Aptamers und Tetracyclins mittels isothermer Titrationskalorimetrie

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for ...

Identifizierung von G-Quadruplexen in einer DNA-Vorlage mittels chemischer Kartierung

In Vitro Chemical Mapping of G-Quadruplex DNA Structures by Bis-3-Chloropiperidines

G-quadruplexes (G4s) are biologically relevant, non-canonical DNA structures that play an important role in gene expression and diseases, representing significant therapeutic targets. Accessible methods are required for the in vitro characterization of DNA within potential G-quadruplex-forming sequences (PQSs). B-CePs are a class of alkylating agents that have proven to be useful chemical probes for investigation of the higher-order structure of nucleic acids. This paper describes a new chemical mapping assay exploiting the specific reactivity of B-CePs with the N7 of guanines, followed by direct strand cleavage at the alkylated Gs. 
Namely, to distinguish G4 folds from unfolded DNA forms, we use B-CeP 1 to probe the thrombin-binding aptamer (TBA), a 15-mer DNA able to assume the G4 arrangement. Reaction of B-CeP-responding guanines with B-CeP 1 yields products that can be resolved by high-resolution polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) at a single-nucleotide level by locating individual alkylation adducts and DNA strand cleavage at the alkylated guanines. Mapping using B-CePs is a simple and powerful tool for the in vitro characterization of G-quadruplex-forming DNA sequences, enabling the precise location of guanines involved in the formation of G-tetrads.

Autor im Rampenlicht: Charakterisierung von DNA-G-Quadruplex durch Bis-3-Chloropiperidin-basiertes chemisches Mapping 

Bis-3-chloropiperidines (B-CePs) are useful chemical probes to identify and characterize G-quadruplex structures in DNA templates in vitro. This protocol details the procedure to perform probing reactions with B-CePs and to resolve reaction products by high-resolution polyacrylamide gel electrophoresis.

In vitro Chemische Kartierung von G-Quadruplex-DNA-Strukturen durch Bis-3-Chlorpiperidine

G-quadruplexes (G4s) are biologically relevant, non-canonical DNA structures that play an important role in gene expression and diseases, representing ...